ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1^-/-マウスの T 細胞応答の評価

ジカウイルス感染の間、T細胞はウイルス除去のために免疫特権器官に浸透するが、ギランバレー症候群または精巣損傷のような免疫病原性にも寄与する可能性がある。この技術の主な利点は、ジカウイルス感染時およびワクチン予防接種後の両方で、免疫特権器官における抗原特異的T細胞の四量体ベースの検出を容易にすることである。このモデルでは、ジカウイルス感染はインターフェロンα/β受容体ノックアウトマウスで開始され、脳内のジカウイルス特異的T細胞、精巣、脾臓の追跡が可能になる。

四量体染色法を用いて、ジカウイルス特異的T細胞に浸潤する免疫特権臓器の特性のみを調べ、免疫保護および免疫病原性細胞へのT細胞の寄与を探究することができる。ジカウイルス感染の場合、6〜8週齢のインターフェロンα/ベータ受容体ノックアウトマウスへのレトロ軌道接種を介してPBSの100マイクロリットルでジカウイルスの4つの焦点形成ユニットに1回10を送達する。次に、感染した動物の体重と臨床徴候を毎日15日間監視します。

接種後7日間、感染した動物を手術用フォームの上の位置に固定し、無菌メスを使用して腹部の正中線に沿って皮膚切開を行う。はさみを使って腹筋を開き、肝臓を優しく抽出します。次いで、脾臓を取り除き、組織をPBSで3回リンスして血液を除去する。

最後の洗浄後、すべての脾臓が採取されるまで、氷冷RPMI培地1.5ミリリットルの氷の上に脾臓を置きます。単細胞懸濁液を生成するには、脾臓を無菌の40マイクロメートルメッシュセルストレーナーに50ミリリットルチューブの上に置き、10%のウシ胎児血清(FBS)を添加した氷冷RPMI培地を2ミリリットル加えます。次に、5ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、新鮮な媒体を使用して放出された細胞をメッシュを通して洗浄し、フィルターを通して組織をマセレートする。

遠心分離のために単一細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移し、5ミリリットルの赤血球のリシスバッファーでペレットを再懸濁させる。室温で5〜6分後、2回目の遠心分離のために氷冷RPMIとFBSの10ミリリットルでライシスを停止し、カウントするための完全な培地の10ミリリットルでペレットを再中断します。接種後7日間、安楽死させ、感染した男性のマウスをまな板の上の起こりやすい位置に固定化し、まっすぐな1本ずつの歯の鉗子で頭皮を固定する。

虹彩はさみを使用して頭皮に中線の切開を行い、頭蓋骨を露出させ、鋭いピンセットを使用して鋭いピンセットで軌道の両側をクランプし、脳を固定します。鋭い虹彩はさみの1つの先端を前者のマグナムに入れ、両側の頭蓋骨に横に切り取る。慎重に正中線の上に、鼻に向かって同じ空洞からカットし、脳を傷付けることを避けるために、はさみの先端を可能な限り表面的に保ちます。

鉗子で脳を持ち上げ、鋭い虹彩はさみを使って頭蓋神経線維を慎重に解剖する。次に、鉗子を使用して、5ミリリットルの氷冷RPMIプラスFBSを含む15ミリリットルのチューブに脳を移管します。精巣を分離するには、鉗子で腹部の皮膚を持ち上げ、虹彩はさみを使用して、内面および腹壁を通して縦切開を行い、腹部の最下部を露出させる。

精巣を切開まで押し上げ、ピンセットを使って脂肪層を優しく引っ張り、両側に球状の精巣を露出させる。アイリスはさみを使用して脂肪層と精巣上体を慎重に解剖し、5ミリリットルの氷冷RPMIプラスFBSを含む15ミリリットルのチューブに精巣を移します。収穫した組織のいずれかから単細胞懸濁液を生成するには、50ミリリットルチューブの上に100ミクロンのメッシュを持つ無菌細胞ストレーナーに臓器を置き、2ミリリットルの氷冷RPMIプラスFBSをストレーナーに加えます。

5ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、組織をマッシュし、器官がメッシュを通して完全に粉砕されるまで新鮮な媒体でフィルターを洗います。遠心分離のために単一細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移し、30%密度の勾配媒体の5ミリリットルにペレットを再懸濁する。慎重に新しい15ミリリットルチューブに70%密度の勾配媒体の2ミリリットルの上に細胞溶液を重ね、密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。

次に、2つの密度勾配の間の相から、10ミリリットルの冷たいRPMIとFBSを含む新しい15ミリリットルのチューブに移して別の遠心分離を行い、ペレットを10ミリリットルの氷冷RPMI/FBSで再懸濁してカウントします。フローサイトメトリーで細胞を解析するには、FACSバッファー濃度で100マイクロリットル当たり6細胞に細胞を10倍に10倍に希釈し、1サンプル当たり10マイクロリットルの抗マウスCD16/CD32ブロッキング抗体で細胞サンプルをインキュベートします。室温で10分後、実験フローサイトメトリー染色プロトコルに従って96ウェル、ラウンドボトムプレートの適切な数のウェルに20マイクロリットルの細胞を加え、Eタンパク質テトラメットミックスの20マイクロリットルを各ウェルに加え、暗い室温で30分間インキュベーションします。

インキュベーションの終わりに、対象となる細胞表面抗体を細胞に加えて、光から保護された摂氏4度で30分間インキュベーションします。次に、1回の洗浄につき200マイクロリットルのFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、200マイクロリットルの新鮮なFACSバッファーで各ウェルの細胞を慎重に再懸濁します。次に、サンプルを、光から保護した摂氏4度で、フローサイトメーター上で分析するまで保存します。

ジカウイルスによる接種後7日後に、インターフェロンα/β受容体1ノックアウトマウスにおいて、骨髄麻痺や運動パラパリシスなどの病理学的症状および徴候が観察される。感染したインターフェロンα/β受容体1ノックアウト動物の体重変化を15日間監視し、体重減少は感染の4日後に最初に観察され、7日目の感染後に体重回復が始まった。感染したマウス脳の代表的な画像は、ジカウイルスによる接種後7日間の明らかな浮腫と高血症を明らかにする。

マウスジカ感染精巣の代表的な画像は、感染後7日目から30日に徐々に縮小することを示している。ジカ感染した脳および精巣組織切片の病理組織学的分析はまた、感染していない対照と比較して破壊的な病理学的変化の効果を示す。マクロおよび病理組織学的分析から予想されるように、高いウイルス負荷は、免疫染色によってジカウイルス感染マウスの脳および精巣でも検出される。

これは、脳ポストジカ感染への堅牢なCD3陽性T細胞浸潤を伴う。ジカウイルス特異的CD3陽性、CD8陽性Tリンパ球は、Eタンパク質四振器染色によってジカウイルス感染マウスおよびワクチン免疫マウスの両方で検出される。Eタンパク質四トラマー特異的CD8陽性T細胞も脳内で検出することができ、ジカウイルスによる接種後7日間の精巣を検査する。

その開発後、この技術は、動物モデルにおける自然感染中の免疫流行器官における病原体特異的T細胞特性化の研究における研究者への道を開いた。この方法は、胎盤や眼などの他の免疫流行器官、ならびにウイルス感染および癌の両方にも適用することができる。この手順に従って、MHC-Iテトラマーは、病原体特異的T細胞の免疫物質化学的または免疫蛍光検出のために、脳または精巣浸潤T細胞の分布にアクセスするために使用することができる。