Name: 体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ 犬の好中球からNET形成を蛍光顕微鏡で可視化・定量する方法。citH3発現の評価により、免疫応答メカニズムの理解と他種への応用可能性を示す実験手法です。

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対応する著者モリス動物財団 (D15CA-907) によって資金を供給されました。研究は、カリフォルニア大学、デービス、馬の健康センター、コンパニオン動物保健センターからの資金によって支えられました (2016-24-F)。著者は、数字とギー グエンについて彼女のビデオで彼女の援助ジーナ Ng を認めたいと思います。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校利用委員会によって承認された (プロトコル番号: 18338)。
1. 採血
<ol><li>21 G 針を用いた注射器吸引頭部または頸静脈いずれかから 10 mL の血液を描画します。</li>
	<li>過剰な剪断応力を避けるためには、血液をヘパリン ナトリウム (75 USP) を含む尿管に転送する前に注射器から針を削除します。やさしく数回チューブを転倒させる抗凝固剤と血液の適切な混合を確実にします。氷の上にサンプルを置く前に血栓や赤血球凝集体の証拠を確認します。</li>
</ol>2. 好中球の隔離
<ol><li>冷たい Dubecco のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (pH 7.4、二価のカチオン類なし) の等量と高血圧症血液を希釈します。(0.9% 塩化ナトリウム溶液中に溶けてロイコノ ストック属属) から 3% デキストランの 25 mL を含む 50 mL ポリプロピレン円錐管に希釈血液を 8 mL を転送します。集計と赤血球の沈降を許可する 30 分間室温で直立管を配置します。</li>
	<li>5 mL 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブで密度勾配メディアの上にレイヤー白血球・血漿 (図 1) の 5 mL の慎重に。2 ソリューション11を混在させないよう注意します。</li>
	<li>400 x g加速/減速を室温で 30 分間 0 (ブレーキなし) (A/D) セットでチューブを遠心します。</li>
	<li>血清ピペット 5 mL を使用してプラズマと末梢血単核球 (PBMC) の層 (図 1) をバイパスすることにより顆粒細胞層を収集します。汚染を最小限にするたびに新しいピペットを使用します。</li>
	<li>核 (PMN) 細胞層の 4 に 6 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐管に配置します。赤血球集合体の少量は、多形核白血球層と共に吸気可能性があります、ので管の底で決済している赤血球凝集体を取り除きます 1 mL の血清ピペットを使用します。</li>
	<li>冷たい純水 20 mL と残りの赤血球を溶解させます。複数回 30 〜 60 のチューブを軽く反転冷たい 1.8% 塩化ナトリウム溶液の等しい量を追加する前に適切な溶解を確認します。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間、0 A/D セット 112 x gで遠心分離機します。</li>
	<li>このペレットが赤表示されている場合は、赤血球溶解手順を繰り返します。血清ピペットを使い、慎重に上澄みを廃棄し、優しく DPBS (デキスト ロース 5 mM、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2および 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.3) を 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。すべての再懸濁細胞を組み合わせるし、氷の場所します。</li>
	<li>自動細胞分析装置を使用してセル数を数えるため、検定によって数を確認してください。必要に応じて、(1,000 rpm, 5 min) の収集を使用してスライド ガラスに Pmn を集中し、セルの合計数のうち好中球の数をカウントすることによって好中球の割合を決定します。</li>
	<li>Stroberらに従ってトリパン ブルー色素排除試験を実行することによって好中球の生存を確認します。12 100 %95 から、生存率をもたらすべきである分離を成功させると、好中球が 95% 以上にする必要があります。</li>
	<li>% 生存率と好中球 % 総セル数を掛けることによって好中球の濃度を決定します。分離を成功させるは、6 x 106/mL に 1.5 から好中球濃度を得られるはず。</li>
	<li>Ph 7.3 に調整 5 mM デキスト ロース、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2、および 1% ウシ血清アルブミンを含む DPBS で 1 x 106/mL の最終的な集中に好中球を希釈します。</li>
</ol>3. ライブ好中球蛍光顕微鏡
<ol><li>多 L リジンの各ウェルに好中球 (1 x 106/mL) 400 μ L に場所 200 コーティング 12 ウェル培養プレートです。アドロイに 30 分の 37 ° C で井戸の底に付着する好中球を許可します。</li>
