遺伝的変異、短期目標と交配試験場でRNA の形態学的組織コンテキストに点突然変異を可視化
August 14th, 2018
ここでは、単一細胞レベルで単一ヌクレオチド分解能で 50 ヌクレオチドとして短いシーケンスの特異的かつ高感度の検出を可能にするの in situハイブリダイゼーション アッセイについて述べる。手動でまたは自動的に実行できます、アッセイは、スプライスバリアント、短いシーケンス、および組織のコンテキスト内での突然変異の可視化を有効にできます。
この方法は、脳や腫瘍の微小環境における細胞種特異的な発現やスプライスバリアントの空間マッピングなど、神経科学、腫瘍学などの重要な研究課題に取り組むことができます。この技術の主な利点は、単一細胞において、組織状況におけるエクソン接合部、短い配列、および点変異を非常に高い感度と特異性で検出できることです。その手順を実演するのは、私たちの研究室のアソシエイトサイエンティストであるヘル・ピメンテルです。
組織を調製するには、解剖直後に室温で10%中性緩衝ホルマリンで16〜32時間固定します。その後、サンプルを標準的な手順で処理し、パラフィンに包埋します。埋め込まれた組織をミクロトームを使用して5つのプラスマイナス1ミクロンのセクションに切断します。
セクションを静電接着性のスライドガラスに取り付け、室温で一晩風乾します。RNA NC2ハイブリダイゼーションアッセイを実施する1時間前に、マウントされた組織スライドをスライドラックに置き、摂氏60度の循環エアオーブンでベークします。RNA NC2ハイブリダイゼーションアッセイを開始する前に、ハイブリダイゼーションオーブンが摂氏40度に設定されていることを確認してください。
加湿紙を十分に濡らし、残留水を取り除き、フタを湿度調整トレイに置きます。180ミリリットルの水に20ミリリットルの10Xターゲットリトリーブ試薬を加えて、市販の1Xターゲットリトリーブ試薬200ミリリットルを調製します。2つのスライドホルダーをスチーマーに入れます。
1つのスライドホルダーに200ミリリットルの1Xターゲットリトリーバル試薬を充填し、もう1つのスライドホルダーに200ミリリットルの水を入れます。蒸し器を使用して、両方の溶液を沸騰するまで加熱します。50Xウォッシュバッファーを摂氏40度に10〜20分間温めます。
次に、予熱した50X洗浄バッファー60ミリリットルを2.94リットルの水で希釈して、3リットルの1X洗浄バッファーを調製します。ドラフト内で、100ミリリットルの水に100ミリリットルのギルヘマトキシリンを加えて、50%のギルヘマトキシリン対比染色溶液を調製します。250ミリリットルの水に1.43ミリリットルの20〜30%水酸化アンモニウムを加えてブルーイング試薬を調製します。
プローブハイブリダイゼーションの前に、ターゲットプローブを摂氏40度で10分間予温します。アンプ0〜6の7種類の増幅試薬を室温に戻します。サンプルの脱パリフィン化を開始するには、オーブンから切片を取り出し、取り付けた組織スライドをキシレンに5分間攪拌しながら浸します。
新鮮なキシレンで5分間再度デパリフィンします。100%エタノール中で2分間撹拌しながら脱水します。そして、新鮮な100%エタノールで2分間再度繰り返します。
スライドを完全に乾かすまで、循環式エアオーブンで摂氏60度で5分間自然乾燥させます。次に、切片を約4滴のすぐに使用できる過酸化水素と室温で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。スライドから溶液をデカントし、水で2回すすぎます。
切片を予熱した水に短時間浸し、次に切片を100°Cのターゲット回収試薬の200ミリリットルにスチーマーで15〜30分間置きます。ターゲットリトリーバルからスライドを取り出し、水で2回すすいでください。100%エタノールに3分間浸します。
次に、スライドを循環式エアオーブンで摂氏60度で完全に乾かすまで乾燥させます。スライドが乾いたら、疎水性ペンを使用して、セクションの周りに約0.75 x 0.75インチの疎水性バリアを描きます。バリアを室温で1分間完全に乾かします。
スライドをスライドホルダーに入れ、スライドホルダーを事前に温めた湿度制御トレイに置きます。各スライドに約4滴のプロテアーゼ3を加え、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で15〜30分間インキュベートします。スライドから溶液をデカントし、水で2回すすぎます。
プローブハイブリダイゼーション手順を開始するには、すぐに使用できる適切なプローブ溶液を約4滴追加して、切片全体を覆います。プローブを摂氏40度でハイブリダイゼーションオーブンで2時間ハイブリダイズします。スライドから溶液をデカントし、スライドを室温で200ミリリットルの1X洗浄バッファーで洗浄し、時折2分間攪拌します。
洗濯手順を繰り返します。次のステップは、一連の増幅試薬の切片をインキュベートすることにより、シグナルを増幅することです。Amp 0を約4滴加えて各スライドの全セクションを覆い、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で30分間インキュベートします。
次に、溶液をデカントし、スライドを室温で200ミリリットルの1X洗浄バッファーで洗浄し、時々2分間攪拌します。洗濯手順を繰り返します。同様に、Amp 1 から Amp 6 までの切片を、この回路図に示されている温度と時間でインキュベートします。
スライドを一連の増幅試薬で処理した後、Fast Red色素ワーキング溶液を調製します。チューブ内にFast Red-B色素とFast Red-A色素を適量加え、よく混ぜ合わせます。スライドから余分な液体をデカントし、Fast Red染料ワーキング溶液をスライドに加えます。
スライドをカバー付きのトレイに室温で10分間インキュベートします。10分後、Fast Red溶液をデカンタし、水道水で上下に沈めてスライドを2回すすぎます。組織切片を対比染色するには、スライドを室温で50%Gillのヘマトキシリン溶液に2分間浸します。
スライドを水道水で洗い、スライドが透明になり、セクションが紫色のままになるまでこれを数回繰り返します。スライドを02%アンモニア水に2〜3回浸して青みを帯びます。アンモニア水を水道水に交換し、スライドを3〜5回洗います。
スライドを60°Cの循環式エアオーブンで15分間、完全に乾かすまで乾燥させます。カバースリップに1〜2滴のマウント試薬をセットし、気泡が溜まらないようにスライドをカバースリップの上に置きます。スライドを少なくとも5分間風乾します。
