Name: 分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ ヒト歯小嚢幹細胞のマイクロRNAを用いた一過性遺伝子組み換え法。酵素処理と非ウイルス導入により、ゲノム統合リスクなしに治療特性を向上させる安全な再生医療技術を確立します。

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この作品は、ロストック大学医療センター (889018) および湿気がある基礎 (2016-11) の FORUN プログラムによって支えられました。さらに、午後、ジャネットボンドブリル BMBF (VIP + 00240) によってサポートされています。

HDFSCs は、ロストック大学医療センター歯科口腔外科学講座によって提供される抽出の知恵の歯の歯科小胞から分離されています。インフォームド コンセントと書面による承認は、すべての患者から得られました。この研究は、(許可番号 2017年-0158) ロストック大学の倫理委員会で承認されました。
1. hDFSCs の単離
注:親知らずは、細菌汚染を防ぐためには、抽出前にない噴出する必要があります。
<ol><li>
必要な溶液の調製
	<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の準備/ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (P S G) ソリューション: 495 mL の PBS の P S G 溶液 5 mL を混ぜて。4 ° C で 50 mL の因数を格納します。</li>
		<li>HDFSC 培養液の準備: 445 mL 基本培地の 5 ml の抗菌剤、ウシ胎児血清 (FBS) の 50 mL を混ぜます。4 ° C でのストア</li>
		<li>コラゲナーゼ型を準備私貯蔵液 (30 mg/mL): 基礎培地 10 mL では 1% 抗菌剤を添加したコラゲナーゼ型の 300 mg を希釈します。積極的にソリューションをミックスします。0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。コラゲナーゼを 500 μ l 添加のストア因数-20 ° C で保存溶液を型します。</li>
		<li>当期 II 原液 (40 mg/mL) の準備: 1% 抗菌剤を添加した基礎培地 10 mL に Dispase II の 40 mg を希釈します。積極的にソリューションをミックスします。0.2 μ m フィルターを使用して、ソリューションをフィルター処理します。-20 ° C で当期 II 原液を 500 μ l 添加の因数を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手術の手順
	<ol>
<li>十分な量を注入 (最大: 2 mL) 局所麻酔薬の。</li>
		<li>作成し、三つどもえの骨膜を発生させます。舌のフラップを上げる必要はありません。</li>
		<li>骨膜エレベーターのある舌の側面を保護します。</li>
		<li>優しくラウンド ハード金属バリで頬側から遠位骨を加工します。</li>
		<li>骨膜エレベーターと卵胞の組織を緩めます。後部 (第三大臼歯) 鉗子で完全な歯 (生殖) とリュウズを引いて包 (と包) を慎重に取り外します。</li>
		<li>創傷清拭し、NaCl 水溶液中で完全にソケットに水を引きます。</li>
		<li>Vicryl の縫合 (材料の表を参照) で、骨膜を置き換えます。</li>
		<li>口腔内から歯卵胞を外し、PBS/P ・ S ・ G 溶液 50 mL の因数にそれらを置きます。 注:サンプルは、さらに処理まで 4 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
歯卵胞の酵素の消化力
	<ol>
<li>あらかじめ暖かい hDFSC 培と部屋の温度 (RT) PBS/P ・ S ・ G ソリューション。</li>
		<li>私と当期 II 原液コラゲナーゼの種類ごとの 1 つの因数分解しなさい。私は、4 mg/mL 当期 II 500 μ L 各コラゲナーゼのタイプ I および当期 II を 4 mL の基底の中の含まれている 1% 抗菌剤の原液を追加して 3 mg/mL 型コラゲナーゼの消化力ソリューションを準備します。</li>
		<li>滅菌シャーレに抽出された卵胞を配置し、摘出された組織を洗浄する PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL を追加します。この洗浄工程を 2 回繰り返します。</li>
		<li>約 1 mm × 1 mm PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL を含むペトリ皿内滅菌メスの部分を抽出した卵胞をミンチします。</li>
		<li>50 mL の円錐形遠心チューブにシャーレからみじん切りにした組織と PBS/P ・ S ・ G ソリューションを転送します。PBS/P ・ S ・ G 溶液 10 mL をシャーレを洗うし、同じチューブにソリューションを転送します。</li>
		<li>RT で 353 x gで 10 分間の円錐形遠心管を遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>消化液 5 mL を小球形にされた組織に追加します。ソリューションと組織を優しく混ぜます。揺れのインキュベーターで 2 h の CO2を 37 ° C および 5% の混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離機は破棄した上清で 10 分の 353 x gの細胞・組織を懸濁液を消化し、再 hDFSC 培養液 6 mL で得られたペレットを中断します。</li>
		<li>25 cm2種細胞懸濁液は、細胞培養用フラスコと 37 ° C、5% CO2と 20% O2セルを孵化させなさい。 注:組織が完全に消化されていない場合は、細胞培養用フラスコ同様に残りの組織を転送します。</li>
		<li>変更中慎重に 24 h 細胞播種後。その後媒体の confluency まで 3 日を変更します。 注:HDFSCs 細胞播種後プラスチック付着 24 h をする必要があり、媒体を変更するだけで非付着性のセルおよび血液成分から分離することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルを収穫
