Name: 分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ、Chlamydomonas由来のセントリオールを多方向に精製し、超高解像度蛍光顕微鏡で単一粒子再構成を行う手法。タンパク質の局在解析や細胞生物学研究に応用可能です。

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我々 は、エコール連邦工科ローザンヌ (EPFL)、中心体のシムの画像を取得したスイス、ローザンヌでピエール ・ Gönczy ・ バイオ イメージング光学系プラットフォーム (BIOP) を感謝します。ニコライ ・ クレナとダビデ ・ Gambarotto は、欧州研究会議 (ERC) 開始助成金 (StG) 715289 (アクセント) とマエバ ル Guennec、ポール ・ ギシャール、スイス科学財団 (SNSF) PP00P3_157517 によってヴィルジニ ・ ハメルによってサポートされます。スザンヌは、ジュネーブ大学でサポートします。

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<li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrioles%2C+centrosomes%2C+and+cilia+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li>
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<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li>
<li>Hirono, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4113102/">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li>
<li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li>
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<li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li>
<li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li>
<li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529(1974).</li>
<li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus%3A+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, Pt 13 2663-2674 (2004).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li>
<li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326(2014).</li>
<li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813(2017).</li>
<li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li>
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<li>de la Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+3D-SIM%2FSMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+%E2%88%BC4-5+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of ∼4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li>
<li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+lytic+enzymes+%28autolysins%29+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+%28hydroxy%29proline-specific+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li>
<li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li>
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著者が明らかに何もありません。

建築におけるタンパク質の正確な局在を解読する生物学の課題の一つです。小体は、そのアーキテクチャは、その長さに沿って微細構造の特徴を明らかに低温電子トモグラフィーを用いた研究されているこれらの方法を適用する理想的な構造です。ただし、光学顕微鏡の解像限界に近いその寸法のため従来の顕微鏡30を使用して中心小体の構造サブ領域に蛍光タンパク質を正確にローカライズすることは困難です。
光学顕微鏡の解像度は、約、200 の横方向の最大解像度を与える光の回折によって限られた光学顕微鏡24nm。ただし、この制限にされている最後の 20 年の主要なブレークスルーの 1 つによってバイパス光学顕微鏡: 超解像法の発明。これらのアプローチは、異なる解像度での回折限界を超えてイメージできる: 120 nm の SIM、約 50 の誘導放出の枯渇 (STED) の nm と単一分子局在顕微鏡 (SMLM)24の 20-40 nm。超解像顕微鏡法のこれらの新しい開発、小体の地域構造が達成可能であります。しかし、実際には、まだ成熟した由来がセルあたりのみ 2 つのコピーし、の解釈になるランダムな方向性があります主な理由の構造要素にタンパク質の局在を正確に判断することは困難です。ローカライズが困難です。このため、画像超解像による多数の由来、非あいまいな方向を観察する機会を増やすことを研究者を許可するプロトコルは設定。重要なは、このメソッドは、分離由来の使用に依存する、我々 は、そのままc. クラミドモナスを浄化する方法を提供して成熟由来と procentrioles を含む由来。
最後に、このプロトコルでイメージを作成することができます中心小体向きの範囲により単一粒子解析適用できる電子顕微鏡のソフトウェアを使用しています。これは、結果、特定の向きの中心体の平均クラスの生成。重要なは、これらの結果の 2 D 画像は小体に沿って特定の蛋白質の局在化を評価するために、使用できます。確かに、この方法は、デュアル色超解像画像に適用できるし、特定セントリ タンパク質に起因する他の色、中心小体スケルトン (例えばチューブリン)、明らかにする 1 つの色を使用できます。1 色または 2 色で得られた平均値を引いて、中心小体 (近位、中央、または遠位) に沿ってタンパク質を登録しやすくなります。任意の誤った解釈を防ぐために 2 つのチャネルする必要があります正確に位置合わせされることに注意してください。また、トップ ビューの平均はセントリ ルーメン、小体の内外微小管壁に沿って内部タンパク質にローカライズする場合に役立ちます。
このメソッドには、異機種混在環境ラベリングのためそれ以外の場合をローカライズすることは困難かもしれない特定の蛋白質の局在を確認するために利点があります。中心粒内の蛋白質をマップする他の方法に記載されている相関の 3-D SIM/SMLM、例えば、周辺のトーラスを形成マーカーの楕円形のプロファイルを決定することによって中心体の特定の方向を評価するに注意してください、SIM イメージングによる中心小体。このパラメーターを使用すると、4-5 nm30の精度をもつタンパク質をローカライズすることが可能です。説明する方法がここでそのまま procentrioles、中心小体アーキテクチャは、大部分は保存される可能性が最も高い記号で分離由来を使用するにも注意してください。しかし、我々 はいくつかのアーキテクチャ上の機能が人間体5絶縁増幅の二価陽イオンの濃度変化中心小体の直径などの浄化中に邪魔を除外できません。
ここで提示されたプロトコルの重要な手順の 1 つは蛍光スパを受けやすいさまざまな方向に十分に集中して孤立した由来を得ることです。これを行うには、最初、純度、中心小体分離処理の効率性を確認します。分離由来の低濃度は、適切な画像と更なるイメージ処理できなくなります。この目的のため、我々 は由来の視野あたりの数を豊かにするためのメソッドを提供しています。使用する分数の中心体の数、に応じて、コンセントレーターに読み込まれているボリューム調整してください、250 μ L の最大音量で。
重要なは、マイナスcw15 C. クラミドモナス細胞細胞壁のこの法を開発しました。この株の細胞壁の脆弱性は細胞の適切な換散とは、したがって、その内容の解放ことができます。このプロトコルが野生型c. クラミドモナスの効率的な細胞、細胞壁は適切な換散を防ぐようです。ここで紹介の隔離のプロトコルを適用する前に細胞壁を変更する場所に置かれる超音波処理や溶解酵素、細胞壁31、低下することが酵素で細胞の前培養などの代替戦略でしょう。
この設定は、高スループット専用超解像顕微鏡まで従来の共焦点顕微鏡から、顕微鏡の種類で使用できます。SMLM の際に、特別なバッファーが適切なイメージングのため必要であるに注意してください、したがって、商工会議所、coverslip の上にバッファーを持つ 12 ミリメートル coverslip の適応を使用する必要があります。その後画像は倒立顕微鏡で実行されます。顕微鏡のセットアップが 12 mm coverslip を許可しない場合、ここで示されるプロトコルは 30 mL 丸底チューブと変更されたアダプターとコンセントレーターを使用して 18 mm coverslips に適用できます。また、固定の方法と同様に、SMLM で最終的な再建の品質が染色の使用、一次抗体の品質に依存することに注意してくださいすることが重要です。
要約すると、蛍光-スパの向きが異なる由来の平均を生成する精度でセントリ タンパク質をローカライズすることで多数の由来が続いてイメージに適用することができますメソッドを提供しています。重要なは、このメソッドより一般的に他の種からの分離の由来、その他の細胞内小器官、または大規模な高分子アセンブリに適用できます。最後に、サンプル準備方法紹介、蛍光 SMLM データ32の単一粒子解析の最近のアルゴリズム開発と組み合わせて、大規模な高分子の分子の地図の更なる改善を開くことができません。アセンブリ。

