Name: 骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ骨再生用生体材料の生物学的互換性評価法。in vitroおよびin vivo技術を用いた多角的アプローチにより、骨修復における材料の有効性と免疫応答を包括的に予測し、前臨床スクリーニングの重要性を示す。

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この研究プロジェクトは、付与契約第 263363 の下で欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) から資金を受けています。

<ol><li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture+healing%3A+mechanisms+and+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li>
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<li>Stanovici, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+strategies+with+bone+marrow+stromal+cells+in+orthopaedic+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Research+in+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery.</a> Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).</li>
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<li>Changi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+and+immunogenicity+of+elastin-like+recombinamer+biomaterials+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).</li>
<li>Laczko, J., Levai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+differential+staining+method+for+semi-thin+sections+of+ossifying+cartilage+and+bone+tissues+embedded+in+epoxy+resin%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin.</a> Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+osteoclasts+put+marks+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase+on+dentin+slices--a+simple+method+for+identifying+polarized+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts.</a> Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).</li>
<li>Deguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+bone+to+facilitate+measurement+of+adhesion+forces+and+super-resolution+imaging+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts.</a> Scientific Reports. 6, 22585(2016).</li>
<li>Epstein, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+noninstrumented+posterolateral+lumbar+fusions+performed+in+predominantly+geriatric+patients+using+lamina+autograft+and+beta+tricalcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate.</a> Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).</li>
<li>Epstein, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+tricalcium+phosphate%3A+observation+of+use+in+100+posterolateral+lumbar+instrumented+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions.</a> Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).</li>
<li>Kallai, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcomputed+tomography-based+structural+analysis+of+various+bone+tissue+regeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models.</a> Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).</li>
<li>Lo, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+a+critical-sized+calvarial+defect+model+using+adipose-derived+stromal+cells+harvested+from+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).</li>
<li>Gosain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+calvarial+defects%3A+contribution+of+the+dura%2C+the+pericranium%2C+and+the+surrounding+bone+in+adult+versus+infant+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dura+mater+stimulates+human+adipose-derived+stromal+cells+to+undergo+bone+formation+in+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects.</a> Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).</li>
<li>Wang, J., Glimcher, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+matrix-induced+osteogenesis+in+rat+calvarial+bone+defects%3A+II.+Origins+of+bone-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells.</a> Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).</li>
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著者が明らかに何もありません。

骨の再生と修復のために開発された代表的な生体材料の生体適合性の前臨床評価のための学際的なアプローチを紹介します。我々 は OCs、海底地震計の応答をテストし、重要な骨欠損内に生体の治癒反応モデル マウスと同様、 in vitroとin vivo免疫応答。法データと生体材料学から派生した結論の要約の作業を示すを目指しました。当社の戦略が骨生体材料の生体適合性の貴重なプロファイルを生成することを示す.
一次電池の試金は、OB、OC 機能の評価に使用されました。OBs は、骨形成と生理学的修復します。実行可能なまま、差別化し、石灰化を誘導する必要があります。本研究では、石化する能力を持つ生理的分化細胞のマーカーとしてアルス、ALP、セル実行可能性の試金を実行する方法を示します。ベースラインを提供するだけで、培地と分化と OBs のプラスチックに無機化に最適化された骨の鉱化作用媒体 (MM)、アッセイするためのコントロールが含まれています。後者のコントロール グループは、生体材料の標準的な参照をしました。OC の評価、我々 は共同 OB...