	<ol>
<li>あらかじめ暖かい hDFSC 培、PBS/P ・ S ・ G ソリューションと右にトリプシン/エチレンジアミン edta 溶液</li>
		<li>培養用フラスコから上澄みを廃棄し、PBS/P ・ S ・ G 溶液 5 mL に合流するセルを洗浄します。</li>
		<li>培養用フラスコに/トリプシン EDTA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C で 3 分間インキュベートHDFSC 培養液 3 mL を培養用フラスコに追加することによって消化力プロセスを停止します。</li>
		<li>15 mL コニカル遠心チューブに細胞懸濁液を移すと破棄した上清で 353 x gで 10 分間の懸濁液を遠心分離し、再 hDFSC 培地の適切な量の餌を中断します。</li>
		<li>セルをカウント: の細胞懸濁液の 10 μ L を混ぜて軽くトリパン ブルー溶液 10 μ L。カウント室に 10 μ L を適用し、hDFSC 細胞量を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hDFSCs のキャラクタリゼーション
<ol><li>
診療
	<ol>
<li>細胞のフローサイトメトリーによる解析のための準備<ol>
<li>必要な溶液の調製<ol>
<li>PBS/EDTA (2 mM) の準備: 996 mL の PBS の EDTA (0.5 M) の 4 つの mL を混ぜて。</li>
				<li>染色バッファーを準備: PBS/EDTA (2 mM) の 995 mL を混ぜて BSA の 5 g。0.22 μ m のフィルター ユニットを使用して、ソリューションをフィルターし、使用まで 4 ° C で保存します。</li>
				<li>パラホルムアルデヒド (PFA) 原液 (4%) を準備: 4 g PFA 100 mL の PBS を希釈し、80 ° C への解決策を熱ソリューションをミックスし、7.3 に pH 値を調整します。因数は、使用までそれぞれ金額 (1.5 mL)、-20 ° C で店で PFA ソリューションを得られます。 注意: PFA 煙は有毒なので、換気の発煙のフード PFA ソリューションを準備します。</li>
			</ol>
</li>
			<li>セル (1.4) を収穫後 1.5 mL 遠心チューブに 5 x 10 の4セルの 14 サンプルを転送します。4 ° C で 10 分間 300 x gで懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。 注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。特に明記しない限り、細胞と氷に試薬を維持します。</li>
			<li>再染色バッファー (4 ° C) の特定の量で細胞を中断し、FcR 試薬 (4 ° C) を表 1に示すようにブロックを追加します。</li>
			<li>表 1に示されるように、それぞれのサンプルの内側に次の抗体を追加: アロフィコシアニン (APC) マウス抗ひと (cd29);APC マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールペリジニン クロロフィル蛋白質 (PerCP)-Cyanine5.5 マウス抗ひと CD44;PerCP Cyanine5.5 マウス IgG2b κ アイソタイプ コントロールV500 マウス抗ヒト CD45;V500 マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールフィコエ リスリン (PE) マウス抗ひと CD73;PE マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールPerCP Cyanine5.5 マウス抗ひと CD90;PerCP Cyanine5.5 マウス IgG1 κ アイソタイプ コントロールマウス抗ひと CD105: Alexa Fluor (AF) 488;マウス IgG1 負の制御: AF488;PE Cyanine7 マウス抗ひと CD117;PE Cyanine7 マウス IgG1、κ アイソタイプ コントロール。抗体は、各サンプルに追加されている後の抗体スピンダウン、軽く混ぜます。4 ° C で 10 分間ソリューションを孵化させなさい</li>
			<li>1 mL の PBS (4 ° C) を追加し、遠心分離機の 4 ° C で 10 分間 300 x g でサンプル上清を捨てます。</li>
			<li>100 μ L の PBS (4 ° C) で細胞を再停止し、PFA (4%) の 33 μ L を追加します。ソリューションをミックスし、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C の氷の上を格納します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>細胞のフローサイトメトリーによる測定 注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。測定まで氷の上の細胞を保ちます。<ol>
<li>表面抗原の発現を検討するには、流れフローサイト メーターによる測定に適したチューブにサンプルを転送します。</li>
			<li>流れの cytometer を使用して少なくとも 2 × 104イベントを測定します。図 2に示すように分析します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HDFSCs の多能性の微分の潜在性
	<ol>
<li>市販ヒト間葉系幹細胞機能同定キットを使用して、脂肪細胞、骨、hDFSCs の軟骨分化を確認します。脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4) の汚損のためのロバの反やぎ AF488 二次抗体を適用、アグリカン ロバ抗マウス AF488 二次抗体オステオカルシンの汚損のためだけでなく。核の染色, 4', 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) でメディアをマウントを使用します。 注:ネガティブ コントロールとして検の一次抗体なしサンプルを準備します。</li>