最後に、標準的な明視野顕微鏡でスライドを観察します。Double-Z エクソンジャンクションプローブは、2 つのホルマリン固定パラフィン包埋サンプル、または FFPE 膠芽腫サンプルの EGFRvIII 状態を測定するために設計されました。両方の野生型プローブは、両方のサンプルでシグナルを検出し、2つのサンプルが野生型EGFRを発現していることを示しています。
しかし、変異体プローブはEGFRvIII陽性サンプルのシグナルのみを検出し、EGFRvIIIネガティブサンプルのシグナルは検出しませんでした。ポジティブおよびネガティブコントロールプローブをアッセイに含めました。アンティセンスプローブまたはセンスプローブを使用してFFPE細胞ペレットとして調製したJurkat細胞に対してショートターゲットアッセイを行ったところ、CDR3-αおよびCDR3-βの両方のアンチセンスプローブで堅牢な染色が観察されましたが、センスプローブではシグナルはほとんどまたはまったく検出されませんでした。
dapBはネガティブコントロールとして用いられた。このアッセイは、点変異を検出することもできます。この例では、L858R変異EGFR配列を検出するプローブと、EGFR L858野生型配列を検出する
プローブの2つを設計しました。この変異プローブは、EGFR L858R変異のヘテロ接合体であるH1975細胞株のシグナルを検出しましたが、EGFR L858野生型のみを発現するH2229細胞株のシグナルは検出しませんでした。野生型プローブは、両方の細胞株でシグナルを検出しました。この手順を試行する際は、組織を適切に固定し、ポジティブコントロールプローブとネガティブコントロールプローブを実行し、ハイブリダイゼーションオーブンでスライド処理システムを使用することを忘れないでください。
この手順に続いて、細胞マーカーを用いたIHCなどの他の方法を実行して、スプライスバリアントの細胞タイプ特異的発現や短いターゲット配列の同定などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、神経科学、腫瘍学などの研究者が、組織コンテキストで選択的スプライシングイベントを探求し、空間的にマッピングされた点変異を特定し、高度に相同で短い配列をin situで視覚化する道を開きました。中性緩衝ホルマリンとキシレンでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、ドラフトでの作業や個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
概要
この記事では、単一細胞レベルで50ヌクレオチド以下のRNA配列の感度が高く特異的な検出を可能にするin situハイブリダイゼーションアッセイについて紹介します。この方法は神経科学や腫瘍学を含む様々な分野に適用可能で、組織内でのスプライスバリアントや変異の可視化を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 分子生物学
背景
- in situハイブリダイゼーションは遺伝子発現を研究するための強力な技術です。
- 単一細胞レベルの解像度により細胞の不均一性の詳細な分析が可能になります。
- スプライスバリアントや変異の検出は疾患メカニズムを理解する上で重要です。
- アッセイは手動または自動で実施でき、その利用しやすさを向上させます。
研究の目的
- 高感度で短いRNA配列を検出する方法を開発すること。
- 組織サンプルにおける遺伝子発現パターンの可視化を可能にすること。
- 様々な生物学的文脈における細胞タイプ特異的発現の研究を容易にすること。
使用した方法
- ホルマリン固定とパラフィン包埋を用いた組織サンプルの準備。
- ハイブリダイゼーション用に薄い切片に組織を切断すること。
- ターゲット回収試薬とハイブリダイゼーションプローブの使用。
- 検出を強化するための一連の試薬を用いた信号の増幅。
主要な結果
- アッセイはエクソンジャンクションと点変異の検出に成功しました。
- 単一細胞分析で高い特異性と感度が達成されました。
- 脳と腫瘍組織におけるスプライスバリアントの可視化が示されました。
- この方法は様々な研究分野でより広範な応用可能性を示しました。
結論
- このin situハイブリダイゼーションアッセイは分子生物学研究のための貴重なツールです。
- 単一細胞レベルでの遺伝子発現に関する洞察を提供します。
- この技術は複雑な生物学的プロセスと疾患の理解を助けることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate detection of RNA biomarkers in their native tissue context is critical for target validation and biomarker-driven drug development in oncology and neuroscience. This RNA in situ hybridization assay enables sensitive and specific visualization of splice variants, short sequences, and point mutations at single-cell resolution, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker alignment. By preserving spatial information lost in grind-and-bind methods, it enhances predictive confidence in preclinical target selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing exon junction-specific splice variants like EGFRvIII and METΔ14 in tissue context.
- Operational Value: Provides single-cell resolution data to clarify pathway activation and cellular heterogeneity in tumor microenvironments.
- Scientific Value: Supports functional target validation by distinguishing mutant from wild-type alleles at single-nucleotide resolution (e.g., EGFR L858R, KRAS G12A).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects RNA targets as short as 50 nucleotides, enabling CDR3 sequence profiling in immune repertoires for immuno-oncology target discovery.