小体は進化的に保存された細胞小器官動物細胞における中心体の中核に位置しテンプレート繊毛または多くの真核生物1,2鞭毛基底ボディ (以下由来といいます) として使用できます。など、由来は基礎的な細胞生物学的プロセスのシグナルを細胞に紡錘アセンブリに至る重要です。したがって、中心小体アセンブリまたは機能の欠陥に関連付けられていくつか人間キレる ciliopathies と癌の3。
由来は、nine-fold、対称、トリプレット ベース構造が円筒形微小管は、通常、〜 450 nm 長いと ~ 250 nm ワイド4,5,6,7。従来の電子顕微鏡と異なる種から由来の低温電子トモグラフィーは由来が 3 つの領域に彼らの長い軸に沿って偏光は明らかにした: 近位部、中央のコアおよび遠位領域5,7,8,9,10,11します。 重要なのは、これらの領域のそれぞれは特定の構造特徴を表示します。まず、100 nm の長さの近位部の内腔には、ピンヘッド要素12を介して微小管トリプレットに接続されている車輪の構造が含まれています。第二に、300-400 nm の長さの中央部を含む線維密度微小管の内面に沿ってルーメンと構造機能: Y 字リンカー、C 管尾、A 管スタブ9。最後に、50-100 nm の遠位領域中心小体5,13の遠位部分を囲むサブ遠位部と遠位肢を展示します。
最後の二十年は、中心体タンパク質、中心小体14,15,16,の一部である約 100 の異なる蛋白質の現在の推定数の増加の発見によってマークされています。17. これらの進歩にもかかわらずこれらのタンパク質小体内の正確な局在ままとらえどころのない、特に構造のサブ領域内で。重要なは、小体の構造領域に正確な局在の割り当ては、その機能の理解を深めるために重要です。この点で、 C. クラミドモナス由来尽力している両方の面で最初の delimitating シリンダー9,18,19、それから許可に沿ってさまざまな構造機能でサブ構造領域に蛍光顕微鏡を用いたタンパク質のサブセットのローカリゼーションを関連付ける研究者。これは、たとえば、含まれています、タンパク質 Bld12p と Bld10p、近位部と車輪の構造を特にローカライズ20,報21,22,23。ローカライズされた部分構造蛋白質のリストは、POB15、POC16、 C. クラミドモナス由来17の内側中心領域を飾る 2 つの新規タンパク質質量分析法による識別にも含まれます。
このペーパーでは、開発を分離し、その後超解像顕微鏡の単一粒子平均C. クラミドモナス由来のイメージ方法の完全な説明を提供します。この目標を達成するために克服しなければならない技術的な制限を記述することが重要です。まず、中心小体の浄化はしばしば分離9の様々 なステップの中に失われる車輪構造と全体的なアーキテクチャを及ぼします。第二に、小体の寸法が非常に回折限界に近い光学顕微鏡検査です。確かに、共焦点顕微鏡で得ることができる横方向の分解能は約 200 nm24と同様、中心小体とzの解像度の直径-軸は 2-3 倍低い、異方性体積に 。第三に、抗体の標識と中心小体の向きの不均一性は特定セントリ サブ領域でタンパク質をローカライズするために必要な解釈を制限できます。最後に、由来はイメージの大規模な数を取得し、明確な中心小体方向を見つけるが難しく、セル当たりの 2 つのコピーに存在します。これらの技術的な問題を回避するには、多数のさまざまな方向を採用する分離の由来に超解像顕微鏡法を適用することに依存するメソッドを開発しました。まず構造的にそのまま由来と、車輪を含む procentrioles の精製を可能にするc. クラミドモナス由来を浄化するプロトコルについて述べる。その後、中心体を従来のイメージングや超解像蛍光顕微鏡 coverslips に集中するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。この重要なステップは、由来の複数の向きでイメージの数を増やします。最後に、単一粒子の向きが異なる由来の検出を容易に蛍光顕微鏡で取得したデータを平均化を実行する手順を説明します。全体では、このメソッドは、様々 な種やその他の大規模な高分子アセンブリからイメージ由来に適用できます。