		<li>共焦点レーザー顕微鏡による蛋白質の表現を分析します。顕微鏡設定: 40 x 目的は油浸;(AF488) のための励起レーザー 488 nm、405 nm (DAPI) ため。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hDFSCs のトランスフェクション
<ol><li>セル (1.4) を収穫後 24 ウェルの細胞培養プレート トランスフェクション前に 24 h の hDFSCs をシードします。 注:ウェルあたり約 4 × 10 の4の細胞は、細胞密度を開始します。電池が当日 transfection の ~ 80% の合流点に達する必要があります。 注: は、フローサイトメトリーによる解析のコントロールとして追加のセルの 1 つのサンプルをシードします。</li>
	<li>トランスフェクション錯体の合成 注:RNases からの汚染を防ぐためには、直接 RNase 除染液を用いたトランスフェクションの複合体の準備する前にワークスペースをクリーンします。RNase フリーの材料とソリューションのみを使用します。 注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。<ol>
<li>ミール ストック溶液 (50 μ M) を調製: 再 Cy3 標識前駆体ミール (5 nmol) 100 μ L ヌクレアーゼ フリー水を中断します。因数は、使用までミールそれぞれ量 (5 μ L) の原液と-20 ° C で暗闇の中でストアを取得しました。</li>
		<li>ミール (50 μ M ミール原液の 0.8 μ L) 減らされた血清中の 66.7 μ L での 40 pmol を希釈します。軽く混ぜ</li>
		<li>66.7 μ 減少血清中のカチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬の 0.67 μ L を希釈します。軽く混ぜ、室温 5 分間インキュベート</li>
		<li>インキュベーション後、希釈のトランスフェクション試薬を希釈ミールに追加します。軽く混ぜ、室温に 15 分間インキュベート</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞培養培地に直接滴下準備トランスフェクション錯体を追加します。24 ウェルの細胞培養プレートを前後に揺動で優しく混ぜます。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2、および 20% O2 24 時間で細胞を孵化させなさい。</li>
</ol>4. 遺伝子の解析
注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。
<ol><li>
細胞トランスフェクション後採取 注:同じ 15 mL 円錐形遠心分離機管の 1 つのサンプルのすべての携帯ソリューションを収集します。<ol>
<li>トランスフェクション後、24 h は、それぞれ遠心チューブ内のサンプルの上澄みを収集します。</li>
		<li>1 ml の PBS のセルを洗浄、それぞれ遠心管に PBS を転送、500 μ L を追加/トリプシン EDTA (RT) のセルにします。37 ° C で 3 分間ソリューションを孵化させなさい</li>
		<li>培 (RT) の 1 つの mL を追加してセルとそれぞれ遠心管に転送ソリューションに trypsinization を停止します。4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心分離細胞 注:この時間から特に明記しない限りセルと試薬氷の上を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞のフローサイトメトリーによる解析のための準備
	<ol>
<li>上清を捨てます。再細胞染色バッファー (4 ° C) と 1.5 mL 遠心チューブに転送細胞液 100 μ L を中断します。</li>
		<li>ライブとデッドの細胞を区別するためにアミン反応性染料の 0.5 μ L をサンプルに追加します。優しくソリューションをミックスし、4 ° C で 10 分間インキュベート</li>
		<li>300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心し、細胞 1 mL の PBS (4 ° C) を追加します。上清を捨てます。</li>
		<li>100 μ L の PBS (4 ° C) で細胞を再停止し、PFA (4%) の 33 μ L を追加します。ソリューションをミックスし、フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° C の氷の上を格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞のフローサイトメトリーによる測定 注:むしろ影付きルームで次の作業を実行します。測定まで氷の上の細胞を保ちます。<ol>
<li>流れフローサイト メーターによる測定に適したチューブにサンプルを転送します。</li>
		<li>細胞生存率及びフローサイト ミール吸収効率を調べる。少なくとも 2 × 104イベントを測定します。図 4で示すゲートの戦略を使用します。 注:Cy3 陽性細胞のゲーティングを手配し、トランスフェクションによって細胞死を計算します、融合細胞をネガティブ コントロールとして使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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成体幹細胞は現在いくつかの変性疾患の治療のための焦点に。特に、骨髄 (BM)-由来幹細胞、造血幹細胞 (造血) を含む、MSCs では、集中的な臨床調査47。しかし、BM 収穫寄付のサイトで痛みを引き起こす侵襲で、48有害事象につながる可能性があります。最近、産後の歯科組織は小説および幹細胞に簡単にアクセスできるソースとして浮上しています。これらの歯の幹細胞はすべて MSC 特性に合わせて表示され、骨髄由来幹細胞49として高い増殖能力を示した。ここでは、抽出、評価、hDFSCs エンジニア リングのための詳しいプロトコルを提案します。
説明の隔離プロシージャは埋伏智歯の歯の歯科小胞人間にこの組織がよく抽出、19医療廃棄物として処分しました。それにもかかわらず、歯科パルプ50,51</sup...

