Name: 動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶポリソームプロファイリング法によるマウス心臓の動的タンパク質合成解析。灌流心臓からのポリソーム分画とmRNA・miRNA・プロテオーム分析により、心臓のストレス応答における翻訳制御メカニズムを解明する。

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NIH P01 HL112730 (布、JVE) NIH R01 HL132075 (ぼろきれ、JVE)、バーブラ ・ ストライサンド女性のハート センター (ぼろきれ、JVE)、ドロシーと e. フィリップ リヨン椅子分子循環器 (布) で、女性の心の健康 (JVE)、チェコ科学アカデミー エリカ グレイザー寄附施設支援 RVO: 68081715 (MS)。

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ポリソーム プロフィール分析と、特定の mRNA の全体のトランスクリプトーム6,7並進状態の分析によりタンパク質翻訳の研究。ローカル翻訳シナプトソーム8など検討する必要がある場合、それは大きな助けとだも。伝統的に、この方法は、モノとポリゾームとショ糖密度勾配をゲノムと結合することができるまたは目的の結果6,9を取得するプロテオミクス技術に関連する Mrna の分離を含みます。例えば、私たちのグループによって実行される最近の調査は患者の虚血/再灌流障害を模倣した体外循環心で実行される転写後調節機構を明らかにしました。ポリソーム プロフィール分析のを活かして、我々 は CPB の手順2の後の心核符号化されたミトコンドリア蛋白質の翻訳で増加を示しています。
こ...

中心部は、(I) 虚血と再灌流 (R) ダイナミックなファッションでの傷害に応答します。ただし、応答の中にタンパク質合成に急性の変化に少し洞察力があります。これに対処するため行ったリボゾームとポリソーム、細胞質から並進規制要因の再分配を反映したタンパク質豊富に変更を識別するために1をプロファイリング ポリソームの確立方法の利点と新しく合成されたタンパク質 (Nsp) の増加します。私の設定で/R、新しい Mrna2; の転写と一貫性がないタイム フレームでの蛋白合成の増加が発生しますまた、mRNA 発現および蛋白質量の不一致は、報告された3をされています。これらの理由から、タンパク質翻訳を反映して動的プロテオームの変化を分析することを選びました。これを行うには、我々 はポリソーム分数の mRNA を定量化し、ポリソーム分数のタンパク質組成を分析します。最後に、マイクロ Rna (miRs) Mrna の翻訳の可用性を調節するタンパク質翻訳4、5の効率を妨げることができますので、我々 の分布を調べた miRs ポリソーム画に焦点を当て、私への応答/r.
マウス単離蛍光灌流モデルと持続灌流、30 分虚血流入なしと虚血後再灌流の 30 分, 30 分後の基底条件下で収穫された組織を使用決定しました。心臓組織を可溶化し、ショ糖密度勾配をポリソームを区切ってそれぞれプロテオーム解析と Mrna と PCR、マイクロ アレイ、miRNAs の選択的検出が続きます。このメソッドの組み合わせを表す NSPs、マイクロ Rna、mRNA の同時検出だけでなく、nontranslating の分数の間調節タンパク質、マイクロ Rna、mRNA の再配布を有効にするプロテオームを理解するための強力なアプローチ低効率ポリソームと高効率ポリソーム (図 1参照)。この過程の動的調節への洞察力は、神経: Eif2 など mTOR 因子のリン酸化の詳細な分析によって拡張されます。これらの個々 のステップは、今詳細に説明します。