<table><tbody><tr><td>マウスモノクローナル抗アファチューブリン(クローンDM1A)</td><td>Abcam</td><td>ab7291&nbsp;</td><td>希釈 1:300</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>ロシュ</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>12 mm カバースリップ</td><td>ロス</td><td>YX03.1</td><td></td></tr><tr><td>18 mm カバースリップ</td><td>ロス</td><td>LH23.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fluka</td><td>60355</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fluka</td><td>60230</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Biosolve Chimie SARL</td><td>0020092391BS</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Carlo Erba 試薬</td><td>524520</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>シグマ</td><td>A-4514</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C-7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>63140-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>steritop filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td>SCGPT05RE</tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>197530010</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem PanReac</td><td>A1694,0250</td><td></td></tr><tr><td>丸底(キンブル)チューブ 15 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-500-34</td><td></td></tr><tr><td>丸底(キンブル)チューブ 30 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-500-37</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス染色ラック</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルポリスチレントランスミッションラボボックス</td><td>フィッシャーズ</td><td>11712944</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>10735086001</tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス Alexa 488&nbsp;</td><td>Alexa</td> 568 に結合した Alexa 568 に結合した <td>A11029</td><td>希釈 1:</td></tr><tr><td></td><td></td><td>1,000</td>ヤ<td>ギ 抗ウサギ</td></tr> アブ<tr><td></td><td>カム</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、薄壁ポリプロピレン</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン 1 mg/mL</td><td>SIGMA&nbsp;</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗ポリグルタミル化修飾 mAb (GT335)</td><td>アディポゲン</td><td>AG-20B-0020</td><td>希釈 1:1,000</td></tr><tr><td>グリセロール封入剤 DAPIおよびDABCO付き</td><td>Abcam</td><td>ab188804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5810R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5811000622</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン JS-13.1スイングバケットローター</td><td>ベックマンコールター</td><td>346963</td><td></td></tr><tr><td>ベックマンSW 32Tiローター</td><td>ベックマンコールター</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ベミス&nbsp;</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>ライカTCS SP8 ハイボリューションモード</td>付 <td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オスラム L18W/954 ルミラックス&nbsp;</td><td>Luxe Daylight/ OSRAM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 濾紙</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>WHA1001325</tr><tr><td>CrSAS-6/Bld12 antibody</td><td></td><td></td><td>dilution 1:300 (Hamel el al., 2014)</td></tr><tr><td>Scipion</td><td>http://scipion.i2pc.es/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