- Operational Value: Compatible with automated staining platforms, supporting assay standardization and scalability across preclinical programs.
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts that aid in assay optimization and reproducibility assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease relevance through detection of clinically actionable variants in FFPE glioblastoma and cell line models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining morphological context during molecular analysis.
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking genetic variants to cellular phenotypes in tissue sections.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, particularly where spatial validation of genetic alterations informs target confidence and de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splice variant functionality and mutation impact in native tissue architecture.
- Screening: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening via spatially resolved target confirmation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-cell measurements of RNA variants that help compare experimental conditions and allelic ratios.
- Translational Research: Connects molecular findings to histopathological context, supporting biomarker-driven patient stratification models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for longitudinal monitoring of target expression across models and therapeutic interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity from bulk RNA methods.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized protocols compatible with manual and automated workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved evidence of target engagement and variant prevalence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on co-expression with phenotypic markers in tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, molecular pathology, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to hybridization ovens, slide processing systems, and automated stainers for high-throughput use.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and bioinformatics for consistent probe design and data interpretation.
- Must account for tissue fixation variables (e.g., formalin penetration time) that may affect accessibility of short or structured RNA targets.
- Limited by target availability; efficacy depends on probe specificity and accessibility of epitopes in FFPE sections.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Tissue Preparation
1:30
Equipment and Reagent Preparation
3:24
Sample Deparaffinization, Dehydration, and Pre-treatment
5:26
Probe Hybridization, Signal Amplification, and Detection
7:18
Counterstaining, Slide Mounting, and Visualization
8:18
Results: Detection of Splice Variants, Short Sequences, and Point Mutation In Situ
10:00
Conclusion