骨修復は血腫形成、炎症から始まる複雑なプロセス、カルスの形成と、1,2を改造します。ただし、潜在的な骨再生は骨破壊1,3のサイズに制限されます。例えば、大きな骨骨折外傷、癌や骨粗鬆症による癒すことができない、非組合骨折と呼ばれます。これらの骨病変は、健康な生理学的な骨の修復と再生を促進する治療を必要があります。現在、自家および同種骨移植は 220 万骨交換の手順と選択4のアプローチ毎年5。これらの手順は、高い成功率を持っている、しかし拒絶4ドナー サイト罹患率や感染骨の限られた可用性などの合併症がある可能性があります。骨再生のための新たな選択肢は、これらの課題に対処するために求められています。
天然または合成高分子、セラミックスや金属細胞と生体分子との組み合わせでのバイオマテリアルの設計は上昇6。生理学的骨治癒と生体材料のコンテキストで癒しの私達の現在の理解は機械的性質など複数の要因と循環と骨折部位7 から細胞を含む複数の局所的・全身的要因によって異なります ,8,9。骨再生のための生体材料は、10 osteogenicity、オッセオインテグレーションを促進することを目指して、理想的に生体適合性、生分解性多孔質 (栄養素、酸素、細胞遊走を促進) です。彼らはまた十分に痛みを和らげるために骨折部位をサポートする強力なする必要があります。さらに、炎症性因子は、癒しのプロセスを開始する必要があります。ただし、生体材料は、過剰な炎症やアレルギー反応を誘発する場合、これを制限または骨11,12の治癒を阻害します。したがって、学際的なアプローチは評価生体材料の骨修復のために開発されなければなりません。
本研究で提案する代表的な材料は、1) Orthovita Vitoss 第三リン酸カルシウムから成る市販海綿骨移植代用品である泡から成るナノサイズ純粋な β-リン酸三カルシウムの前臨床評価リン酸 (β-TCP) 粒子とタイプ 1 コラーゲン (C) (β-TCP/C フォーム) と 2) β TCP ディスク。ここでは、主骨芽細胞 (OB) を使用してこれらの生体材料の生体適合性のテストを示すし、破骨細胞 (OC) 試金、骨修復、T リンパ球増殖培養を含む免疫学的評価の体内モデルとサイトカイン産生と生体内での免疫原性とアレルゲン性、以前に報告された13。

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

大きな非組合骨骨折は、整形外科で重要な課題です。自動車と同種骨移植は、このような病変を治癒に優れている、彼らの使用の潜在的な合併症があります。したがって、材料の科学者は、これらの問題を克服するために合成、生体適合性バイオマテリアルを開発しています。本研究では骨修復のためのバイオマテリアルの評価のための学際的なプラットフォームを提案する.我々 は骨の生物学と免疫学培養破骨細胞 (OC) と骨芽細胞 (OB) アッセイと骨修復、免疫原性、アレルゲン性のマウス モデル体内を含むプラットフォームを開発する専門知識を組み合わせます。実験を実行し、結果を要約、生体材料の生体適合性に関する報告方法を示します。特に、β-リン酸三カルシウム (β-TCP) リン酸ディスクのコンテキストで OB 生存・分化と鉱化作用と OC 生存分化をテストします。また、骨の治癒の初期段階に及ぼす影響を決定するための重要なサイズの頭蓋骨骨欠損マウス モデルにおける骨修復用臨床的に市販材料である β-TCP/コラーゲン (β-TCP/C) フォームをテストしました。並列実験マウスにおける免疫・ アレルギー反応を評価されます。我々 のアプローチは、骨の治癒と修復術に使用する生体材料の生体適合性を予測するために必要なパラメーターの範囲で骨生体材料の生物学的互換性のプロファイルを生成します。

Β-TCP 骨修復における生体材料としての有効性の評価、体外と体内のスクリーニング方法を使用しました。まず、OB 中単独でコントロール対応ベースラインと比較して β TCP ディスク レスポンスを測定しました。図 2は、文化の 7, 14 日目に β TCP ディスクに対して OB 生存率を示しています。代謝活性の高い細胞文化井戸から測定セル実行可能性は、組織培養プラスチック中、この生体材料は強化でも、OB の増殖を抑制することでもないことを示す β TCP ディスクとともに OBs の同じだった。
OBs をさらに評価するには、定性的、定量的アプローチを使用して分化のマーカーと ALP 活性を測定しました。図 2は、文化の 7 日後文化井戸 ALP 酵素活性を示します。媒体は一人で井戸の海底地震計...