	<li>1 μ m の 2 つの核酸の染料の一つ、汚れをそのまま膜細胞の 1 つ、1 つは細胞透過性膜 (材料の表を参照してください)、室温で 10 分間で汚れ、核酸のラベルを付けます。</li>
	<li>100 μ g/mL リポ多糖 (LPS) (大腸菌O55 と好中球をアクティブにします。B5)、100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 肯定的な制御または 37 ° C で 180 分のネガティブ コントロールとして DPBS の相当量として</li>
	<li>GFP を使用して画像を取得 (励起: 470/22 nm、発光: 525/50 nm) とテキサス赤チャンネル (励起: 585/29 nm、発光: 628/32 nm) 次の時点で 40 倍の倍率で蛍光顕微鏡: 30、90、120、180 分。</li>
</ol>4 純数量および蛍光抗体法を用いた純成分の検出
<ol><li>12 ウェル培養プレートのウェルに 18 mm 直径ポリ-D-リジン コーティング カバー スリップを慎重に配置します。井戸に適切にラベルを付けます。</li>
	<li>種子の 100 に 200 μ L は、カバーガラスの上に直接好中球 (1 × 106/mL) を分離し、37 ° C、30 分で細胞を培養によってカバー スリップを遵守する好中球を許可します。</li>
	<li>3.3 で説明したように、好中球をアクティブにします。200 µΜ と好中球を前処理によるネットの形成を阻害する Cl-アミジン (15 分、37 ° C) 李らによって前述の活性化の前に13実験で適切な車両制御 (DMSO) が含まれていることを確認してください。</li>
	<li>微細鉗子でカバー スリップを慎重に取り外します。浅い井戸を作成し 4% の 2 〜 3 滴を配置するテスト チューブ スタンドにパラフィン フィルム シートを層ごとよく10の PFA。井戸に適切にラベルを付けるし、優しく PFA で満たされた井戸の上に逆さまカバー スリップを横たわっていた。20 分間室温で固定します。</li>
	<li>次に 1 つの井戸から移動して 3 回 5 分 DPBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>直後に、好中球の活性化と固定 immunolabelling を実行できない場合は、カバー スリップの顔アップ吸収紙の上に配置することによって乾燥空気になるカバー スリップを許可します。さらに詳しい分析まで最大 1 週間 4 ° C でラベルの 12 ウェル培養プレートの表側のカバー スリップを格納できます。3 回の次のステップに進む前に 4.4 で説明されているように同じ技術を使用して 1 分の DPBS セルを洗浄します。</li>
	<li>セルを permeabilize 優しくカバー スリップ逆さまに置く 4.4 で説明されている手法を使用して 1 分の NP 40 1% のドロップ。ロッカー上で 1 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>ランダムに各サンプルの数を割り当てる、ダイヤモンド ポイント マーカーを使用して、それに応じて、coverslips にラベルを付けます。</li>
	<li>準備とラベル個々 ペトリ皿パラフィン フィルムと並び、(バッファー ブロッキング) フィルムに 5% ヤギ血清の 100 に 200 μ L を配置します。ブロック バッファーに、coverslips を逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。</li>
	<li>一次抗体の希釈 (1: 400 ウサギ ポリクローナル抗シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 5% ヤギ血清中)。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。</li>
	<li>二次抗体の希釈は 5% ヤギ血清に蛍光体 (レバレッジ) に共役。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>ミエロペルオキシダーゼ (MPO) の同時検出 Li et al.によって説明するよう変更された二重反応プロトコルの次の手順に従います13
</li>
	<li>パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。各カバー スリップ逆さまに置く 10% ウサギの 100 に 200 μ L 穏やかな揺動 (一晩、4 ° C、暗闇の中で) の下で血清。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>50 μ g/mL 非ヤギ抗うさぎ Fab フラグメント暗闇の中のロッカーに室温で 2 時間のセルを孵化させなさい。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>一次抗体 (1: 200 ウサギ ポリクローナル抗 MPO 抗体) 5% ヤギ血清を希釈します。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>5% ヤギ血清に蛍光標識二次抗体を希釈し、前述の 4.8 を孵化させなさい</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>干渉コントロールを作成するには、免疫ラベルの 2 番目の手順でいずれかの一次抗体の孵化を除きます。</li>