人間の歯小嚢は、発展途上の歯1,2を取り巻く緩やかな ectomesenchymally から派生した結合組織です。破骨細胞形成と骨延長法歯の噴火プロセスの調整するため、その機能の横には、この組織は、特に歯周組織3,4、5の開発のための茎および祖先のセルを隠し持っています。したがって、歯小嚢は成体幹細胞6,7を収穫するための代替ソースとしてと見なされます。
いくつかの研究人間の歯小嚢の幹細胞 (hDFSCs) の骨芽細胞、歯根膜線維芽細胞と酵素8,9,10を含む歯周の系統に分化の実証.さらに、これらの細胞は自己複製能力、プラスチックの付着、特定の表面マーカーの発現を含む間葉系間質細胞 (MSCs) のすべての特性に合わせて示されていた (例えば, CD73, CD90, CD105) 同様、骨、脂肪細胞と軟骨細胞分化ポテンシャル11,12,13。他の研究はまた、hDFSCs2,14,15,16,17,18の神経の微分の潜在性を明らかにしました。
それらの有望なプロパティとの容易なアクセスのために hDFSCs なった最近ティッシュ工学19,20,21に関連します。最初の研究は、骨、歯周組織を再生する DFSCs の可能性に集中しているし、歯の根19,22,23,24,25,26、 27,28,29,30。HDFSCs の神経因性の機能の知識、神経変性疾患の潜在的な治療として応用以来調査31,32,33。HDFSCs に関しての重要性は益々 も、他の組織 (例えば、角膜上皮)34,35の再生。HDFSC の治療の可能性は、傍分泌活動にも直接微分の潜在性にのみ基づいていません。最近では、hDFSCs は、豊富なマトリックスメタロプロテアーゼ (Mmp)、インスリン様成長因子 (IGF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) と肝細胞の成長などの生理活性因子を分泌する示されています。因子 (HGF)、血管新生、抗炎症、細胞外マトリックスを改造、修復プロセス36の重要な役割を果たしています。
しかし、幹細胞療法の広範な臨床翻訳はまだ大規模な初期細胞死や低有益な幹細胞効果37,38など、いくつかの課題が損なわれます。遺伝子工学はこれらの課題に対処するための有望な戦略を提供し、したがって、幹細胞38,39,40の治療効果を大きく向上できます。一時的なセルの操作マイクロ Rna (miRs) は、適切な候補者は、これらの小さな並進レギュレータ運命と安定したゲノム統合41,42,のハザードの幹細胞の挙動を制御43. までに、いくつかの有益な miRs は幹細胞の増殖、生存、ホーミング、パラクリン活動としていくつか系統44に分化を促進識別されています。例えば、ミール 133a 改善心機未変更の MSCs45と比較した場合、梗塞ラット心における生存率の増加と生着を示した MSCs を設計されています。同様に、ミール 146a 過剰 MSCs 虚血組織46で治療効率につながった VEGF の多量を分泌することが示されました。
この原稿は、選択的な抽出と hDFSCs の遺伝子工学のための詳しいプロトコルを提示します。このため、人間の歯科小胞の収穫と酵素の消化だけでなく、hDFSCs の後続の分離について述べる。隔離されたセルを特徴付けるために MSC プロパティの検証のための重要な手順は、国際細胞治療13学会のガイドラインに従って含まれています。また、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション戦略とトランスフェクション効率性と細胞毒性の評価を適用することによってミール変更 hDFSCs の世代の詳細な説明を提供します。