由来は、大規模な高分子アセンブリ細胞分裂、細胞運動、シグナル伝達などの基礎的な細胞生物学的プロセスの適切な実行のために重要です。緑藻クラミドモナスは中心小体のアーキテクチャ、機能、およびタンパク質合成の研究で洞察力に富んだモデルであると証明しました。セントリ アーキテクチャについての偉大な進歩にもかかわらず、現在の課題の 1 つはで彼らの役割を理解するために小体の構造領域内でセントリ コンポーネントの正確な局在を決定することです。中心小体の形成。主な制限は、回折限界に近い寸法でこのオルガネラにおけるタンパク質局在の解釈を複雑にする蛍光顕微鏡の分解能にあります。この質問を取り組むためには、我々 は浄化し、超解像顕微鏡を用いたさまざまな方向とC. クラミドモナス由来の多数のイメージ法を提供しています。この手法は、さらに蛍光単一粒子由来の買収の数が多いため (蛍光 SPA) の平均を使用してデータの処理が可能します。蛍光スパ生成の平均の向きが異なるためセントリ サブ領域の明瞭な蛋白質のローカリゼーションを容易C. クラミドモナス由来の染色します。重要なは、このメソッドは、他の種や他の大規模な高分子アセンブリからイメージ由来に適用できます。

