Name: 人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶC57BL/6マウスにおける人工内耳植込み手術と電気的誘発脳幹応答記録法。急性難聴誘導と聴覚機能評価の標準化されたプロトコルを習得し、感覚神経性難聴治療技術の理解を深める。

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著者は外科的アドバイスを動物刺激プラットフォームやアドバイスをバイオニクス研究所、メルボルン、オーストラリアからの刺激パラダイムとジェームス b. ファロンおよびアンドリュー ・ k ・ ワイズに提供するピエール ・ スタール, Oticon 医療, ニース, フランスを感謝したいです。.この作品は、スイスの全米科学財団 (ERC 移転交付金 T.R.B. に) からの助成金によって支えられました。

すべてのプロシージャは、スイス ・ バーゼル大学、動物のケアとガイドラインに従って行われました。彼らはバーゼル、スイスのカントンの獣医のオフィスでライセンスを取得しました。
注:C57bl/6 アダルト マウス、8-12 週間 (重量 20-30 g)、高齢者は、この研究で使用されました。 左の耳は、実験の耳として使用されます。右耳内動物コントロールとして機能し、外科的変更はないです。
1. 術前の手順
<ol><li>
ケタミン ・ キシラジン (80 mg/kg ケタミン、16 mg/kg キシラジン、i. p.、10 μ L/g の体重で注入されたボリューム) の腹腔 (i. p.) 注入手術の前に動物の 30 分を anaesthetize します。
	<ol>
<li>肯定的なペダルと眼瞼の (つま先ピンチ) 反射と低用量ケタミン (45 mg/kg、10 μ L/g の体重で注入された i. p.) ので、ひげの動きによって判断されるように、必要に応じて麻酔を補足します。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。 注: 一般に、動物必要があります注入この政権でエージェントと線量 45-60 分毎。注入電極周り閉鎖する初期の切開から平均時間は、通常 1 〜 1.5 時間です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>通常の呼吸率とつま先ピンチ反射の欠如によって特徴づけられる動物の完全鎮静をチェックします。このレベルの麻酔を維持します。</li>
	<li>閉ループの加熱パッドで 36.6 ° c 動物の体の温度を維持します。角膜の脱水症状を避けるために眼軟膏を適用します。これはまた記録にノイズを加えることができる動物の瞬目反射を抑制します。</li>
	<li>皮下注射 (皮下) ブピバカイン/リドカインで局所麻酔薬を管理 (0.1 mg/mL ブピバカインと 0.4 mg/mL リドカイン、0.1 mL を皮下投与) 任意の外科的不快感を最小限に抑える目的切開線に沿って。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。</li>
	<li>ムスカリン拮抗薬アトロピンを管理 (アミノ atropinesulfate、0.1 mg/mL、20 μ L 投与 sc は、PBS に溶解) 首の粘液の分泌を減らすために、呼吸を容易にします。制度のガイドラインあたりエージェントや線量の政権を置き換えることができます。</li>
</ol>2. 事前耳をつんざく音聴性脳幹反応 (自動)
注:として聞く耳をつんざくよう前後の状態の測定に使用します。左の耳と防音シールド電気ブースで、テストが実行されます。テストし、右利きの人の左耳を後でインプラントをお勧めします。マウスにおける ABR の詳細については、13,14で見つけることができます。タッカー ・ デイヴィス技術 (TDT) ハードウェアとソフトウェア (BioSig)、ABR を記録する使用が、他のシステムを使用することができます。
<ol><li>同側 (左) 耳から ABR の応答を分離する音響泡と反対側 (右) 耳をブロックします。1 mL 注射器、泡を置くし、泡で全体の耳をカバーするマウスの右耳に挿入 (0.1 – 0.2 mL 泡の)。確認注射器シール密接に耳に外耳道に泡を取得するようにします。</li>
	<li>左の耳から 10 cm スピーカーを配置します。 注:このセットアップのためのスピーカーは、refefence15で述べるように PCB のマイクを使って校正されました。</li>
	<li>70% エタノール溶液による ABR の電極をきれいに。皮膚の下に電極を配置: アクティブ (Ch1) 頂点に同側耳の耳介の下 (-) を参照し、後ろ足 (図 1) の地します。</li>
	<li>頭の段階とプリアンプを光ファイバー ポート経由で聴覚のプロセッサに接続します。</li>
	<li>
アクティブのインピー ダンスと参照電極を確認してください。
	<ol>
<li>インピー ダンスが 3 ω 以上の場合は、それらを再配列し、再測定を取りなさい。電極が同じインピー ダンスをしたら、最高の録音が得られます。防音ブースを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリック刺激を提示し、複雑な聴覚プロセッサとソフトウェアの無料のフィールド条件で ABR を記録します。ソフトウェアでクリックして刺激の標準化: 0.1 ms シングル チャネルの単相性クリック 21 Hz で表示されます10 dB ステップ; 10 dB SPL に 90 dB SPL のレベル低下をクリックします。10 ms のウィンドウを記録します。各 dB レベルで 512 応答の合計の平均です。</li>
	<li>カスタムメイドの Matlab スクリプトを使用して録音のノイズを低減する 2,000 Hz のローパス フィルターとオフライン 300 Hz ハイパス フィルターを適用します。</li>
	<li>認識可能な ABR 波応答 (図 2図 3) で最下位の dB レベルとして ABR 閾値を決定します。</li>
</ol>3. 手術
注:使用される典型的な器械には、ハサミ、メス、直線または曲線のヒント、組織リトラクター ツールといくつかの吸引ウェッジ、吸収紙ポイント金属鉗子のペアが含まれます。左の耳は手術します。
<ol><li>右側にマウスを置きます。頚椎の過度のねじり応力を避けるため。気道を開いたままに体をまっすぐにすることを確認します。</li>