<table><tbody><tr><td>マウス抗ヒトCD105抗体:Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1557A488</td><td>Clone SN6、モノクローナル</td></tr><tr><td>マウスIgG1ネガティブコントロール抗体:Alexa Fluor 488</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928A488</td><td>モノクローナル</td></tr><tr><td>APCマウス抗ヒトCD29</td>抗体<td>BDバイオサイエンス559883</td><td></td><td>クローンMAR4、モノクローナル</td></tr><tr><td>APCマウスIgG1、&κ;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>クローン MOPC-21、モノクローナル</td></tr><tr><td>PE マウス 抗ヒト CD73 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550257</td><td>クローン AD2、モノクローナル</td></tr><tr><td>PE マウス IgG1、&κ;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>クローン MOPC-21、モノクローナル</td></tr><tr><td>PE-Cy7 マウス 抗ヒト CD117 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>339217</td><td>クローン 104D2、モノクローナル</td></tr><tr><td>PE-Cy7 マウス IgG1、&κ;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>557872</td><td>クローン MOPC-21、モノクローナル</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 マウス 抗ヒト CD44 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>クローン G44-26、モノクローナル</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 マウス IgG2b、&κ;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>の 558304</td><td>クローン 27-35, モノクローナル</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 マウス 抗ヒト CD90&nbsp;抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>561557</td><td>クローン5E10、モノクローナル</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5マウスIgG1、κ;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>55095</td><td>クローン MOPC-21, モノクローナル</td></tr><tr><td>V500 マウス 抗ヒト CD45 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560777</td><td>クローン HI30, モノクローナル</td></tr><tr><td>V500 マウス IgG1, &kappa;アイソタイプコントロール抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>560787</td><td>クローンX40、モノクローナル</td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td>0.5M, pH 8.0</td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>0.22 & micro;m、放射線滅菌済み、ポリエーテルスルホン</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>メルクミリポア</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>ヒト間葉系幹細胞機能同定キット</td><td>R&D Systems</td><td>SC006</td><td></td></tr><tr><td>RNase除染ソリューション;RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cy3標識前駆体 miR;Cy3 色素標識 Pre-miR ネガティブコントロール #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17120</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM17110</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬;リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>還元血清培地;Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Donkey抗ヤギIgG(H + L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td>、<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td>ポリ<td>クローナル</td></tr><tr><td>Donkey抗マウスIgG(H + L)高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td>、<td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>ポリクローナル</td></tr><tr><td>封入体。DAPI付きフルオロシールド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>組織学封入剤</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSS LSRIIフローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN2011ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA溶液 (0.05%/0.02%)</td><td>PBS中のBiochrom</td><td>L2143</td><td>、w / o:Ca2 + 、Mg 2 + < / sup</td></tr><tr><td>>アミン反応性染料;ライブ/デッド&トレード;固定可能な近赤外死細胞染色キット</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td></tr><tr><td>P-S-G (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Basal medium;ダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物 F-12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質、ZellShield</td><td>Biochrom</td><td>W 13-0050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I 型</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ II</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>フィルター、Sterifixシリンジフィルター0.2 &micro;m</td><td>ブラウン</td><td>4099206</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp;mL 円錐形遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心分離管</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ 75 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,910,002</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、25 cm2</td><td>Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>凍結培地、バイオフリーズ</td><td>Biochrom</td><td>F 2270</td><td></td></tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>377267</td><td>1.8 mL</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>0.4 %</td></tr><tr><td>計数室</td><td>ポール・マリエンフェルド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>局所麻酔薬、キシロシチン (塩酸リドカイン) 2% エピネフリン (アドレナリン) 0.001%</td><td>Mibe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl 溶液</td><td>ブラウン</td><td></td><td>0.9 %</td></tr><tr><td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td><td>Ethicon</td><td></td><td>3 - 0</td></tr></tbody></table>