	<li>300 で DNA を染色 nM の 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole、塩酸 (DAPI) 室温で暗闇の中で 5 分間。</li>
	<li>暗闇の中のロッカーに 1 分の DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>スライド ガラスに antifade フィルターとフィルターのドロップ (~ 50 μ l) を適用します。そっと逆さま coverslip 細胞とをマウントする前に余分なバッファーを削除する吸収紙の上のカバーガラスの端をタップします。メディアをマウントする必要があります、coverslip とスライド ガラスの薄い層を形成します。空気の泡を削除するには、非常を軽く押して、coverslip 微細鉗子で。</li>
	<li>4 ° C で暗闇の中で一晩治すためサンプルを許可します。浸漬レンズと顕微鏡分析のためメディアをマウントを強化してください。暗闇の中で 4 ° C にサンプルを格納します。</li>
</ol>5. 好中球細胞外トラップ定量化
<ol><li>盲目のオペレーターの集録および実験条件に顕微鏡画像を解析します。</li>
	<li>それぞれのチャンネルの下の実験で各 coverslip の異なった地域からランダムに 10 の画像を取る蛍光顕微鏡を使用すると、40 倍の倍率で。露出時間、明るさおよび各チャンネルのコントラスト画像の取得で一貫して保持されますを確認します。</li>
	<li>利用可能なソフトウェア ImageJ (NIH) などを使用して画像を分析します。CfDNA、citH3、MPO (図 3 a, B) の共局在に基づくネットを識別します。ネットと各実験条件の 10 のランダムなフィールドにおける好中球の数を定量化します。リリース ネットの数字は比率として表現できます (ネット数: 好中球の合計数) 各実験条件のため。</li>
	<li>細胞内 citH3 式の治療効果を評価するには、細胞内 citH3 と好中球の数とそれぞれのチャンネルで (の下で 40 倍の倍率で 10 のランダムな分野で細胞内 citH3 なしの好中球の数を数える図 3、赤い矢印)。細胞内 citH3 式は、細胞 citH3 細胞内 citH3 なしの好中球の数と好中球数の比として表現できます。</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
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<li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+Double-edged+swords+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: Double-edged swords of innate immunity.</a> The Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li>
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<li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dogs+cast+NETs+too%3A+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li>
<li>Letendre, J. A., Goggs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+cell-free+DNA+concentrations+in+dogs+with+sepsis%2C+trauma%2C+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Emergency+and+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia.</a> Journal of Veterinary Emergency and Critical Care. 27 (3), 307-314 (2017).</li>
<li>Jeffery, U., Gray, R. D., LeVine, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Fluorescence+Assay+for+Quantification+of+Canine+Neutrophil+Extracellular+Trap+Release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), (2010).</li>
<li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+Blue+Exclusion+Test+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, (2015).</li>
<li>Li, R. H. L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307(2012).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4%3A+functional+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