	<li>ハサミで左耳の後ろに毛皮をカット (または、シェーバーで剃る) 肌を露出します。70% エタノール溶液と betadine (ポビドン ・ ヨード) 皮膚を消毒します。</li>
	<li>顕微鏡倍率 (16 x)、[1-1.5 cm 後耳介切開メスとを確認します。</li>
	<li>高い顕微鏡倍率 (25 x) に切り替えます。</li>
	<li>鉗子で皮下の脂肪層の厚さが可変することができますを通じて鈍的切離を実行します。 注:切り裂く、外頸静脈がこの地域を通過する場合は注意してください。この構造体への損傷は、過度の出血を引き起こす可能性が。</li>
	<li>鼓室胞骨膜を明らかにする胸鎖乳突筋を撤回します。キー解剖学的ランドマークとして顔面神経を聴覚ブラの識別を支援するために使用します。顔面神経は、胸鎖乳突筋の後方/背側のエッジの周りをラップし、吻方に向かって耳介外耳道に沿って実行されます。そっとブラ (図 4) へのアクセスを容易にするため切開で自己保持のリトラクター ツールを置きます。</li>
	<li>ブラと乳様突起の間の尾根の明確に可視化できるようにブラのメディオ背側領域を覆う組織を削除します。</li>
	<li>そっとブラをピアスと穴を開けて (bullostomy) (骨がこちら側に薄く) リッジの後上側に 30 G の針を回転させます。また、歯科用の手術用ドリルを使用します。 注:好ましい場合に、さらに高い顕微鏡倍率 (40 倍) でしてこの手順と次の手順を行うことができます。また、必要に応じて顕微鏡の位置を変更します。中間耳領域の手術のビューを最大化することが重要です。</li>
	<li>
細かい先端の鉗子を使用して中耳腔を公開する小さな骨の部分をつまんで、bullostomy を広げます。丸い窓のニッチが骨を覆うまでは、背側突起に向かって bullostomy を拡張します。アブミ骨動脈、内頚動脈の枝は、丸い窓のニッチに腹側を実行されます。
	<ol>
<li>致命的になるかもしれない過度の出血、血管を損傷しないように注意します。小出血は、内耳腔 spongostan の小片を押すことで停止できます。</li>
		<li>アブミ骨、楕円形の窓に接続して中耳の骨を視覚化する前方方向に bullostomy を拡張します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>楕円形の窓を公開する鉗子であぶみ骨を削除します。</li>
</ol>4 耳毒性のエージェントのラウンドのウィンドウ アプリケーション
<ol><li>優しく鈍化 30 G 針を使用して円形のウィンドウと楕円形の窓の膜を穿孔します。その外リンパが実行されるを確認します。</li>
	<li>ゆっくりと楕円形の窓によって PBS (pH 7.4 に調整) に溶解した 0.05% 重量/体積ネオマイシンを灌流します。液体を丸い窓からフラッシュする必要があります。丸い窓に同じ手順を繰り返します。灌流に使用する針とウィンドウの骨構造を損傷しないように注意します。</li>
	<li>円形のウィンドウと楕円形の窓のニッチ内のネオマイシンに浸した spongostan の小片 (1 mm2) を配置します。</li>
	<li>リトラクター ツールを削除、切開を閉じるし、30 分を待ちます。</li>
</ol>5. 後つんざくよう音響 ABR
<ol><li>(手順 2.2 2.8) 耳をつんざく前とに、同様の方法で自動を記録 (図 2 b図 3)。</li>
</ol>6. CI 電極配列の挿入
注:Intracochlear 電極は、プラチナ/異色症パリレン絶縁ワイヤ シールド シリコン チューブ (図 5) と 4 つのプラチナ バンド (Ø0.2 mm) で構成されます。
<ol><li>ブラに再度アクセスする切開にリトラクター ツールを配置します。</li>
	<li>丸窓 (スカラー座索) の深さで 4回プラチナ リングは丸い窓のすぐ内側のどこに電極配列を挿入します。これは16〜 30 kHz で intracochlear 位置に対応する、〜 2 mm の挿入深さを与えます。</li>
	<li>ブラの中のリード線をコイル、ブラの上の組織にワイヤーを接着します。実験全体の場所に配列を維持するのに役立ちます、ワイヤを巻き付けます。</li>
	<li>慎重に、リトラクターを削除し、組織接着剤で挿入を閉じます。</li>
	<li>どこの間の線に垂直な首の小切開 (0.5 mm) をするアクティブな参照 ABR 電極、組織シザーを使用します。皮下ポケット内プラチナ地面と球を置き、組織接着剤 (図 6) で小切開を閉じる。</li>
	<li>電極アレイ基板を動物の刺激プラットフォームに接続します。</li>
</ol>7. 電気聴性脳幹反応 (チャンネル接触型マイクロ)
注:動物の刺激プラットフォーム (ASP) は、電極アレイの電気刺激に使用されます。他の電流源とソフトウェアのシステムを使用できます。
<ol><li>ABR として前に電極 (ステップ 2.3 〜 2.5) (図 6) を配置します。</li>
	<li>ASP ソフトウェアを開き、電気パルス刺激パラダイムを定義します。50 μ s/相電荷平衡二相パルスを使用し、中間期の 10 μ s ギャップ 23.3 パルス/秒 (pps) で発表されました。電気刺激は、モノポーラ電極構成では現在のレベルを増加すると配信されます。400 応答の合計を平均して、それぞれの現在のレベルで。</li>
	<li>電気パルスを提示し、TDT パッチアンプ用アダプターを介して継続的に誘発チャンネル接触型マイクロ応答、前置増幅器および聴覚のプロセッサを記録します。</li>
	<li>プロットし、カスタムメイドの matlab スクリプト (図 7) を介してチャンネル接触型マイクロ データを分析します。スクリプトと録音の例は施行で提供されます。</li>
</ol>8. 実験の終わり
<ol><li>実験の終わりには、制度のガイドラインによると動物を安楽死させます。</li>
	<li>慎重に切開部を開き、インプラントを削除します。</li>
	<li>ティッシュの残骸を削除する 10 分間蒸留水で電極アレイをウルトラ超音波します。 注:インプラント電極が正常で、正しく行う場合に複数回再利用できます。これを確認するには、配列が乾燥しているマルチメータと電極のインピー ダンスを測定します。</li>
	<li>乾燥した場所で電極の配列を格納します。</li>
</ol>

