シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

このプロトコルの全体的な目標は、分光光度法を使用してモデルシアノバクテリウムシネコシスティスのフィコビリタンパク質含有量を定量的に決定することです。フィコビリタンパク質は、原核生物のシアノバクテリアや真核生物の藻類のいくつかのグループにおける光収集アンテナの主要成分を表す水溶性色素-タンパク質複合体です。フィコビリタンパク質は主要な集光複合体であるため、藻類やシアノバクテリアの生産性を決定する重要な要素の1つです。

シネコシスチスは、世界中の何百もの研究所で使用されているモデルシアノバクテリアです。シネコシスティスには、フィコシアニンとアロフィコシアニンの2つのフィコビリタンパク質が含まれています。このプロトコルは、この金型株中の両方のフィコビリタンパク質を定量的に測定するためのシンプルで効率的かつ信頼性の高い方法について説明しています。

フィコビリタンパク質抽出と分光光度定量法など、いくつかの方法を比較しました。定量法は、フィコビリタンパク質の吸収スペクトルが異なる株間で異なる可能性があるため、すべての菌株について試験する必要があります。フィコビリタンパク質の抽出開始時に、1ミリリットルのシアノバクテリウム培養物をセーフロックチューブに移します。

サンプルの乾燥重量を決定する場合は、培養サンプリングの前に空のチューブを重量化します。文化が沈殿していないことを確認してください。細胞を実験室の温度で15, 000Gで5分間遠心分離します。

上清は慎重に捨てます。ペレットを邪魔しないように注意してください。サンプルを冷凍庫に入れます。

長期保存の場合は、サンプルを摂氏80度に保ちます。これは、フィコビリタンパク質の分解を防ぐために必要です。サンプルが凍結したら、凍結乾燥機に挿入します。

凍結乾燥が始まったら、凍結乾燥機の温度と圧力を確認します。気温は摂氏60度未満でなければならず、圧力は約1ヘクタールのパスカルでなければなりません。サンプルを一晩凍結乾燥します。

凍結乾燥サイクルが終了したら、空気からの水の再吸収を防ぐために、できるだけ早くチューブを閉じてください。2ミリリットルのガラスビーズを4個、各サンプルチューブに加えます。サンプルをガラスビーズで15秒間均質化します。

適切に均質化されたサンプルは、セーフロックチューブの内面全体に広がります。細胞の均質化後、フィコビリタンパク質を抽出するために、1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水をサンプルに加えます。PBSの最適pHは約7.4です。

ホモジナイザーで細胞をPBSと5秒間混合します。これにより、効率的なフィコビリタンパク質抽出のための最適なサンプル混合が確保されます。混合後、サンプルは緑がかっています。

サンプルを氷上に60分間保持すると、最も効率的なフィコビリタンパク質抽出が可能になります。抽出後、サンプルを15, 000 G、摂氏4度で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清はシアンブルー色になります。

分光光度測定の前に、PBSをブランクとして使用して分光光度計を校正します。分光光度計が校正されたら、1つの分光光度計キュベットからPBSを廃棄し、廃棄されたバッファーの代わりに抽出されたフィコビリタンパク質で上清をピペットで動かします。フィコシアニンおよびアロフィコシアニンの定量では、抽出されたフィコビリタンパク質を含む上清を615、652、720ナノメートルで測定します。

本文に記載されているように、文献で知られているフィコビリソームの定量化にはいくつかの方程式があります。このプロトコールで使用された式は、顔料およびドットとしてフィコシアニンおよびアロフィコシアニン濃度を最もよく相関させるものとして見出されました。プロトコールの重要なステップは、細胞の均質化と抽出であり、これにより高収率と高特異性の両方が得られるはずです。

超音波処理による細胞破壊、ジルコニアビーズによる均質化、細胞結合の凍結など、いくつかの抽出手順をテストしました。このプロトコルの方法は、最高のフィコビリソーム収量を提供しました。タンパク質抽出物がクロロフィルによってわずかに汚染されただけでも、フィコビリタンパク質の含有量が過大評価される可能性があるため、細胞からのクロロフィル抽出は避ける必要があります。

粗抽出物からクロロフィルを検出し、その後、細胞破壊のために超音波処理を使用しました。超音波処理サイクルを繰り返すと、クロロフィル濃度が増加しました。均質化時間は 15 秒に最適化されました。

5 秒と 20 秒の両方で均質化すると、収率がわずかに低下しました。PBS緩衝液または水に塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを添加しても、酢酸ナトリウム緩衝液での抽出と同様に、フィコビリタンパク質の抽出効率は向上しなかった。フィコビリタンパク質の抽出時間は、120分後、さらには240分後もフィコビリタンパク質濃度が大きく変化しなかったため、60分間最適化されました。

615、652、720ナノメートルの吸光度が分光光度計の近吸光度範囲に収まることを確認してください。このプロトコルで使用される分光光度計は、0.1〜3の近吸光度範囲を示しています。文献から知られている分光光度法のphycobiliproteins定量化のいくつかの方程式を比較しました。

Bennett と Bogorad の式により、既知のタンパク質濃度を持つ顔料標準試料中のフィコシアニンとアロフィコシアニンの両方の含有量を最もよく再現できました。個々の方程式の違いは、特定の生物のフィコビリタンパク質の吸光係数の変動に関連しています。硫酸ストレプトマイシンの使用は、超音波処理が適用されたまたは回避されたサンプルのクロロフィルAの減少につながらなかった。

代表的なデータとして、シネコシスティス細胞におけるフィコビリタンパク質の含有量を決定しました。フィコビリタンパク質の含有量は、光の増加下で減少しました。このプロトコルは、標準的なライブサイエンスラボで実施できる筆記顔料分析の時間と機器の要件を最小限に抑えるために確立されました。

また、このプロトコルには、細胞ペレットの凍結乾燥やタンパク質抽出など、他の2つのステップが含まれています。フィコビリソームの定量のための総労働時間は2時間以内です。