セル側の透過物色素と細胞の非透過性染料を使用して生活の犬好中球の核形態と cfDNA リリースで変化を観察するためのプロトコルをご紹介します。このアッセイの主な利点は、できるネット形成のリアルタイム計測セル固定せずライブ好中球における高分解能顕微鏡によってしたがって、体外ネット形成を観察するためのシンプルで貴重なツールを提供します。以来、このアッセイは、NET コンポーネントの検出のための抗体を必要としない、種特異的な抗体の限られた供給に種の NETosis の勉強に最適です。この試金を使用して、著者を示した犬の好中球が組合又は PMA クロマチン decondensation を受ける前に NETosis13刺激。この手法の主な欠点は、それが NETosis のために特定ではないです。セルの非透過性色素は、壊死細胞の核酸または核酸分離好中球からリリースも汚れ、ために、cfDNA またはセルの非透過性陽性細胞はネットまたは NETosing の好中球として誤って解釈でした。また、その PAD4-阻害剤の Cl アミジンと前処理、PMA または LPS 活性化の好中球を含む...

好中球が顆粒球短命の病原体の侵入に対する最初の防衛を担当です。伝染のサイトに募集、好中球は貪食、脱顆粒反応と活性酸素種 (ROS)1の生成による微生物を排除します。細菌やエンドトキシンの存在下で好中球リリース好中球細胞外トラップ (ネット)、細胞のクロマチンの構成は (MPO)2ヒストンとエラスターゼとペルオキシダーゼのような顆粒内蛋白で装飾されています。ネットでは、不可欠な抗菌特性を持っていますが、実験と臨床の証拠が増えている敗血症時にあまりに熱心なネット形成が複数臓器不全と死3,4、につながる可能性があります。5,6。
ネットは、犬同様の病態生理学的役割を再生可能性があります、ために、ネットの形成を減少または防ぐ治療上の介在は敗血症動物における新しい治療戦略として役立つかもしれない。このため、信頼性の高い手法を評価し、NETosis と犬の NET コンポーネントを数値化するために必要があります。NET コンポーネント (cfDNA) DNA ヌクレオソームなどは以前犬の好中球および臨床犬7,8,9からプラズマで評価されています。蛍光アッセイを使用して、ゴッグスと Letendre 発見健康犬8より cfDNA のハイレベルがある浄化槽犬。これらの技術は高度に客観的・定量的な NETosis のマーカーとして cfDNA とヌクレオソームの測定が非特異的 NETosing 好中球以外壊死細胞から得られるので。ここで好中球 NETosing ライブの挙動を調べる蛍光顕微鏡を利用した手法について述べる。また、ネットと MPO など犬の好中球10citH3 コンポーネントを主観的に定量化する二重反応を使用して修正されたプロトコルの詳細します。

<table><tbody><tr><td>デキストラン Leuconostoc spp.</td><td>シグマ</td><td>31392</td><td>分子量 450,000 &ndash; 650,000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>With divalent cateions</td></tr><tr><td>Dulbecco'S Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Without divalent cations</td></tr><tr><td>E. coli O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO ; stains in cells with permeable membranes</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>DMSO 中 1 mM; 無傷の膜を持つ細胞の染色</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine コーティングされたカバースリップ</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>直径 12 mm</td></tr><tr><td>抗シトルリン化ヒストン H3 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>非標識ヤギ 抗ウサギ Fab フラグメント</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>特異性:IgG (H+L)</td></tr><tr><td>抗ミエロペルオキシダーゼ抗体</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

病原体の侵入に対し、好中球は DNA のヒストンと抗菌タンパク質の細胞ネットワークである好中球細胞外トラップ (網) をリリースします。過剰なネット形成 (NETosis) 敗血症時に citH3 リリースは複数の臓器障害とマウスとヒトの死亡率に関連付けられて、その犬への影響が知られています。ここで、観察及び定量化 NETosis の全血から犬の好中球を分離する手法について述べる。デキストランの沈降によって生成された白血球リッチ プラズマが市販の密度勾配分離メディアで区切られ、顆粒球の収集細胞数および生存率試験。ライブの好中球におけるリアルタイムの NETosis を観察するには、側の透過物のセルとセルの非透過性蛍光核酸の汚れはリポ多糖 (LPS) またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のいずれかを活性化好中球に追加されます。核の形態とネット形成の変化は、時間をかけて蛍光顕微鏡で観察します。体外NETosis co-3p324 細胞遊離 DNA (cfDNA)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 変更された二重 immunolabelling プロトコルを使用してが特徴です。ネット形成と蛍光顕微鏡を使用して citH3 式を客観的に定量化するネットし、citH3 陽性細胞が利用可能なソフトウェアを使用して盲検の方法で定量化します。この手法は、特定検定犬の好中球の体外容量 NETosis を受けることに。

生きているセルイメージ投射のこのプロトコルを使用すると、調査官は核形態、プラズマ膜の完全性と生活の好中球における cfDNA の存在を観察できます。セルの非透過性核色素の汚れ破損した細胞膜と細胞内核酸を赤。別セル側の透過物の色素は、そのまま細胞膜と細胞の細胞内の核酸をラベル付けします。その治療に関係なく、すべてのままの好中球が緑表示し、刺激 (図 2 a) 後 0 に 30 分で特徴的な葉状核を展示します。PMA 処理好中球の核は、約 60 分葉状の外見を失い、cfDNA (図 2 b) のリリースまで脱凝縮したり続けますし始めます。LP、犬好中球のより遅くより生理学的覚醒剤通常されませんクロマチン decondensation または NETosis で 90 分まで電気刺激を与える (図 2 b)。120 分まで、LPS と PMA 活性化好中球は cfDNA に囲まれて見ることができます。...