C. クラミドモナス小体分離: C. クラミドモナス細胞由来、 cw15- を分離する光の下で数日間液体文化で育つ, 10 分 Pelleted 細胞に 1x PBS で洗浄したためその後 600 × gで遠心分離によってペレットの再懸濁とは2 分(図 1)の最終 pH 4.5-4.7 0.5 M 酢酸を使用して pH ショックを実行することによって deflagellation する前にバッファーを deflagellation します。1 N KOH 添加 pH を 7.0 に戻すに使用されました。戸建鞭毛を細胞体に区別、deflagellated 細胞は鞭毛の大部分を削除する最初遠心分離しました。ペレットは 2 倍の PBS で洗浄し、25% ショ糖クッション (図 1B) にゆっくりとそれをロードする前に 30 mL の PBS で再停止されます。戸建の鞭毛の大部分を削除する 4 ° C で 15 分間 600 x gでチューブを分離されました。遠心分離後、細胞体がショ糖クッション (図 1C) で広がり、削除して回復、上清 (図 1Cの赤矢印) までの約 30 mL。洗浄のセルの結果 20 mL、20 mL の冷 PBS で再停止されるされ 600 x gで 10 分間遠心分離します。次に、清が破棄され、セルが完全に 10 mL の PBS で再停止されます。セルは、250 mL のボトルに移された、換散バッファーは一度に再懸濁のセルに追加されました。DNase、換散を添加し、4 ° C で 1 時間インキュベート細胞の残骸を削除する遠心分離のステップ後 (図 1Dの白いペレットを参照)、上清を集めた後、慎重に 4 ° C で 30 分間、10,000 × gで遠心分離前に 2 mL 60% ショ糖クッションにロード換散の 100 ml は、8 チューブ 15 ml 12.5 mL のショ糖チューブあたり 2 mL に読み込まれる換散バッファーに対応する、この手順を実行する使用されました。遠心分離の後上澄みのほとんどが削除されたクッションの上 1 mL まで。残りの上清 1 mL、2 mL のクッションを使用して収集、混合し、プール 24 mL の最終的なボリュームを取得します。プールをロードし、40%、50%、70% ショ糖勾配、4 ° C で 1 時間 15 分の 68,320 x gでスピン最後に、分離の由来は針を使用して遠心分離の管の底の部分に穴を作るによって収集された、12 x 500 μ L 分画の滴を集めた。異なるショ糖の高密度のためドロップ形成 (70% ショ糖) 初めしより多くの非常にゆっくりと急速に (40% ショ糖)。
分離由来の蛍光 分離のプロシージャの品質を評価するために各勾配フラクションの 10 μ L coverslip サポート アダプター (図 2 a-2 D) を使用して観察に次いで遠心分離。重要なは、安全に、coverslip、削除するカスタム フック デバイス設計されました (図 2B)。次に、coverslips は蛍光抗体法により分析した.CrSAS-6(Bld12p) 抗体は、車輪構造と α-チューブリン セントリ壁を強調する (DMA1) の存在を示すため、本研究で使用されました。CrSAS 6 と α-チューブリンの視野あたり陽性由来の数をカウントし、分数あたり由来の合計数を計算して、それはどの分画の濃縮された分離由来 (を決定することが可能図 2 階-2 H)。興味深いことに、6 分画はあった最後の分数はなかったが、浄化が働いたことを示す分数 #3 のピークを持つ (図 2 fと2 G分数 #1-6) 由来の濃縮します。この特定の実験で合計由来の 95% CrSAS 6 と α-チューブリン分数 #3 で陽性であったことに注意してください。これは、最も孤立した由来が、側転を保持されることを示します。最初の分数は由来の濃縮を認め、分離のプロシージャは働かなかったし、繰り返す必要があります。由来を欠いている分数でほとんどいくつかのべん毛の作品を観察できることに注意してください。
次に、μ L あたり由来の合計数を計算するため視野あたり中心小体の数は図 2Hに記載されている比かける必要があります。結果の数は、螢光抗体の μ L あたり由来の番号の取得に使用する分数のボリュームで、分けする必要があります。この特定の分離手順で豊かな分数 (92 x 92 μ m2のビューのフィールド) を 0.00846 mm2の面積に約 37 由来に含まれます。チューブのセクションの表面 176 mm2の総表面の半径 7.5 mm であった。対応する比率は当時 176/0.00846、20,803.8 を = 10 μ L の 769,740 中心体 (37 x 20、803.8) の合計。したがって、1 μ L の中心体の数は、76,974 でした。