<table><tbody><tr><td>安楽死のための</td><td>ペントバルビタール</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td></tr> ヘ<tr><td>パリン</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>ランゲンドルフ準備</td></tr><tr><td>鉗子</td>で使用される <td>ファインサイエンスツール</td><td>91110-10</td>は<td>、心臓を吊るすために使用される</td></tr><tr><td>ランゲンドルフシステム</td><td>Radnoti +自家製</td><td>n / a</td><td>カスタム吹きガラス、チューブ、ウォーターバスからなる「4つの心臓」システム</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>クレブス緩衝液およびスクロースグラジエント</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>クレブス緩衝液および溶解緩衝液</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>クレブス緩衝液</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>クレブス緩衝液</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td>クレブスバッファ</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>クレブス緩衝液</td></tr><tr><td>ショ糖粉末</td><td>Σ</td><td>S0389-1KG</td><td>ショ糖勾配</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>ショ糖勾配および溶解緩衝液</td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>Σ</td><td>T1503-1KG</td><td>ショ糖勾配および溶解緩衝液</td></tr><tr><td>キシレン シアノール</td><td>Σ</td><td>X-4126</td><td>ショ糖勾配</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>ショ糖勾配および溶解緩衝液</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>溶解緩衝液用RNAse阻害剤</td></tr><tr><td>イゲパル CA-360 (NP40)</td><td>シグマ</td><td>I3021</td><td>溶解緩衝液</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠、EDTAフリー</td><td>ロシュ</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、薄壁、超透明、13.2 mL、14 mm x 89 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離</td>機 <td>ベックマン</td><td>LE-80K</td><td>グラジエントの超遠心分離</td></tr><tr><td>ローター</td><td>ベックマン</td><td>SW41</td><td>グラジエントの超遠心分離</td></tr><tr><td>バイオロジック LP (ポンプ)</td><td>バイオラッド</td><td>731-8300</td><td>グラジエントの分画</td></tr><tr><td>バイオフラク</td><td>バイオラッド</td><td>741-0002</td><td>グラジエントの分画</td></tr><tr><td>エッペンドルフ RNA/DNA LoBind 微量遠心チューブ、2 mLチューブ</td><td>シグマ</td><td>Z666513-100EA</td><td>グラジエント画分とRNA抽出</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>AM9738</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼ コントロール RNA</td><td>プロメガ</td><td>L4561</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>クロロホルム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>C606-4</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>グリコーゲン、RNAグレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0551</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマ</td><td>I9516</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ</td><td>E7023-1L</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>iScript cDNA合成キット</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>逆転写</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>定量PCR</td></tr><tr><td>miRNeasyマイクロキット (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>全RNA単離キット</td></tr><tr><td>miScript II RTキット (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>miRNA逆転写キット</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCRキット (200)</td><td>Qiagen</td><td>の218073</td><td>キット miRNAのリアルタイムPCR発現分析用</td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>1.5 mLまたは2.0 mLチューブを異なる温度で遠心分離します。最高速度 - 21130 x g</td></tr><tr><td>遠心分離機 5810R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>異なる温度でのリアルタイムPCRプレート遠心分離用。最大速度 - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal</td><td>Cycler Bio-Rad</td><td></td><td>逆転写用</td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>リアルタイムPCR解析用</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>RNA単離の品質管理用</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear</td><td>バイオ・ラッド</td><td>HSP9641</td><td>リアルタイムPCR分析用</td></tr><tr><td>マイクロシール 'B' PCRプレート シーリングフィルム、接着剤、光学</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MSB1001</td><td>リアルタイムPCRプレートシーリング用</td></tr><tr><td>研究用プラスシングルチャンネルピペット、グレー; 0.5-10 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P20</td><td>Gilson</td><td>F123600G</td> ピ<td>ペッティング用</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic Pipets, P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>レイニン L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS ピペット 100-1000 & マイクロ;L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td> グリコーゲン、RNAグレードの<td>ピペッティング用</td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0551</td><td>総RNA単離効率を向上</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL チューブ、ナチュラルカラー</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>RNA単離および保存; 試薬ミックス</td></tr><tr><td>サーマルサイクリングチューブ -0.2 mL 個別キャップ、標準0.2 mLチューブと光学的</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>逆転写反応</td></tr><tr><td>シャープ 10 精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1096-FR</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>シャープ 20 精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1121</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>シャープ 200 精密バリアチップ</td><td>デンビル</td><td>P1122</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>チップ LTS 1 mL フィルター</td><td>レイニン</td><td>RT-L1000F</td><td>ピペッティング用</td></tr><tr><td>miScript Primer Assay (200)</td><td>Qiagen</td><td>(miRNAにより変化します)</td><td>リアルタイムPCR解析用</td></tr><tr><td>グラジエントマスター ver 5.3 モデル 108</td><td>BioComp 機器</td><td></td><td>ショ糖グラジエントの調製用</td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>、フィッシャーサイエンティフィック</td><td>、BP172</td><td></td></tr>、<tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>、Gbiosciences、</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>、シーケンシンググレード、改変トリプシン、ブタ</td><td>、プロメガ</td><td>V5111、</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸アンモニウム</td><td>、BDH</td>、<td></td>BDH9206<td></td></tr><tr><td>ギ酸、オプティマLC/MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、オプティマ LC/MS</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 LoBind チューブ 0.5 mL</td><td>エッペンドルフ AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 LoBind チューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB &micro;溶出プレート30 & micro;m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac濃縮器</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC トラップカラム PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>LC 分離カラム PepMap RSLC C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite イオントラップ質量分析計</td><td></td></tr><tr><td>MSConvert ソフトウェア</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer-SEQUEST ソフトウェア</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