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</ol>

ない競合する金銭的な利益。著者が明らかに何もありません。

本稿では、急性耳をつんざくよう、CI 刺激聴性脳幹反応の機能評価と同様に、マウスで人工内耳の手術のアプローチについて説明します。マウス蝸牛は小さいと挑戦的な手術、CI マウス モデルが可能であると、聴覚研究の貴重なツールとして提供しています。
マウスの中耳のアブミ骨動脈があります。動脈の後方内側ブラに入るし、丸い窓のニッチに下方に実行し、上方に楕円形の窓のニッチ。マウス モデルの初期の開発ではブラをアクセスしているときに主にアブミ骨動脈の致命的な術中出血次外傷を経験しました。結果として、我々 はより限られたアプローチを適応しより小さく、洗練された解剖手順でブラにアクセスします。出血症その後見られなかった。そのアブミ骨動脈熱傷マウス5、我々 の意見で聴覚のしきい値またはらせん神経節細胞の数に重大な影響を持たない事実にもかかわらず必要はありませんので、限り、細心の注意と注意は手術中に撮影されました。微細精神運動能力を開発し、技術的な能力に達するのために必要な時間を割いてお勧めします。注入電極周り閉鎖する初期の切開から平均時間は、通常 1-1.5 h です。
マウスで述べた急性 CI 手術は「腹」の手順と丸窓挿入ラット、スナネズミの20,21,22を含む他の齧歯動物のために使用に似ています。他の齧歯動物の調査は、「背側アプローチ」を丸い窓挿入 SA を完全回避し、より深く6,23,24配列を挿入するのではなく基底回転 cochleostomy に使用していますいます。マウス慢性刺激アセンブリの移植インプラントと術後のケア5修正するダクロン メッシュを追加してこのプロトコルで記述されている、同じ手順に従います。
マウスで CI 手術を実行するときのメインの技術的な課題は、ラット ・ スナネズミ、蝸牛と大規模な SA の存在と比較して蝸牛の小さなサイズです。SA はまたではなくスナネズミがラットであります。さらに、以来、マウス、ラット、スナネズミのよりも小さく、手術により無防備です。
チャンネル接触型マイクロ録音の電気応答を排除するために、ほとんどの CI ユーザーは、有毛細胞の損失を模倣するように、我々 は CI 挿入前に動物を唖然しました。マウスは難聴を引き起こすために必要なアミノグリコシド系抗生物質の全身濃度が狭い線量ウィンドウを持っているので ototoxically の in vivo25の耳を聾するしにくい: 下方の一服に対し、有毛細胞の損失なしでいくつかの日の結果を与えられた単一の注入高用量の致命的な26をすることができます。また、アミノグリコシド系抗生物質に感受性はひずみ依存26です。ただし、ループ利尿剤との組み合わせでアミノグリコシド系抗生物質の単回投与が致命的な結果27せず CBA/CaJ マウスにおける過度の外有毛細胞の損失を作り出すことができることが示されています。遅延の内有毛細胞の死は、すべて検討の蝸牛27の半分で報告されました。
本稿では、アミノグリコシド系抗生物質のネオマイシン C57BL/6 マウス5の最近確立されたプロトコルに触発さの塗布を使用しました。ネオマイシンの急性アプリケーションで 46 dB ± 6.1 クリック誘発聴覚閾値は増大。この増加はアーヴィングらによって報告された 35 dB の増加よりも大きくなります(前 vs 術後: 41.6 dB ± 3.3 対 76.6 dB ± 4.4, p = 0.02, n = 3)5、同じ後耳をつんざくしきい値 (75.7 dB ± 3.7 対 76.6 dB ± 4.4) を達成しました。0.05% ネオマイシンは、27に発生する内部の有毛細胞の損失がかかると急速な外有毛細胞の死によって主に、聴覚の部分的な損失を引き起こすと考えられます。したがって、それはその電気応答内の両方を生成し、外有毛細胞4,8,9,10、11,12のみきこえと鳴り響き動物が部分的に除去。0.05% (重量/体積) ネオマイシンは 4 週間後5耳をつんざくようをらせん神経節細胞の数に低下しないにもかかわらずそれはまだ未知の場合急性体制でネオマイシン聴覚神経繊維に影響を与えるまたは synaptopathy (シナプスの損失を促進します。内有毛細胞と型の間私は聴覚神経繊維)。他の不確実性は、ネオマイシン局所治療が蝸牛の長さに沿って有毛細胞の損失の一様分布を生成しないということです。将来の研究は、これらの質問に答える必要があります。
要約すると、人間の難聴や生化学的なツールのための遺伝的モデルの数の増加は CIs のフィールドなどを含む、聴覚の研究のための魅力的な動物モデル マウスを作る。