Coverslips に分離由来の濃度: さらに粒子平均プロシージャで使用することができますと同様の方向を検出する機会の増加し同様、明確な中心小体の向きの検出のチャンスを増加フィールドごと由来の数を増やします。集中の一部分からの由来はまだまばら、coverslip、集中という名前のコンセントレーター coverslip (図 3A) の真ん中に由来する遠心分離アクセサリーを開発しました。本稿では、3次元印刷の正確な対策と .stl ファイルが提供されることに注意してください。
最初に、12 mm の 1 つ coverslip コンセントレーター (図 3B) にマウントされていた。アダプターは、coverslip の上に置かれた、丸底チューブは逆さにして組み立てられたアダプターとコンセントレーター上置します。丸底チューブは、軽く反転サンプル (プロトコル手順 4.2) の読み込みをできるように。中心体は、4 ° C で 10 分間、10,000 × gで遠心分離しました。その後、中心体が蛍光抗体法を受けるし、CrSAS-6/Bld12p と α-チューブリン (図 3-3 e) のステンド グラスします。重要なは、コンセントレーター、なし 183 の由来は、コンセントレーターの使用 (図 3 D-3F) 頃視野あたり見られたに対し、約 30 の由来は各フィールドのビュー (図 3C) 見られました。中心体カバー、coverslip の真ん中に直径 4 mm のディスクのみであることに注意してください。この結果は、濃度ステップ動作でき、coverslips、従って緩和その検出とイメージングの定義済みの領域の中心体の 6 濃縮を示します。
単一粒子を分離の平均蛍光C. クラミドモナス由来: ここでは、約 120 の解像度に到達することができます SIM 顕微鏡を用いた nm、由来 monoglutamylated チューブリン (GT335、図 4)、中心体の微小管にチューブリン変更のため染色されたイメージ24。C. クラミドモナス由来が約 500 nm ペアで常に、長く、しばしば見つけ関連付けられている新しく複製 (以下 procentrioles) probasal 体、微小管関連繊維19紋します。したがって、この最終組み立て約 1 μ m の大きさであった。このため、および全体の中心体をイメージするために、分離の由来に Z スタックを取得をお勧めします。
ここでは、買収後最終的なイメージは、ImageJ28 (画像/スタック/Z プロジェクト/最大強度投影図 4B) を使用して最大強度投影を実行によって生成されました。このようなイメージからクライオ電子顕微鏡のソフトウェアを使用して単一粒子分析由来と同様の方向でのクラスの作成を行い、平均を行った。これを行うには、画像の色は最初オブジェクト (図 4C) を見やすくために逆になった。由来は、Xmipp3 などのいくつかの電子顕微鏡ソフトウェア プログラムを統合する自由に利用できる Scipion ソフトウェア29を使用して各粒子の中央にボックスで手動で選ばれた (図 4D)。ボックスのサイズは、ユーザーによって定義されることに注意してください。ここでは、31.84 のピクセル サイズ 50 × 50 ピクセルのボックス nm が使用されました。次に、すべての粒子が (図 4E) を抽出し、Xmipp3 を使用して、配置 (図 4F)。次に、12 ピクセル半径の円形のマスクはセントリ ペア (図 4G) から各中心小体を分離に適用されました。その後、Xmipp3 を使用して複数回の平均を生成する、粒子分類されました。のみクラス平均から分岐する粒子が手動で除外されたことを意味均等クラス平均は保たれました。この手順は、選択した各方向の完璧に近い平均を生成するために繰り返されました。5 つの繰り返しの後の平均の 2 つのクラスが生成された: monoglutamylated 由来の 98 粒子 (図 4私) から 63 オブジェクト (図 4H) から上面と側面を表示します。オブジェクトの寸法をに沿って monoglutamylation 信号強度プロット プロファイルのピーク間の距離を測定することによって求めた。
重要な側面図クラスの平均の長さは、260 nm 直径 250 nm、中心小体17のコア内長さ 286 ± 33 nm の領域にローカライズする示された測定 monoglutamylated チューブリン信号に匹敵します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> 図 1:精製C. クラミドモナス由来。(A) これはC. クラミドモナス由来の分離に至る各ステップの概略図。上に 25% ショ糖密度勾配遠心分離後の前にプロトコル (B) と (C) の代表的な手順が含まれています。パネルCの赤矢印は、遠心分離後も保持するボリュームの最小値を示します。(D) このパネルでは、遠心分離後分離細胞の白いペレットを示しています。黒い矢印は、ペレットを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> 図 2:遠心分離で蛍光抗体法を実行するセットアップ分離由来。