動的プロテオミクスおよび mirna 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

タンパク質翻訳のダイナミックな変化の研究では、特殊なメソッドを必要とします。ここで虚血と再灌流ポリソームのプロファイリングと相まって分離灌流マウスの心臓を使用する新規合成される蛋白質の変化を調べた。タンパク質翻訳のダイナミックな変化をさらに理解する私たちは (ポリゾームまたはポリソーム) ゾル性細胞質のリボソームで読み込まれたともミトコンドリア ポリソームを回復し、mRNA とタンパク質の分布を比較して Mrna を特徴と、高効率分数 (多数リボソームが mRNA に付着)、低効率 (少ないリボソームが付着) ミトコンドリア ポリソームと非翻訳分画も含まれています。Mirna が翻訳されているが, 翻訳の効率を減らす Mrna に関連付けることも、分数の miRNAs の分布を調べた。グローバル ・虚血、再灌流の 30 分後と 30 分の終わりに、基底の灌流条件下で Mrna、Mirna、および蛋白質の分布を調べた。この分析を達成するために使用されるメソッドの紹介-特に、これとしてショ糖密度勾配からの蛋白質の抽出の最適化へのアプローチはないの前に記載されている-いくつかの代表的な結果を提供して。

mRNA の解析 mRNA の結果は、各画分 (図 3 a); 特定の mRNA の分布として表現できます。定量化, polyribosomal 翻訳分数を結合および非翻訳分数 (図 3 b)、nontranslating の分数に変換する mRNA の豊かさの割合を提示に比較します。追加情報は、高効率ポリソーム分数低効率ポリソーム分数を個別に (または nontranslating 分数とは別) を調べることによって得られます。(どこ彼らは彼らのターゲット Mrna のタンパク質翻訳を妨げる) 低効率分数に富む Mirna を解析するとき、これは特に重要です。
代表は、翻訳と nontranslating の分画マウス心は虚と虚血/再灌流を行った後にその分布に比べて偽の変更は、<strong class="x...

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム プロテオーム解析に関してポリソーム分数の解析法について述べる。