人工内耳装用 (CIs) は、重度難聴の聴覚の感覚を人々 に提供することができます電子デバイスです。手術、内耳の蝸牛に電極を使用して直接聴覚神経を刺激します。日には、CI は最も成功した感覚義手、600,000 以上の人々 世界中1を助けています。ただし、デバイスには、欠点があります。まず、デバイスによって提供される利点は、受信者の間で大きく異なります。第二に、ノイズの多い環境や音楽の音声はまだ悪いほとんどの CI ユーザーによって認識されます。
長年、CI 研究でこれらの問題を理解し、安全性とデバイスの有効性を継続的に改善に動物モデルを使用されています。モデルが行われて次の CI 注入2脳の可塑的変化など、いくつかの現象に関する貴重な洞察を与えているきこえ3、および生物物理学的特性を維持するために遺伝子治療の適用の効果、電気刺激の聴覚神経4、他の多くの例の中で。
マウスは、難聴の遺伝モデルの大規模な可用性のための強力なモデル生物です。他のメリットがマウスのゲノムを操作する機能 (例えば, CRISPR Cas システム経由で)、使用する機会は、イメージング技術のメカニズム、特に脳、高再現率、急速な発展を研究する高度なと繁殖と処理は簡単です。マウスにおける CI 手術を行う主な技術的課題は、蝸牛のサイズが小さく、大規模なアブミ骨動脈 (SA) の存在です。SA は通常人間の萌芽期の開発の間に消えますが、齧歯動物、マウス、ラット、スナネズミなどの数の生命中主張します。SA は、丸い窓のニッチは、蝸牛へのアクセスが複雑になり、手術のリスクを増加させる以下実行します。
以前の研究は、マウス5,6、7の CI 注入の可能性を示しています。アーヴィングらは、最大 1 ヶ月間慢性 intracochlear 電気刺激が得られることを示した。急性刺激も行ったが、録音は提示されなかった。アブミ骨動脈を焼灼がなかったこと聴聞会のしきい値またはらせん神経節細胞の数に重大な影響の効果的な耳をつんざくよう手順をアミノグリコシド ネオマイシン、耳毒性薬物の塗布には彼らは示したマウス5。総研らより聴力状態6を維持するために丸い窓からマウス蝸牛に変更された背側アプローチを説明します。プラチナ イリジウム線の挿入、次実質的なきこえされた増加の聴性脳幹反応 (ABR) 28 dB のしきい値。耳音響放射 (OAE) は、大規模な ABR 閾値シフト6動物で失われました。ミストリーら7電気刺激のない状態で注入の機能と病理組織学的効果をテストしました。にもかかわらず、公聴会は、低周波数で 3 と 6 ヵ月齢の注入マウスで維持された、インプラント周囲の線維症のような組織と bullostomy7時頃 osteoneogenesis 注入となりました。
一言で言えば、マウスに CIs の 3 つの研究のうち 1 つだけは CI 刺激の機能するレコーディングを示します。アーヴィングと同僚両方の急性および慢性チャンネル接触型マイクロ録音を実行が、慢性的な CI 刺激5からデータを示しただけ。しかし、アーヴィングら開発完全埋込型機器の慢性モデルは技術的に挑戦的です。それはまだ知られていない場合は急性の CI 刺激少ない挑戦と高速の両方が同様の結果を達成できます。
CIs は、補聴器の恩恵をもはや重度かつ深遠な聴力損失を持つ人々 によって使用されます。CI ユーザー モデル動物は、動物が使用される通常聞くときしたがって耳をつんざくよう手順を含める必要があります。公聴会の動物の耳を聾するする別の理由は、聴覚障害者や聴覚の蝸牛の電気刺激が異なる神経応答4,8,9,10、11,を生成することは12. 聴覚障害蝸牛の電気刺激は直接聴覚神経繊維をアクティブにし、electroneural 応答 (α) を生成します。短潜時と周辺8,10の小さなダイナミック レンジが特徴です。その一方で、聴覚蝸牛の電気刺激は、レイテンシが長く、大きなダイナミック レンジ4,11によって特徴付けられる電気応答 (β) の有毛細胞を興奮させます。電気応答内有毛細胞、外有毛細胞の電気刺激誘発収縮と旅行の波4の生成によって神経線維の通常の励起に起因します。Electroneural と電気応答は、中枢神経系9の 2 つの異なる活動パターンもあります。佐藤らは、ネオマイシン、電気貢献を排除すると耳をつんざくよう前後に注入した CI のモルモットの中脳ニューロンを記録しました。彼ら率レベルの関数の傾きが急な聴覚条件9にろう者の条件で高い比較の発火率を示した。したがって、示される研究質問に応じて、別の電気と電気刺激による聴覚神経の electroneural 応答に耳をつんざくよう考慮することが重要です。
ここでは、我々 は急性耳をつんざくばかりのプロシージャは、マウスで電極アレイの内耳だけでなく、電気的誘発脳幹反応 (チャンネル接触型マイクロ) intracochlear 電気刺激の機能の記録について説明します。