大きな骨病変を修復するために設計された、新しいバイオマテリアルの数は骨の治癒を高め、骨移植に関連する合併症を克服することを目的と継続的に拡大しています。骨修復のためのバイオマテリアルの前臨床生体適合性テストのための学際的な戦略を紹介します。

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

これらの方法は、生体材料の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。特に骨再生のため。彼らは、生体材料の有効性と潜在的な免疫応答を評価するために使用されます。この学際的なプラットホームの主な利点は骨の修理のために使用される生物材料の生物適合性を予測するための変数の範囲を提供する。これらのインビトロおよびインビボ骨技術の意味合いは、他の骨疾患にまで及ぶ。新しい整形外科生体材料の前臨床スクリーニングの必要性のため。皮膚科の方法論は骨の治癒のための生体材料への洞察を提供することができ、それはまた、他の臨床適応症のための生体材料評価に適用することができる。骨形成性無機化培地を添加した14日後の原発性骨芽細胞からの吸気培地。1X PBSの0.5ミリリットルで2回リンス。その後、10%緩衝ホルマリン溶液の0.5ミリリットルを加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。10分後、10%緩衝ホルマリンを使い捨てパイプで吸引し、0.5ミリリットルの超純水で2回洗浄する。その後、固定骨芽細胞に40ミリモルアリザリンレッドS染色液の250マイクロリットルを追加します。そして、毎分100シェイクでシェーカーで10分間室温でプレートをインキュベートします。染色液でインキュベーションした後、1ミリリットルの超純水で1ミリリットルの極純水で染色液を吸引する。リンス溶液が透明になるまで、このステップを5~10回繰り返して非特異的染色を除去します。最後の洗浄を吸引した後、冷たいPBSの1ミリリットルを追加します。そして、以前のようにシェーカー上で10分間室温でプレートをインキュベートします。次に、染色されたβ三カルシウムリン酸ディスクを新しいウェルに移し、フラットベッドスキャナでプレートをスキャンして鉱物化を記録します。画像を取り込んだ後、250マイクロリットルの10%セチルピリジニウムクロリド溶液を加え、15分間振ってアリザリンレッドS染料を抽出します。次に、溶液をウェルから個々の1.5ミリリットルチューブ、遠心分離機を室温で5分間17,000 x gに移します。10%セチルピリジニウムクロリド溶液で抽出物を1.5ミリリットルチューブで1:10〜1:20の希釈度で希釈します。その後、各希釈サンプルの300マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに移します。塩化10%のセチルピリジニウムのみを含む2つのブランクウェルを含む。次に、40ミリオモラルアリザリンレッドS染色液を10%セチルピリジニウムクロリド溶液で希釈して4400マイクロモルからなる7つのアリザリンレッドS基準基準を調製し、標準曲線を生成する。各標準の300マイクロリットルをプレートに積み込みます。最後に、520ナノメートルのサンプル、ブランク、および基準規格の吸収剤を読み取ります。骨髄破骨形成体を、生殖不能はさみを使用して股関節の体から脚を取り除くことによって、安楽死させたマウスの大腿骨および脛骨から骨髄骨形成前駆体を分離する。膝と足首の関節で手足を切断し、無菌メスと鉗子で柔らかい組織を取り除きます。骨端を切り落とす。1ミリリットルの骨成長培地で満たされた注射器に取り付けられた27ゲージの針を内腔に挿入し、骨髄を6センチメートルの無菌ペトリ皿に洗い流します。すべての大腿骨と脛骨のためにこれを繰り返した後、50ミリリットルの円錐形チューブに細胞懸濁液を移す。6センチのペトリ皿を5ミリリットルの骨成長培地で洗い、同じ50ミリリットルの円錐形チューブに移します。摂氏4度で350xgの遠心分離機を5分間。遠心分離後、破骨細胞分化培地のウェル当たり1ミリリットルで細胞を再懸濁する。1つのBALB/cマウスは、1つの24ウェル培養プレートに十分な数の破骨前駆体を提供します。骨成長培地に懸濁した原発骨芽細胞を生体材料に加え、コントロールを8.8*10^4平方センチメートルでコントロールします。ベータ三カルシウムリン酸ディスク、制御された牛の骨、および組織培養プラスチックがここでは使用されます。24時間の5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。