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ rna を用いた遺伝子組み換え

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

日には、発達段階別にいくつかのタイプの幹細胞は、変性疾患の治療のための焦点。まだ、初期大規模な細胞死と治療効果は低いなどの特定の側面は、広範な臨床翻訳障害。移植前に幹細胞の遺伝子工学は、治療の幹細胞の効果を最適化する有望な方法として浮上しました。しかし、安全で効率的な遺伝子送達システムはまだ欠けています。したがって、適切な手法の開発には、幹細胞ベースの治療の現在の課題を解決するアプローチがあります。
この議定書では、彼らの非ウイルス性遺伝子組み換えだけでなく、抽出と人間の歯小嚢の幹細胞 (hDFSCs) の性質について説明します。産後の歯小嚢は、高拡散潜在性を有する多能性幹細胞を収穫するための有望で、簡単にアクセスできるソースとして発表しました。記載されている分離の手順は、埋伏智歯の歯から hDFSCs を収穫する、シンプルで信頼性の高い方法を示します。またこのプロトコルには、単離細胞の幹細胞の特性を定義するメソッドが装備されています。HDFSCs の遺伝子工学、最適化されたカチオン性脂質ベースのトランスフェクション戦略に細胞毒性を引き起こすことがなく有効にする非常に効率的なマイクロ Rna の導入を示します。マイクロ Rna は、これらの小さな並進レギュレータは運命と安定したゲノム統合の危険なしで茎セルの動作を制御、一時的なセルの操作に適した候補です。したがって、このプロトコルは、その治療の有効性を最適化するために重要となる hDFSCs の工学の安全で効率的な手順を表します。

人間の歯小嚢の組織から hDFSCs を収穫する詳細な分離命令を紹介します。ルーチン手術中に歯小嚢への簡単アクセス、ため成体幹細胞の抽出のための有望なソースです。
孤立した hDFSCs は、MSCs13の定義に記述されているすべての特性を示した。実際には、細胞がプラスチック付着下培養条件を説明し、線維芽細胞のような形状 (図 1) が表示されます。フローサイトメトリーによる解析では、CD45 と CD117 は欠席 (図 2) (cd29)、CD44、CD73、CD90 CD105 を含むある特定の表面抗原のパネルを hDFSCs に表現を明らかにしました。また、脂肪細胞、骨および特定の in vitro における細胞の軟骨分化培養条件 (FABP4) 脂肪酸結合蛋白質 4 の染色、オ...