各フラクションの (A) 10 μ L を最初 100 μ L の 10 ミリメートル K パイプ (pH 7.2) で希釈します。(B) これは、観察用のアダプター、12 mm coverslip 15 mL 丸底チューブを包括的な遠心分離装置と遠心分離後、coverslip を回復する特注フック デバイスの概略図です。CとDのパネルは、遠心分離後、coverslip を回復する方法を説明する図面を表示します。(C) 場所アダプターのスロットの端にある穴にフック ツールおよび (D) 慎重に引き出します。(E) 蛍光イメージングを実行に必要な湿気のある商工会議所の写真です。矢印は、12 mm coverslip を示します。(F) 63 X (ズーム 2) グラデーション分数 #1-8、浄化手順中に収集されたので代表的な共焦点画像と CrSAS-6 (赤) と α-チューブリン (緑) のステンド グラスします。インセットは、低い倍率ビューの白いボックスで示される領域に対応しています。スケール バー = 10 μ m. (G) CrSAS-6 と α-チューブリン各画分の視野あたりの由来の正の数を表すグラフです。分数 #1-6 にエンリッチメントに注意してください。由来各画分のフィールドごとの平均数: #1 = 16.3 ± 4.7、#2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23.3 ± 11.4、#5 = 14.3 ± 2.1 #6 = 13.7 ± 9.3、#7 = 2.7 ± 1.2 #8 = 1.0 ± 0.0 #9 = 1.0 ± 0.0 #10 = 0.0 ± 0.0 #11 = 0.3 ± 0.6、#12 = 0.0 ± 0.0。各分画の 3 つのランダムなフィールドをイメージしました。#3 の最も豊かの分数をカウントするとき私たち中心体の 95% が CrSAS 6 と α-チューブリンの肯定的なことを見、(n = 205 由来)。由来、顕微鏡の測定領域内に存在数の (H) の比率を使用して、チューブの領域に存在由来の合計数を計算します。中心小体の数 μ L は、10 μ L もともと遠心分画から計算できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> 図 3: コンセントレーターを使用して分離された由来は、遠心分離します。(A) このパネル由来蛍光、15 mL 丸底チューブ、コンセントレーター、12 mm coverslip サポート アダプター装置など前のカバーガラス上に集中するために必要なの遠心分離デバイスを示しています。(B) このパネルは、遠心分離装置を組み立て手順を示しています。パネルC-Eは、コンセントレーターに染まった CrSAS 6 (赤) と α-チューブリン (緑) (C) なしまたは (のD-E) 由来の共焦点画像を表示します。インセットは、低い倍率ビューの白いボックスで示される領域に対応しています。スケール バーは、10 μ m. 由来 (点線集中領域の境界を表す) coverslip の真ん中に濃縮されていることに注意してください。(F) このグラフでは、ビューのフィールドなしとコンセントレーターあたり由来の数を表します。5 つのランダムなフィールドの表示を行った。由来の平均数は、コンセントレーター、29.8 ± 2.9 とコンセントレーター、182.6 ± 11.5、 P &lt; 0.0001。統計的有意性は、対になっていないtによって評価された-をテストします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> 図 4:単一粒子の平均分離C. クラミドモナス由来。(A) このパネル ショー Z は、由来 GT335 で染色し、SIM 顕微鏡を用いての画像をスタック。(B) これらのパネル スタックのイメージの最大強度 Z 投影を表示します。スケール バー = 1 μ m. (C) これらのパネルを見る代表的な画像コントラストが反転します。良い由来を視覚化するためのズームのはめ込みを表します。(D) これらのパネルを粒子のピッキング。挿入図は、粒子が選ばれた方法を示します。(E) これらは、抽出された 5 例の粒子。このパネル (F) は、配置後の粒子を示しています。(G) このパネルでは、マスクを適用した後、粒子を示しています。パネルH 、私は、2 つのクラス平均を表示: (H) トップ ビュー (63 粒子) と (私) サイドビュー (98 粒子)。二重の矢印は、GT335 信号の大きさを示しています。スケール バー = 250 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
1 の補足ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
2 の補足ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