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

この方法は、動的タンパク質合成とプロセスに関与するプロテオームに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、翻訳対象として選択されているmRNA、プロセスに関与して翻訳を妨害する可能性のあるマイクロRNA、およびタンパク質の翻訳に寄与するタンパク質またはそれ自体が翻訳されているタンパク質を同定できます。この方法は、ストレスに対する心臓の反応に関する洞察を提供するだけでなく、他の臓器のストレスに対する急性反応の研究にも適用できます。この手順を実演するのは、Jennifer Van Eykの研究室のプロジェクトサイエンティストであるMiroslava Stastnaです。実験当日は、グラジエントミキサーの左側のコンパートメントに5ミリリットルの15%スクロース勾配溶液を充填し、右側のコンパートメントに5ミリリットルの50%スクロース勾配溶液を充填します。タップを開けてポンプのスイッチを入れ、マグネチックスターラーで2つの小さなコンパートメントを攪拌し、2番目のタップにリンクされたチューブを使用して、混合ショ糖溶液を氷上の薄い壁を持つ単一の超遠心チューブに流します。次に、新鮮または凍結した心臓組織を、ろ過した溶解バッファー中のPOLYTRONで氷上で15秒間ホモジナイズします。インキュベーションの最後に、ライセートを遠心分離して不溶性物質を除去し、上清を回収します。タンパク質測定、RNA単離、およびRNA完全性分析のために50マイクロリットルの上清を確保し、残りの上清を100〜500マイクロリットルをグラジエント溶液の上に重ねます。新鮮な溶解バッファーを使用して、2つのグラジエントチューブ間の容量のバランスを取り、スイングバケットローターを備えた超遠心分離機でサンプルを超遠心分離します。遠心分離の前後にショ糖の勾配を乱さないように十分注意してください。グラジエントを収集するには、フラクションコレクターをプログラムして、収集の最初の3分間を破棄し、254ナノメートルでの吸光度を連続的に監視しながら、4分から19分までの17のフラクションで1分あたり1ミリリットルの速度で重、軽、非翻訳のフラクションを収集します。各フラクションが集められたらすぐに氷の上に置きます。次に、サンプルがすぐに処理されない場合は、摂氏マイナス80度でサンプルを保管します。ポリソーム画分からタンパク質を抽出するには、収集したショ糖画分を3つの最終画分に結合し、画分を重、軽、非翻訳としてマークします。各サンプルの0.5ミリリットルを、60マイクロリットルの100%トリクロロ酢酸(TCA)と混合します。フラクションを暗所で摂氏マイナス20度で一晩インキュベートします。翌朝、サンプルを氷上で解凍してから、遠心分離によりタンパク質をペレット化します。上清を捨て、遠心分離ごとにマイナス20°Cの0.5ミリリットルの冷やしたアセトンでペレットを2回洗浄します。TCA沈殿後、ペレットが完全に溶解し、必要に応じてパルス超音波処理を使用して完全な可溶化を確保していることを確認します。最後の洗浄後、ペレットを風乾してから、360マイクロリットルのTris-HClバッファーに再懸濁します。次に、40マイクロリットルのジチオスレイトールを加えて、摂氏55度で45分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、50マイクロリットルのヨードアセトアミドをサンプルに加え、光から保護された室温でシェーカーで30分間インキュベートした後、トリプシンとタンパク質の重量比が1対50でサンプルを分解し、摂氏37度で一晩振とうします。翌朝、冷却した後、サンプルを短時間遠心分離し、10%ギ酸でpHを2〜3に調整してトリプシン活性を急冷します。サンプルを脱塩するには、まず96ウェルプレートのウェルで吸着剤を200マイクロリットルのメタノールで3回コンディショニングし、次にウェルあたり200マイクロリットルの0.1%ギ酸で3回コンディショニングします。次に、サンプルを各ウェルにロードし、洗浄ごとに200マイクロリットルの0.1%ギ酸でサンプルを3回洗浄します。重力とそれに続く低真空を使用して、サンプルを50%アセトニトリル中の100マイクロリットルの0.1%ギ酸で2回溶出させ、サンプルごとに1つの低タンパク質保持0.5ミリリットルチューブに溶出します。次に、濃縮器を使用してサンプル溶出液を乾燥するまで蒸発させ、質量分析のために各トリプシンペプチドペレットを 50 から 100 マイクロリットルの 0.1% ギ酸に再構成します。mRNA 分析は、各画分中の目的の特定の mRNA の分布を評価するため、または各画分における mRNA 存在量の比として、組み合わせたポリリボソーム翻訳画分と非翻訳画分を定量化および比較するために実行できます。例えば、ここでは、マウスの心臓を虚血または虚血再灌流にさらした後の翻訳画分と非翻訳画分にわたるmRNA分布の変化を、偽心臓治療と比較して示しています。この代表的な実験では、プールされた重画分中のマイクロRNAのサブセットを分析した結果、虚血時には22個のマイクロRNAがポリソームに関連し、9個は虚血と再灌流時に関連し、7個は両方の条件に共通していることが明らかになり、マイクロRNAの結合が虚血と再灌流のストレスに応答して動的であることが示されました。さらに、ミトコンドリアリボソームタンパク質の大部分は軽度画分で同定され、細胞質リボソームタンパク質の大部分は、重分画と軽分画の両方で共通して同定されました。この手順を試みるときは、ショ糖の勾配に細心の注意を払うことを覚えておくことが重要です。ポリソーム画分からタンパク質を抽出するためのTCA沈殿法は、高濃度のショ糖を含む画分を処理する能力と、質量分析によって同定されたタンパク質の数の両方に基づいて、ワークフローで選択されました。一般に、この方法を初めて使用する人は、ショ糖勾配の再現性に関連する課題のために苦労する可能性があります。TCA沈殿は、タンパク質を沈殿させるのに必要な量が少量で、ペレットがチューブの底部で視認でき、沈殿中にスクロースが蓄積しないため、有利です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

と一緒にランゲンドルフモード単離心臓の灌流、...

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心筋梗塞後の成体マウス心臓からのシングルセルRNAシーケンシングのための非心筋細胞懸濁液の調製

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動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

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