このプロトコルでは、人間の歯小嚢から抽出された歯の幹細胞の一時的な遺伝子工学について説明します。適用の非ウイルス性変更戦略は治療幹細胞製品の改善のための基礎になることがあります。

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

この方法は、ヒト歯卵胞幹細胞を遺伝子操作して治療特性を改善できる場所など、再生医療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、安定したゲノム集積の危険なしにマイクロRNA導入によって幹細胞を改変できることである。2つの卵胞の酵素消化の手順を開始し、前温から室温、ヒトの歯包幹細胞またはhDFSC培養液およびPBSPSG溶液に予め温める。コラゲターゼタイプIとディスパスIIストックソリューションの各アリコートを解凍します。コラゲラーゼタイプIストック溶液500マイクロリットルと1%抗生物質を含む基底培地の4ミリリットルにジスパーゼIIストック溶液500マイクロリットルを加えることによって消化液を調製する。ヒトの歯包幹細胞分離洗浄バッファーおよび使用される培養培地中の部位汚染を避けるためには、抗生物質剤が含まれなければならない。抽出した歯包を滅菌ペトリ皿に入れます。10ミリリットルのPBSPSG溶液を加え、抽出した組織を洗浄します。吸引し、溶液を捨てて、洗浄を繰り返すために新鮮なPBSPSG溶液を追加します。滅菌メスを使用すると、抽出した卵胞を約1 x 1ミリメートルであれば粉々にミンチする。ペトリ皿から50ミリリットルの円錐遠心管に細かく組織とPBSPSG溶液を移し、10ミリリットルのPBSPSG溶液でペトリ皿を洗い、同じチューブに溶液を移します。円錐管を室温で353 x gで10分間遠心する。5ミリリットルの消化液をパレット組織に加え、溶液と組織を穏やかに混合し、37°Cで混合物を2時間振る振るインキュベーターで5%CO2でインキュベートする。2時間後、消化した細胞と組織懸濁液を室温で10分間353gで遠心分離する。上清を捨て、得られたパレットを6ミリリットルのHDFSC培地で再中断する。細胞懸濁液を25平方センチメートルの細胞培養フラスコに播種し、37°Cで細胞をインキュベートする。HDFSCの細胞収穫および特性評価がテキストプロトコルに記載されているようにした後、24ウェル細胞培養板中のhDfsをシードする。摂氏37度、CO25%、酸素20%を24時間インキュベートします。翌日、マイクロRNAの40ピコモールを66.7マイクロリットルの減少した血清培地で希釈し、溶液をボルテックスした。0.67マイクロリットルのカチオン脂質を希釈し、66.7マイクロリットルの還元血清培地でトランスフェクション試薬、溶液をボルテックス、室温で5分間インキュベートする。5分後、希釈済みのトランスフェクション試薬に希釈済みのマイクロRNAを加え、溶液を混合し、室温で15分間インキュベートします。次に、調製したトランスフェクション複合体を、ドロップワイズで、細胞上の培養培地に直接加える。24ウェル細胞培養プレートを前後に揺らすことで、穏やかに混ぜます。24時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。トランスフェクションの24時間後、各15ミリリットル円錐形遠心分離管にサンプルの上清を集める。1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄し、PBSをそれぞれの遠心管に移します。500マイクロリットルの点滴とEDTAを細胞に加え、24ウェルプレートを摂氏37度で3分間インキュベートします。トリプシンを停止するには、細胞に対して1ミリリットルの細胞培養培地を添加し、溶液をそれぞれの遠心管に移します。細胞を300 x gで遠心し、摂氏4度で10分間遠心します。特に明記されていない限り、ここから氷の上に細胞と試薬を保管してください。上清を捨て、細胞を100マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁し、細胞溶液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移した。生細胞と死細胞を区別するために、各サンプルに0.5ミリリットルのアミン反応性染料を加えます。溶液を軽く混ぜ、摂氏4度で10分間インキュベートします。細胞にPBSを1ミリリットル、遠心分離機を300g、摂氏4度で10分間加え、上澄み物を捨てて100マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁し、33マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを加え、溶液を混合し、サンプルを水量計まで光から保護して4°Cで保存します。フローサイトメトリック測定に適したチューブにサンプルを転送し、テキストプロトコルに記載されているゲート方式を使用してフローサイトメトリーを実行します。分離されたヒト歯包幹細胞は、間葉間質細胞の定義に関して記載されたすべての特徴を示し、細胞はプラスチック付着性であり、標準的な培養条件下で形態のようなガラス繊維を示した。フローサイトメトリック解析では、hDfsがCD29、CD44、CD73、CD90、CD105を含む特定の表面抗原のパネルを発現することが明らかになった。CD45とCD117は不在であった。特定のIn Vitro培養条件下での細胞の脂肪異性、骨形成性、および軟骨発生性分化ポテンシャルを、免疫染色、脂肪酸結合タンパク質:骨カルシン、およびアグレカンによって確認した。細胞毒性とCy3標識マイクロRNA取り込み効率の定量化に使用される格言戦略はトランスフェクション後24時間で、生細胞の100%におけるマイクロRNA取り込みが確認された。トランスフェクトおよび未感染サンプルの死んだ細胞の同等量は、マイクロRNAが細胞毒性作用を及ぼすことなしに効率的に導入されることを示している。この手順に従って、細胞膜の可塑性のような追加の質問に答えるために、トランスセノニテーションのような他の方法を実行することができます。