24時間後、培養した原発性骨芽細胞に新たに単離した骨髄破骨前駆体前駆体および破骨細胞分化培地を加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度で5日間培養してインキュベーターに戻す。培地を1日おきに作りたての破骨細胞分化培地に交換してください。次いで、酒類耐性酸ホスファターゼの破骨細胞を染色し、分化を評価する。麻酔付き8週齢BALB/cマウスの頭皮を剃り、7.5%ポビコーンヨウ素溶液と70%エタノールで表面をきれいにします。眼用軟膏で目を覆い、処置中の乾燥を防ぎます。つま先と尾のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の適切なレベルを確保します。その後、正中線矢状切開を行った後、メスで掻き取ることによって、右頭頂骨の上のパラクラニウム結合組織を除去する。その後、毎分2000回転で直径4ミリメートルの無菌歯科トレフィンを使用して、右頭頂骨に重大な大きな欠陥を作り出します。常に右頭頂骨をノッチし、エクトコールテキストといくつかの内皮質を切断しながら、滅菌生理食い溶液で領域を灌漑.デラ・マーターの損傷を防ぐために、小さなペリオスチールエレベーターを使用して残りの内皮質を突破します。その後、慎重にカルバリア骨を持ち上げ、それを削除するために鉗子を使用しています。結果として生じる欠陥は円形で、直径は約3.5ミリメートルである必要があります。次に、カルバリア欠損物を、滅菌PBSに予め浸した、ベタクロリン酸三カルシウムコラーゲンフォームで満たす。生体材料を所定の位置に保つために、欠陥の端に0.5マイクロリットルの組織接着剤を2つの反対のポイントで塗布します。その後、非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。麻酔したマウスを背中に置き、腹部の毛皮を剃り、7.5%ポビドンヨウ素溶液と70%エタノールで剃った表面をきれいにします。腹部のリニアアルバに沿って皮膚を通して8ミリメートルの長い中線切開を行った後、移植PBSは皮膚の下に生体物質を浸した。次に、非吸収性縫合糸で皮膚を縫合する。移植後8週間、安楽死させたマウスから周囲の組織で移植部位を切除する。この画像は、オープンバーに示されたベータ三カルシウムリン酸ディスクの成長が、培養7日および14日の培養プラスチックの成長と比較して骨芽細胞の生存率に影響を与えないことを示している。培養骨芽細胞は14日後にアリザリンレッドSで染色された。ミネラル化は、培地単独で培養した骨芽細胞に比べて、鉱化培地の制御に対して高かった。そして、懸濁液培養井戸中のベータ三カルシウムリン酸ディスクに。外科的に誘発された重篤な大きさのカルバリア欠損を空にした場合、全欠陥を覆う薄い層が観察されたが、手術後12週で有意な骨形成は存在しなかった。対照的に、欠損がリン酸三カルシウムコラーゲン発泡体のβを含む場合、いくつかの血管および炎症細胞を含む密な線維組織に囲まれた泡残骸は、骨形成の証拠なしに欠陥領域を橋渡しした。皮下ベータ三カルシウムリン酸コラーゲンフォーム移植に続いて、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片に対する異物巨細胞に対する炎症反応が8週間でマッソンのトリクローム染色切片に線維症の証拠を観察した。対照的に、恥のコントロールの移植部位は、最小限の炎症と線維症を有していなかった。この手順を試みている間、それは動物を傷つけることなく、カルバリウムの正確かつ再現性のノッチを行うことが重要です。この手順の他の方法に従って、破骨細胞分化アッセイや腹膜免疫モデルへの高スループットは、生体材料に対する破骨細胞の応答および免疫応答の種類のような追加の質問に答えるために前形化することができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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骨組織工学のための脱細胞化リンゴ由来の足場( In Vitro および In Vivo)

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骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

学ぶ骨再生用生体材料の生物学的互換性評価法。in vitroおよびin vivo技術を用いた多角的アプローチにより、骨修復における材料の有効性と免疫応答を包括的に予測し、前臨床スクリーニングの重要性を示す。

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

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