動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

この方法は、動的タンパク質合成とプロセスに関与するプロテオームに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、翻訳対象として選択されているmRNA、プロセスに関与して翻訳を妨害する可能性のあるマイクロRNA、およびタンパク質の翻訳に寄与するタンパク質またはそれ自体が翻訳されているタンパク質を同定できます。この方法は、ストレスに対する心臓の反応に関する洞察を提供するだけでなく、他の臓器のストレスに対する急性反応の研究にも適用できます。

この手順を実演するのは、Jennifer Van Eykの研究室のプロジェクトサイエンティストであるMiroslava Stastnaです。実験当日は、グラジエントミキサーの左側のコンパートメントに5ミリリットルの15%スクロース勾配溶液を充填し、右側のコンパートメントに5ミリリットルの50%スクロース勾配溶液を充填します。タップを開けてポンプのスイッチを入れ、マグネチックスターラーで2つの小さなコンパートメントを攪拌し、2番目のタップにリンクされたチューブを使用して、混合ショ糖溶液を氷上の薄い壁を持つ単一の超遠心チューブに流します。

次に、新鮮または凍結した心臓組織を、ろ過した溶解バッファー中のPOLYTRONで氷上で15秒間ホモジナイズします。インキュベーションの最後に、ライセートを遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を回収します。タンパク質測定、RNA単離、およびRNA完全性分析のために50マイクロリットルの上清を確保し、残りの上清を100〜500マイクロリットルをグラジエント溶液の上に重ねます。

新鮮な溶解バッファーを使用して、2つのグラジエントチューブ間の容量のバランスを取り、スイングバケットローターを備えた超遠心分離機でサンプルを超遠心分離します。遠心分離の前後にショ糖の勾配を乱さないように十分注意してください。グラジエントを収集するには、フラクションコレクターをプログラムして、収集の最初の3分間を破棄し、254ナノメートルでの吸光度を連続的に監視しながら、4分から19分までの17のフラクションで1分あたり1ミリリットルの速度で重、軽、非翻訳のフラクションを収集します。

各フラクションが集められたらすぐに氷の上に置きます。次に、サンプルがすぐに処理されない場合は、摂氏マイナス80度でサンプルを保管します。ポリソーム画分からタンパク質を抽出するには、収集したショ糖画分を3つの最終画分に結合し、画分を重、軽、非翻訳としてマークします。

各サンプルの0.5ミリリットルを、60マイクロリットルの100%トリクロロ酢酸(TCA)と混合します。フラクションを暗所で摂氏マイナス20度で一晩インキュベートします。翌朝、サンプルを氷上で解凍してから、遠心分離によりタンパク質をペレット化します。

上清を捨て、遠心分離ごとにマイナス20°Cの0.5ミリリットルの冷やしたアセトンでペレットを2回洗浄します。TCA沈殿後、ペレットが完全に溶解し、必要に応じてパルス超音波処理を使用して完全な可溶化を確保していることを確認します。最後の洗浄後、ペレットを風乾してから、360マイクロリットルのTris-HClバッファーに再懸濁します。

次に、40マイクロリットルのジチオスレイトールを加えて、摂氏55度で45分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、50マイクロリットルのヨードアセトアミドをサンプルに加え、光から保護された室温でシェーカーで30分間インキュベートした後、トリプシンとタンパク質の重量比が1対50でサンプルを分解し、摂氏37度で一晩振とうします。翌朝、冷却した後、サンプルを短時間遠心分離し、10%ギ酸でpHを2〜3に調整してトリプシン活性を急冷します。

サンプルを脱塩するには、まず96ウェルプレートのウェルで吸着剤を200マイクロリットルのメタノールで3回コンディショニングし、次にウェルあたり200マイクロリットルの0.1%ギ酸で3回コンディショニングします。次に、サンプルを各ウェルにロードし、洗浄ごとに200マイクロリットルの0.1%ギ酸でサンプルを3回洗浄します。重力とそれに続く低真空を使用して、サンプルを50%アセトニトリル中の100マイクロリットルの0.1%ギ酸で2回溶出させ、サンプルごとに1つの低タンパク質保持0.5ミリリットルチューブに溶出します。

次に、濃縮器を使用してサンプル溶出液を乾燥するまで蒸発させ、質量分析のために各トリプシンペプチドペレットを 50 から 100 マイクロリットルの 0.1% ギ酸に再構成します。mRNA 分析は、各画分中の目的の特定の mRNA の分布を評価するため、または各画分における mRNA 存在量の比として、組み合わせたポリリボソーム翻訳画分と非翻訳画分を定量化および比較するために実行できます。例えば、ここでは、マウスの心臓を虚血または虚血再灌流にさらした後の翻訳画分と非翻訳画分にわたるmRNA分布の変化を、偽心臓治療と比較して示しています。

この代表的な実験では、プールされた重画分中のマイクロRNAのサブセットを分析した結果、虚血時には22個のマイクロRNAがポリソームに関連し、9個は虚血と再灌流時に関連し、7個は両方の条件に共通していることが明らかになり、マイクロRNAの結合が虚血と再灌流のストレスに応答して動的であることが示されました。さらに、ミトコンドリアリボソームタンパク質の大部分は軽度画分で同定され、細胞質リボソームタンパク質の大部分は、重分画と軽分画の両方で共通して同定されました。この手順を試みるときは、ショ糖の勾配に細心の注意を払うことを覚えておくことが重要です。

ポリソーム画分からタンパク質を抽出するためのTCA沈殿法は、高濃度のショ糖を含む画分を処理する能力と、質量分析によって同定されたタンパク質の数の両方に基づいて、ワークフローで選択されました。一般に、この方法を初めて使用する人は、ショ糖勾配の再現性に関連する課題のために苦労する可能性があります。TCA沈殿は、タンパク質を沈殿させるのに必要な量が少量で、ペレットがチューブの底部で視認でき、沈殿中にスクロースが蓄積しないため、有利です。