isolation-characterization-microrna-based-genetic-modification-human

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法...

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

継続的に成長しているマウスの門歯は、歯科上皮幹細胞（DESCs）から歯の組織の更新を研究するためのモデルを提供します。一貫して確実切歯からこれらの細胞を取得し、in vitroでそれらを拡張するための堅牢なシステムをここで報告されている。...

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

我々は、分離、表現型の特徴およびマウス歯肉からの免疫細胞の機能解析のための手法を確立しました。...

単離、特徴付けおよび歯肉免疫細胞ネットワークの機能検討

成体幹細胞の生物学を研究するための理想的なモデルは、マウスの毛包です。ここでは、マウスの背側皮膚の酵素消化とそれに続くFACS分析を使用して、毛包幹細胞と表皮ケラチノサイトの異なる集団を分離するためのプロトコルを紹介します。...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

歯包は上皮集団および間葉細胞を含んでいる。上皮集団は、異なる培養培地を提供することにより異種の歯包細胞集団から選択した。上皮細胞は生き残り、無血清培地でコロニーを形成した。...

ヒト歯包からの上皮細胞の分離

我々は、ヒトの歯から出発して上皮オルガノイド培養を開発するためのプロトコルを提示する。オルガノイドは堅牢に拡張可能であり、アメロブラスト分化能を含む歯の上皮幹細胞を再現する。このユニークなオルガノイドモデルは、歯の再生アプローチの視点を持つヒト歯科(幹細胞)生物学を研究するための有望なツールを提供します。...

ヒト歯からオルガノイドを機構研究・再生医療への強力なツールとして確立

この記事では、外植片培養法を使用した歯髄幹細胞の初代培養を確立するための段階的なガイドと、ICSCRTガイドラインに基づくこれらの細胞の特性評価について説明します。このプロトコルによって単離された細胞は、さらなるアプリケーションのための間葉系幹細胞と見なすことができます。...

歯髄幹細胞の初代培養

このプロトコルは、酵素消化による歯髄からの多能性幹細胞の抽出、培養、および保存に重点を置いています。さらに、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化する可能性を示しており、プロセスの精度と一貫性の重要性を強調しています。...

ヒト落葉歯および永久歯からの歯髄幹細胞の単離、培養、および特性評価

不均一なヒトUC-MSCを構成する3つの主要なサブグループの1つであるBAMBI高MFGE8高 MSCの単離は、このサブタイプの特性と機能を完全に理解するために役立ち、特定の疾患における臨床効果を改善するための将来の応用に役立ちます。ここでは、BAMBIの高MFGE8高...

ヒトBAMBI高MFGE8高 臍帯由来間葉系間質細胞の単離

学ぶ ヒト歯小嚢幹細胞のマイクロRNAを用いた一過性遺伝子組み換え法。酵素処理と非ウイルス導入により、ゲノム統合リスクなしに治療特性を向上させる安全な再生医療技術を確立します。

分離の特性と人間の歯小嚢細胞のマイクロ Rna を用いた遺伝子組み換え

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