<table><tbody><tr><td>ハードウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>防音ブース</td><td>IAC Acoustics, Winchester, UK</td><td>Mac-2 エンクロージャー RF Shielded Box 2A</td><td></td></tr><tr><td>MF1 スピーカー</td><td>Tucker Davis Technologies (TDT), FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCB マイク</td><td>PCB Piezotronics, Inc, NY, USA</td><td>モデル 378C01</td><td></td></tr><tr><td>低インピーダンス ヘッドステージ</td><td>TDT, FL, USA</td><td>RA4LI</td><td></td></tr><tr><td>Medusa プリアンプ</td><td>TDT, FL, USA</td><td>RA4PA</td><td></td></tr><tr><td>RZ6 auditory processor</td><td>TDT, FL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animal Stimulator Platform</td><td>ASP, Oticon Medical, Nice, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluks</td><td>#115</td><td></td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クローズドループ加熱パッド</td><td>FHC, Inc. ME, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Alcon, CH</td><td>Lacrinorm Augengel</td><td></td></tr><tr><td>Acoustic foam</td><td>Otoform Ak, Dreve Otoplastik GmbH</td><td>#464</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て皮下針電極</td><td>Horizon, Rochester Electro-Medical Inc.</td><td>S83018-R9、27G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自己保持型リトラクター (ミニ コリブリ リトラクター)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>#17000-01</td><td></td></tr><tr><td>吸引ウェッジ</td><td>Agnthos、SE#</td><td>42-886-460</td><td></td></tr><tr><td>吸収性ペーパー ポイント (中)</td><td>WPI、FL、USA</td><td>#504182</td><td></td></tr><tr><td>Intracochlear electrode array</td><td>Bionics Institute、メルボルン、オーストラリア</td><td>4チャンネル</td><td></td></tr><tr><td>Spongostan Standard</td><td>Ferrosan Medical Devices</td> <td>#MS0002</td><td></td></tr><tr><td>Tissue接着剤。Loctite 4161 Superbond</td><td>Henkel</td><td>部品番号 19743</td><td></td></tr><tr><td>動物刺激装置プラットフォーム (ASP)</td><td>Oticon Medical, Nie, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drugs/chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (Narketan)</td><td>Provet AG, CH</td><td>100mg/mL, #VQ_320265</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun)</td><td>Provet AG, CH</td><td>Inj Diss 2%, # 1315</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>Compendium, CH</td><td>Bupivacain Sintetica inj Diss 0.5%</td><td></td></tr><tr><td>Atropine (Atropinesulfat Amino)</td><td>Amino AG, CH</td><td>1 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Betadine (Povidone/iodine)</td><td>Provedic, CH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neomycin (Neomycin trisulfate salt)</td><td>Sigma</td><td>N1876-25G, Lot#WXBB7516V</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioSigRZ</td><td>TDT、フロリダ州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks、マサチューセッツ州、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASPソフトウェア</td><td>Oticon Medical、ニース、フランス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