浄化し、多数の超解像顕微鏡法と平均単一粒子の影響を受けやすい向きが異なる由来のイメージ戦略を開発しました。

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

この方法は、タンパク質をセントリオルの特定の領域に局所化するなど、セントリオイル分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。我々は複数の向きにそれらを得るために中心を集中する手段を提供するこの技術の主な利点。この方法はクラミドモナス中心菌生物学に関する洞察を提供することができるが、孤立したヒトおよびパラメシウム中心子のような他のシステムにも適用することができる。この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生ニコライ・クレナ、もう一人の博士課程の学生マエヴァ・ル・グエンネック、そして研究室Davide Gambarottoのポスドクです。この手順を開始するには、まず、テキスト プロトコルで説明されているように、すべてのメディアを準備し、C.Reinhardtii セルを培養します。調製した細胞を50ミリリットル円錐形チューブに移し、600倍gで10分間遠心分離します。ペレットを50ミリリットルの1x PBSで1回洗い、600倍gで再び10分間回転させます。ピペットを使用して、ペレットを室温脱フラグバッファーの 100 ミリリットルに再懸濁させます。ビーカーを磁気スターラーに置き、0.5モル酢酸を4.5~4.7の最終pHにゆっくりと加えます。この混合物を室温で2分間インキュベートしましょう。この後、pHを7.0に復元するために1つの通常の水酸化カリウムの滴をゆっくりと加え、50ミリリットルのチューブに細胞を移し、遠心分離機を600回gで10分間、剥離した旗毛を除去する。上清を捨て、ペレットを氷の上に保管して、水洗の準備が整うまで保管します。準備ができたら、1回の洗浄で1x PBSの50ミリリットルを1回で2回洗浄します。洗浄したペレットを600g、摂氏4度で10分間回転させます。1x PBSの30ミリリットルでペレットを再懸濁します。その後、25%スクロースの20ミリリットルのクッションにゆっくりと懸濁液を積み込みます。600倍gと摂氏4度で15分間回転し、残りのフラゲラを取り除き、ショ糖中の細胞を広げます。吸引器を使用して、慎重に最下20ミリリットルだけを保つ上清を吸引する。残りのショ糖を20ミリリットルの冷たいPBSを加えて洗います。600倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。ペレットを摂氏4度で10ミリリットルのPBSで再懸濁し、溶液に塊がないことを確認します。再懸濁されたペレットを新しい250ミリリットルのボトルに移し、5,000単位のDNaseを添加したリシスバッファーを細胞を含むボトルに加えます。1時間摂氏4度でインキュベートし、ボトルを慎重に反転させて15分ごとに混合します。50ミリリットルの円錐形チューブと遠心分離機に50ミリリットルの円錐チューブと4°Cで10分間移します。ピペットを使用して、上清を収集し、60%スクロースクッションの2ミリリットルを含む氷の上に30ミリリットルの丸底チューブにロードします。摂氏4度で30分間、10,000倍gでこれを遠心分離します。この後、上清をスクロースクッションの上に1ミリリットルまで吸引する。残りの上清の1ミリリットルとショ糖クッションの2ミリリットルの間の黄色の界面に注意してください。カットP1000チップを使用して、残りの上清とスクロースを軽く混ぜます。すべてのショ糖クッションをプールし、氷の上に保管してください。次に、テキストプロトコルで概説されているように、薄壁の38.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに40%〜70%のショ糖勾配を調製する。プールされたインターフェイスをゆっくりとグラデーションに読み込みます。チューブと10ミリモルK-PIPESバッファーのバランスをとり、遠心分離機を68、320倍g、摂氏4度で75分間バランスを取ります。この後、0.8ミリメートルの針を使用してチューブの底に穴を開け、異なるショ糖層を乱さないようにします。この穴を使用して摂氏4度で12 500マイクロリットル分を集めます。切り取ったP200先端を用いて、免疫蛍光の間に使用される各分画から追加の10マイクロリットルのアリコートを調製する。その後、液体窒素中の分画をスナップ・フリーズします。まず、無菌の12ミリメートルのカバースリップをコンセントレータの凹んだ下端に置き、PDLコーティングされた側面を下に保つようにします。アダプターを上に直接置き、カバースリップをキャップします。次に、丸底チューブを反転し、コンセントレータ、カバースリップ、およびアダプターの上に置きます。ピンセットを使用して、チューブの底に到達するまでアンサンブルを軽く押し、チューブを反転します。それがコンセントレータの上部に到達するまでK-PIPESバッファの10ミリモルを追加します。コンセントレータの中央シリンダーに気泡がないことを確認します。濃縮されたセントオラー分画のアリコートの1つに10ミリモルK-PIPESバッファーの100マイクロリットルを静かに加え、P200ピペットを使用して完全に混合します。次に、濃縮器の中空の中心からK-PIPESバッファーの100マイクロリットルを取り除き、100マイクロリットルのバッファー分率混合物を加え、内容物がコンセントレータの中空の中心に残っていることを確認します。摂氏4度に予冷された遠心分離機で10,000倍gで10分間回転します。この後、ピンセットを使用してコンセントレータを取り外します。アダプターのスロットエッジにある穴に手作りのフック装置を挿入し、カバースリップを回復するために穏やかに持ち上げます。チューブの上部に到達したら、手袋をはめた指を使用してアダプタの端をトラップし、ピンセットを使用してカバースリップを取り外し、カバースリップのどの側にセントリオルが含まれているかを念頭に置きます。次いで、濃縮中心の固定および免疫蛍光染色を行う。まず、調製されたクリスタルポリスチレン透過ラボボックスに中心を含むカバースリップをマイナス20°Cで5分間インキュベートします。ピンセットを使用して、カバーリップを50ミリリットルの1x PBSで満たされた透明な実験室用箱に移します。スライドをPBSで室温で5分間洗います。次いで、ピペット60マイクロリットルの一次抗体が加湿室で実験室のシーリングラップの一部に混入する。慎重にドロップに直面している中心と抗体ミックスの上にカバースリップを置きます。カバーリップを45分間インキュベートします。この後、カバーリップを取り外し、PBSが入った箱の中で5分間洗います。洗浄したカバーリップを45分間インキュベートし、PBS1%BSAおよび0.05%Tween-20で二次抗体を使用します。カバーリップを取り外し、PBSが入った箱の中で5分間洗います。通常のアンチフェージング取り付けメディアを使用して、カバースリップをスライドに取り付けます。次に、デコンボリューションを適用しながら、N.A.の1.4の63X油目的で共焦点顕微鏡上の単離されたセントリオレスを画像化します。Zスタックの上と下の位置をそれぞれ中心信号の上下に設定し、総セントリオイル信号を構成する大きな画像スタックを取得します。スタックを投影し、テキスト プロトコルで説明されているように、単一パーティクルの平均化を実行します。代表的な免疫蛍光は、6つの分画が単離された中心胞に富み、分数3のピークを有し、最後の2つの分数は、精製が成功したことを示すことを明らかにした。コンセントレーターなしでは1つの視野につき約30セントリオールしか見られず、183はコンセントレータで見られます。これは、コンセントレータステップが成功し、定義された領域で6倍のセントリオルの濃縮を可能にし、それらを検出して画像化することを容易にすることを示しています。超解像顕微鏡は、モノグルタミルチル化チューブリンに染色されたセントリオレスを画像化するために使用され、ソフトウェアは、選択された各方向のほぼ完璧な平均を生成するために使用されます。5回の反復の後、2つのクラスの平均がモノグルタミル化された中心胞(63個の物体からのトップビューと98個の粒子からの側面図)で生成された。サイドビュークラス平均の長さは260ナノメートルで、直径は250ナノメートルで、中心のコア内に局地化することが見られる測定されたモノグルタミルレートチューブリン信号に匹敵する。この手順を実行している間、孤立したセントリオルを氷の上に置いておき、隔離後にスナップフリーズすることを忘れないでください。この手順に従って、クライオ電子顕微鏡法および質量分析のような他の方法は、中心または中心タンパク質組成物の天然アーキテクチャのような追加の質問に答えるために行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

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動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

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極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

学ぶ、Chlamydomonas由来のセントリオールを多方向に精製し、超高解像度蛍光顕微鏡で単一粒子再構成を行う手法。タンパク質の局在解析や細胞生物学研究に応用可能です。

分離とクラミドモナス由来の単一粒子再構成のための蛍光イメージング

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