全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

この方法は、犬や他の種における好中球細胞外トラップまたはNET形成に関する重要な質問に答えることができます。これらの技術の主な利点には、NET形成の実際のライブ検出と、マイルドペルオキシダーゼやシトルリン化ヒストンH3などのNET成分の同定が含まれます。健康な犬のドナーの頸静脈から10〜20ミリリットルの血液を採取することから始め、過度の共有を避けるために血液をナトリウムヘパリンチューブに分配する前に注射器から針を取り外します。チューブを数回静かに反転させて、血液と抗凝固剤が適切に混合されるようにし、サンプルを氷の上に置く前に血栓や赤血球凝集体を確認します。抗凝固血液を等量の氷冷ダルベッコPBSで希釈し、希釈した血液の8ミリリットルを、ろ過された3%デキストランの25ミリリットルを含む50ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移します。チューブを室温で30分間直立させて、赤血球の凝集と沈降を可能にします。次に、14 ミリリットルのポリプロピレン丸底チューブ内の 5 ミリリットルの密度勾配培地の上に、5 ミリリットルの白血球が豊富な血漿を慎重に重ねます。密度勾配遠心分離後、5ミリリットルの血清ピペットを使用して中間顆粒球細胞層を50ミリリットルの円錐形に移し、多形核細胞と共吸引した赤血球を20ミリリットルの冷水で溶解します。チューブを30〜60秒間静かに反転させて、十分な溶解を確保してから、等量の氷冷1.8%塩化ナトリウム溶液で細胞を洗浄します。チューブを数回反転させた後、摂氏4度で遠心分離します。血清学的ピペットを使用して上清を慎重に除去し、ペレットを100マイクロリットルの細胞培養バッファーに穏やかに再懸濁します。トリパンブルーの除外により、それらの生存率をカウントし、確認します。次に、好中球を細胞培養緩衝液濃度の1ミリリットルあたり10倍から6細胞に希釈します。適切な滅菌技術を使用し、分離プロセス全体を通じて好中球を慎重に取り扱うことが不可欠です。これは、汚染力とせん断力がin vitro壊死および細胞溶解につながる可能性があるためです。蛍光顕微鏡で好中球をイメージングするには、ポリ-L-リジンでコーティングされた12ウェル培養プレートの各ウェルに200〜400マイクロリットルの細胞を加え、摂氏37度で30分間インキュベーションします。好中球がウェルの底に付着したら、適切な蛍光核酸色素で細胞を標識し、室温で10分間放置します。インキュベーションの終了時に、100マイクログラム/ミリリットルのLPS、100ナノモルのPMAをポジティブコントロール、または同量の細胞培養バッファーをネガティブコントロールと同量の37°Cで好中球を活性化します。次に、指定された時点で40倍の倍率で蛍光顕微鏡法により好中球培養物を画像化します。NET定量では、直径18 mmのポリD-リジンコーティングカバースリップを12ウェル培養プレートの個々のウェルに慎重に配置し、実験刺激に従ってウェルを標識します。次に、単離された好中球の100〜200マイクロリットルをカバーガラスに直接播種し、摂氏37度で30分間インキュベーションします。好中球がカバーガラスに付着したら、先ほど示したように、LPS、PMA、またはDPBSを使用して各ウェルの好中球を180分間活性化します。インキュベーションの最後の30分間で、試験管スタンドの上にパラフィンフィルムシートを重ねて浅いウェルを作成し、各ウェルに4%パラホルムアルデヒドを2〜3滴加えます。ウェルに実験的に適切なラベルを付け、細かい鉗子を使用して、各プレートウェルからカバースリップを逆さまにして、対応する適切なPFA充填ウェルに優しく移します。室温で20分後、DPBSの1つのウェルから次のウェルに細胞を移動させることにより、1回の洗浄につき2〜3滴の緩衝生理食塩水で固定細胞を5分間3回洗浄します。細胞を透過化するには、カバースリップを逆さまにして1%NP-40の滴に1分間静かに置き、続いてロッカーで1分間緩衝生理食塩水を3回洗浄します。最後の洗浄後、カバースリップを逆さまにして、100〜200マイクロリットルの5%ヤギ血清を、新鮮なプラスチックパラフィンフィルムで裏打ちされた個別にラベル付けされたシャーレに入れ、37°Cで1時間インキュベーションします。ブロッキングインキュベーションの終了時に、示したように、緩衝生理食塩水でカバースリップを3回洗浄し、ロッキングします。カバースリップを、50〜100マイクロリットルの適切な目的の抗体で、50〜100マイクロリットルのプラスチックパラフィンフィルムで裏打ちされた個々のプラスチックペトリ皿に移し、ロッキングしながら摂氏37度で1時間のインキュベーションを行います。洗浄後、カバーガラスを適切な蛍光色素標識二次抗体とインキュベートし、光から保護された摂氏37度で1時間インキュベートします。