(CIs) 人工内耳は、聴覚障害者に対するヒアリングの感覚を提供することができますしたデバイスです。しかし、CI は、聴聞会のすべての側面を復元できません。インプラント技術の向上は、CI のユーザーが音楽を感知し、競合する話し手、反射、他の音と声を聞くより自然な環境で実行する場合に必要です。このような改善には、蝸牛の電気刺激とその応答全体の聴覚システムのメカニズムを理解するための実験動物が必要です。マウスは、利用可能な多くの遺伝的モデルによりますます魅力的なモデルです。ただし、この種の CI モデルとして限定的に使用は小さな電極アレイを植え付けることの難しさのために主にです。手術の手順の詳細については、したがって CI 研究におけるマウスの利用を拡大する大きな関心の。
本報告では、急性耳をつんざくおよび C57BL/6 マウスひずみ電極アレイの人工内耳用のプロトコル詳細に述べる。電気的誘発脳幹反応 (チャンネル接触型マイクロ) を持つこのプロシージャの機能の有効性を実証し、顔面神経刺激の例を示しています。最後に、通常聴覚を使用するとき、耳をつんざくよう手順を含むことの重要性を述べる動物。このマウス モデルは、CI のユーザーに対して関連性の遺伝学的および神経生物学のメカニズムを調査する強力な機会を提供します。

本研究の目的は、ろう者のマウスで急性の CI の刺激のための信頼性の高いモデルを記述するためだった。手術前後の聴力閾値は耳をつんざくよう手順の機能読み出しとして提供しています。楕円形や円形のウィンドウで 0.05% ネオマイシンの局所塗布が 46 dB ± 6 でクリック誘発聴覚閾値を大幅に増加 (事前対後ネオマイシン: 30.0 dB ± 3.8 対 75.7 dB ± 3.7、 p = 0.0003、対応のある t 検定、n = 7) (図 3)。マウス サイズ電極配列された以下ラウンドの] ウィンドウ (図 4、図 5) に挿入されます。Intracochlear 電極の電気シミュレーションは、チャンネル接触型マイクロ アクティビティを生成することが確実に。(図 7)。いくつかのケースで CI 刺激顔面神経を活性化し、短いまたは長い待ち時間で高振幅の波を生成 (図 8 aと図 8 b、それぞれ)。短潜時反応波 IV 約 3 ms の急速な拡大を特徴とした、顔面神経の直接応答する可能性があります。待ち時間が長い場合応答は約 5-6 ms が登場、顔面神経によって直接に誘発される非聴覚筋肉 (筋原性) 応答をする可能性があります。顔面神経応答文学における動物実験での報告は少ないが、よく知られている合併症は、人間 CI ユーザー17,18,19。 図 8、相対的に中程度の現在のレベル (150-200 μ A) で、2 つの異なる動物の顔面神経刺激が登場しました。他のケースで両方の応答可能性があります非常に高い現在のレベル (表示されません) で同じ動物に表示されます。顔面神経刺激の外観の下のレベルに現在のレベルを制限することをお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig1.jpg"> 図 1: 聴覚脳幹反応 (ABR) セットアップします。皮下の電極は、頂点 (アクティブ/チャンネル 1 [ch 1])、(参照 [Ref]) の同側の耳の後ろに、麻酔下のマウスの後ろ足 (グラウンド [Gnd]) に配置されます。電極の信号を増幅して、TDT システムによって記録されました。超音波と電気刺激はそれぞれマイクと動物の刺激のプラットフォームでは、経由で掲載されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig2.jpg"> 図 2: 代表として波を 0.05% ネオマイシンと耳をつんざくよう前後に野生型マウスから刺激をクリックします。(A) 通常の聴覚としてパターンはラベル - V と低聴覚閾値、ここで 30 dB SPL (矢印) の波によって特徴付けられます。ろう者として (B) のパターンは、ここで高められた聴覚のしきい値 70 dB SPL (矢印) を示しています。波がある長い待ち時間とより多くの時間ジッタ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig3.jpg"> 図 3: 耳をつんざくよう前後に自動しきい値。ネオマイシンのアプリケーションは、46 dB ± 6 で自動しきい値を大幅増加しました。前 vs 後ネオマイシン: 30.0 dB ± 3.8 対 75.7 dB ± 3.7、p = 0.0003、対応のある t 検定、n = 7。エラーは、平均の標準誤差です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig4.jpg"> 図 4: 手術。(A) 聴覚のブラを露出。Bullostomy は、鼓室胞 (黒の点線) に尾根に沿って (白点線の円) を実行します。(B)、bullostomy では、丸い窓、アブミ骨動脈と楕円形の窓の可視化ことができます。ネオマイシンは優しく楕円形の窓、丸窓を最初からフラッシュします。4番目の電極は丸い窓のニッチのすぐ内側に位置するまで、(C) 電極の配列が挿入されます。切開部を閉じる前に、場所に配列を保管する嚢胞内部電極ワイヤはコイル状の。CN VII 脳神経 VII (顔面神経)、OW = 楕円形の窓、RW = 丸窓、SA = アブミ骨動脈、SCM を = = 胸鎖乳突筋、TB = 鼓室胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig5.jpg"> 図 5: マウス内耳。(A) intracochlear 電極アレイは、直径dの 0.4 mm 間隔で 4 つのプラチナ バンドで構成されています: 0 [ヒント] (d = 0.21)、1 (d = 0.23)、2 (d = 0.25)、3 (d = 0.27)。各電極の幅は 0.2 mm です。4 つのプラチナ/イリジウム (90/10) パリレン絶縁電線は、シリコン チューブでシールドされています。(B) 電極アレイ (赤い点線正方形) の拡大します。電極アレイとプラチナ参照ボールは、プリント基板に接続しています。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig6.jpg"> 図 6: 電気的誘発 ABR (チャンネル接触型マイクロ) セットアップします。CI プラチナ ゴロ (Gnd、赤) は、マウスの首の皮下ポケットに配置されます。アクティブ (頂点に Ch1(+)) と参照 (Ref (-) 同側耳で) ABR 電極間のラインは、チャンネル接触型マイクロの最もよい応答を得るために電極アレイと地面の間の行に垂直です。チャンネル接触型マイクロ接地電極 (Gnd、黒) は、後ろ足に配置されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig7.jpg"> 図 7: 代表チャンネル接触型マイクロ波遊蕩マウスにおける CI 刺激にします。23.3 パルス/秒 (pps) と 400 の繰り返しで構成でモノポーラ電極 #1 相性パルス列が表示されます。刺激レベル 0 175 μ A は 25 μ A ステップ (ステップ 7.2 刺激詳細参照) に表示されます。ローマ数字はチャンネル接触型マイクロ波数を示します。波の振幅と待ち時間の増加減少、それぞれ、現在のレベルの増加とともに。この例では、第 2 の波登場約 1 ms、波 III 2 ms 約 3 ms,波 V 約 4 ms.の周りの波 IV<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58073/58073fig8.jpg"> 図 8: 顔面神経刺激の例。いくつかのケースでは、CI 刺激で顔面神経をアクティブにし、短潜時 (矢印) (A) の直接応答または長い待ち時間 (B) (矢印) と間接の応答を呼び起こします。例は、2 つの CI を注入した動物から 0-300 を使用して相性パルス列刺激 50 μ A、μ A ステップ (ステップ 7.2 では刺激の詳細を参照してください)。ローマ数字はチャンネル接触型マイクロ波数を示します。* チャンネル接触型マイクロ波増幅器の飽和のためのクリッピングを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58073/58073fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

人工内耳装用の動物モデルは、電気刺激で永久的な難聴の治療の技術基盤の知識を進めることができます。本研究は、急性耳をつんざくと聴性脳幹反応と機能性の評価と同様に、マウスで電極アレイの人工内耳の手術のプロトコルを示します。

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

人工内耳の動物モデルは、電気刺激で永久的な感覚神経難聴を治療する技術的基盤に関する知識を進歩させることができます。このプロトコルは、マウスの急性耳が聞こえないおよび人工内耳の移植を示す。そして、聴覚脳幹応答を用いた人工内耳刺激の機能評価。マウスで人工内耳手術を行う主な課題は、人工内耳の小さなサイズと円形の窓のニッチの近くに大きな脈状動脈の存在です。通常の聴覚状態を測定するには、音響フォームを1ミリリットルの注射器にロードし、麻酔付き8〜12週齢のC57ブラック6マウスの対側外耳道に100〜200マイクロリットルの泡を注入し、耳の脳幹応答をイプシラテラの耳から耳に密接に分離します。次に、耳の上から10センチメートルのスピーカーを設置し、70%エタノールでaVR電極を洗浄します。参照電極を、頂点の皮膚の下に、イプシラテリアの耳と活性電極の下のピンナの下に置きます。後ろ足の皮膚の下に接地電極を置きます。ヘッドステージとプリアンプを光ファイバポートを介して聴覚プロセッサに接続します。そして、活性電極と基準電極のインピーダンスを確認します。電極が同じインピーダンスを表示する場合は、防音ブースを閉じてクリック刺激を提示します。適切な複雑な聴覚プロセッサとソフトウェアを使用して、自由なフィールド条件でaVRを記録します。クリック刺激を0.1ミリ秒に標準化し、10ミリ秒の記録ウィンドウで10デシベルステップで、音圧レベルの90デシベルから10デシベルに減少するクリックレベルで21ヘルツで提示された単一チャネルモノファシカルクリック。次に、認識可能な aVR 波応答を使用して、最小デシベル レベルとして aVR しきい値を決定します。耳が聞こえないことを誘発するには、気道が開いたままになるように体をまっすぐに保つように注意して右側にマウスを置きます。イプシララル耳の後ろの毛皮を取り除き、露出した皮膚をシーケンシャルな70%エタノール溶液とポビドーネ溶液スクラブで消毒します。動物を解剖顕微鏡の下に移動し、16倍の目的とメスを使用して、1〜1.5センチメートルの口房切開を行います。25〜40倍の拡大の下で、露出した皮下脂肪層を解剖し、胸膜筋を引き込んでティンパニック・ブラ・ペリオステウムを明らかにするために鉗子を使用する。顔面神経は胸骨筋の後部後部の端を包み込み、耳道に沿ってピナに向かってロストリーを走る。聴覚ブラの識別のためのランドマークとして顔面神経を使用して、そっとブラへのアクセスのための切開に自己保持リトラクターツールを配置します。ブラとマストイドプロセスの間の尾根を明確に視覚化できるように、ブラのメディオドール領域の上にある組織を取り除き、30本のギアージ針をブラに穏やかに回転させて、尾根の後部上側に穴を開けます。細かい先端の鉗子で小さな骨片をつまんで、中耳の空洞が露出するまで闘楽を広げます。そして、丸い窓のニッチが上の骨から離れるまで、マスタイドプロセスに向かって穴をドーサリーに伸ばします。最も重要なステップは、ウィンドウニッチの準備です。足支動脈を損傷しないように、あなたの時間を取るようにしてください。また、足動脈に損傷を与えないように、前眼の上方向にブラスタトミーを伸ばし、テープを可視化し、中耳骨を楕円形の窓に接続する。次に、楕円のウィンドウを表示するテープを削除します。過誤剤を塗布するには、鈍い30本のゲージ針を使用して、円形および楕円形の窓膜を穏やかに穿穿刺し、周リンパがなくなることを確認する。そして、30ゲージ針を装備した1ミリリットルのシリンジを使用して、楕円形の窓からPBSに溶解したネオマイシンをボリュームで0.2ミリリットルの5%重量でゆっくりと浸透させます。