二次抗体インキュベーションの終了時に、カバーガラスを緩衝生理食塩水で暗所でロッキングしながら3回洗浄した後、室温の暗所で5分間DAPIによる核酸色素染色を行います。暗所でロッキングしながら1分間緩衝生理食塩水を3回洗浄した後、サンプルごとにスライドガラス1枚に50マイクロリットル滴の退色防止封入剤を塗布し、乾燥したカバースリップを逆さまにして1滴の封入剤に慎重に取り付けます。次に、サンプルを光から保護された摂氏4度で一晩硬化させます。翌朝、各カバースリップの異なる領域から40倍の倍率で10枚の画像をランダムに取得します。すべての無傷の好中球は、処理に関係なく、刺激の0〜30分後に緑色に見え、特徴的な小葉状の核を示すはずです。.約90分後、PMAで処理された好中球の核は小葉状の外観を失い始め、無細胞DNAが放出されるまで凝縮し続けます。LPSは、イヌの好中球よりも遅く、より生理学的刺激剤であり、通常、刺激後90分までクロマチンの凝縮やNETosisを引き起こしません。120分後には、LPSおよびPMA活性化好中球が無細胞DNAに囲まれているのがわかります。LPS刺激細胞と比較して、PMA活性化好中球は、細胞不透過性色素による染色によって証明されるように、原形質膜の完全性を失います。刺激を受けていない好中球は、潜伏期間を通じて小葉状の核と無傷の原形質膜を維持する必要があります。LPSによって180分間刺激された好中球は、近くの好中球のすぐ近くで目立たないウェブ状のNET足場を生成します。対照的に、PMA活性化好中球は、面積が著しく大きい大量のNETを生成します。実際、必須NET成分である細胞内シトルリン化ヒストンH3を触媒する酵素の強力な刺激剤であるPMAは、刺激を受けていない好中球やLPS刺激された好中球と比較して、細胞内シトルリン化ヒストンH3を発現する細胞の数が多くなります。このアッセイを実施する際には、オペレーターが顕微鏡画像を取得して分析し、実験条件を知らされないようにすることが非常に重要です。これらの手順の半分には、ELISAやフローサイトメトリーなどのアッセイを実行して、細胞内のシトルリン化ヒストンH3をさらに定量することができます。刺激を受けていない好中球またはペプチジルアルギニン阻害剤であるクロリドアミジンで治療された好中球のいずれかからなるネガティブコントロールを含めることを忘れないでください。また、一次抗体と二次抗体の希釈率を異なるで試験し、非特異的な結合と干渉を最小限に抑えることをお勧めします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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標識済み好中球における好中球細胞外トラップの誘導と可視化

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イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

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高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

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パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

熱誘導抗原検索と二重免疫標識プロトコルを用いてホルムアルデヒド固定およびパラフィン埋め込みネコの心原性動脈血栓中の好中球外細胞トラップ(NET)を同定する方法について述べた。...

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

ここに提示されるのは、 in vitro...

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

好中球細胞外トラップ(NET)はさまざまな疾患と関連しており、その可視化には免疫蛍光法がよく用いられます。しかし、染色プロトコルは様々であり、多くの場合、1種類の組織しか検査されません。ここでは、マウスおよびヒト組織におけるNETsの染色に一般的に適用可能なプロトコルを確立します。...

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。...

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

学ぶ 犬の好中球からNET形成を蛍光顕微鏡で可視化・定量する方法。citH3発現の評価により、免疫応答メカニズムの理解と他種への応用可能性を示す実験手法です。

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

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