エージェントの全容が送達されると、窓の骨の構造を損傷しないように注意して、丸い窓に溶液を多量に使用します。そして、ラウンドウィンドウと楕円形の窓のニッチ内にネオマイシンに浸したスポンゴスタンの1平方ミリメートルの部分を置きます。その後、レトラクタを取り外し、切開を閉じ、30分後に実証したように耳が聞こえない後の音響aVRを記録する。人工内耳電極アレイを挿入するには、切開部にレトラクタツールを戻してブラに再アクセスし、電極アレイをスカラティンパニの奥行きに挿入し、アレイの4番目の白金リングが円形の窓のすぐ内側に配置されます。電極アレイの挿入も難しい場合があります。だから、リードワイヤーに1つのフォースPツールを使用して、配列を挿入するために別の良い挿入角度を見つけるためにあなたの時間を取ります。リードワイヤーをブラの内側に巻き、ワイヤーをブラの上の組織に接着します。慎重にリトラクタを取り除き、ティッシュ接着剤で挿入を閉じた後、スラッペルを使用して首に0.5ミリメートルの切開を行い、アクティブとリファレンスaVR電極の間の線に垂直にします。挿入にグラウンドボールを置き、電極アレイボードを動物刺激装置プラットフォームに接続します。aVRを実行して電気するには、前述のように電極を配置し、動物刺激装置プラットフォームソフトウェアを開きます。次に、電気パルス刺激パラダイムを定義し、TBTヘッドステージ、プリアンプ、および聴覚プロセッサを介して連続的に呼び起こされる電気aVR応答を記録する電気パルス列車を提示します。手術前および手術後の聴力閾値は、耳が聞こえない手順の機能的な読み出しとして機能する。楕円形および円形窓への5%ネオマイシンの局所適用は、クリック誘発された聴力閾値を有意に増加させる。耳が聞こえない耳の内電極の電気刺激は確実に電気aVR活動を発生させることができる。場合によっては、人工内耳刺激は顔面神経を活性化し、波IIIの急速な増幅によって特徴付けられる短い遅延および顔面神経の直接応答、または5〜6ミリ秒前後に現れる長い待ち時間で高い振幅波を生じ、非聴覚的な発癌反応である可能性が高い、顔面神経によって間接的に呼び出される。この研究では、人工内耳マウスモデルも人工内耳が小さく、手術が困難であることも実証した。この手順を試みる間、aVRの録音で電気的な応答を排除し、ほとんどのC.I.ユーザーに見られる毛細胞の損失を模倣するために耳が聞こえないプロトコルを検討することが重要です。要約すると、ヒト難聴の遺伝モデルやマウスで利用可能な生物医学ツールの数が増えているため、人工内耳を含むツール研究の魅力的な動物モデルとなっています。

cochlear-implant-surgery-electrically-evoked-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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私たちは、電極製造のためのシンプルで費用対効果の高いアプローチを開発し、自由に動くマウスで複数の領域にわたる信号の記録を行いました。光遺伝学と多領域電気生理学およびカルシウムシグナル記録を利用することで、発作キンドリングモデルにおける領域間のニューロン活動の解明が可能になりました。...

多領域In Vivo記録のための柔軟で便利な電気生理学的オプトロードを作成するための統合的手法

学ぶC57BL/6マウスにおける人工内耳植込み手術と電気的誘発脳幹応答記録法。急性難聴誘導と聴覚機能評価の標準化されたプロトコルを習得し、感覚神経性難聴治療技術の理解を深める。

人工内耳手術と c57bl/6 マウスに電気的誘発脳幹の応答録音

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