Name: キヌレニンとキヌレン酸の高速液体クロマトグラフィーによる測定: 認知およびラットの睡眠に関する生化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶラットの脳と血漿中のキヌレニン経路代謝産物を高速液体クロマトグラフィーで測定する方法。認知機能と睡眠への影響を評価し、精神疾患の治療戦略に関する知見を提供します。

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本研究は健康の国民の協会 (R01 NS102209) とクレア e. フォーブスの信頼からの寄付によって部分的に資金を供給されました。

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周辺キヌレニン投与後脳のカイナの信頼性の評価を組み合わせて、機能的な生化学的実験を解釈に重要です。ここでは、プラズマ キヌレニンとラットのカイナの脳を測定する効果的な方法を確立する新しいユーザーを可能にする詳細なプロトコルを提案する.プラズマに於けるキヌレニンの測定確認正確な注入しカイナ代謝物の測定は、脳におけるデノボ合成を確認します。柴田18から存在下で Zn2 +、ナノモル範囲で脳にカイナの内因性の量を正確に検出する機能を含むカイナを derivatize に適応説明蛍光高速液体クロマトグラフィー法のいくつかの利点があります。.さらに、メソッドは、検出 bioprecursor キヌレニン マイクロモルの範囲でプラズマの励起・発光、蛍光波長を調整することによってプロトコルで説明されているように適応されています。
治療と、安楽死との間の特定の時間など、プロトコルの中で重要なステップは、正確に判断して脳内カイナ形成の時間的経過とデザインと行動の分析を導く睡眠説明実験を監視します。受動的回避反応パ...

KP は必須アミノ酸トリプトファン1の約 95% を分解します。哺乳類の脳キヌレニン アストロ サイトには主に酵素キヌレニン アミノトランスフェラーゼ (KAT) II2によって生理小分子カイナに代謝されます。カイナは脳2,3,の4NMDA と α7nACh 受容体拮抗薬として機能し、またターゲット シグナル受容体 G タンパク質およびアリール炭化水素受容体 (AHR) を含む結合受容体 35 (GPR35)5 ,6。実験動物で行動アッセイ2,7,8,9,10の配列の認識性能に支障をきたす脳カイナの高度が示されています。.カイナは、こうして睡眠の神経生物学におけるアストロ サイト由来の分子の役割をさらにサポートによる睡眠・覚醒行動11、認知機能を調節する際に不可欠な役割を果たして新たな仮説を提案し、認知12。
カイナで標高を統合失調症13,14,15,16、衰弱させる精神障害患者の脳脊髄液と死後の脳の組織で発見されている臨床的に認知障害によって特徴づけられます。統合失調症患者もよく、17の病気を悪化させる可能性があります睡眠障害に悩まされています。統合失調症やその他のこれらの貧しい人々 の成果を治療するための新規治療法の開発につながる可能性があります睡眠と認知、学習と記憶、特に間の関係を調節することで KP 代謝とカイナの役割を理解精神科の病気です。
信頼性と一貫性のある KP 代謝物の測定法は、KP 生物学の科学的な理解に様々 な機関から新たな研究を統合できることを保証するために重要です。現在、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によるラット血漿中キヌレニンとラット脳におけるカイナを測定する手法について述べる.Zn2 +の存在下で蛍光検出の使用になります、まず柴田18など最近適応し、ポストカラム試薬として 500 mM 酢酸亜鉛と derivatize に最適化によって開発された現在のプロトコル脳11カイナ内因性、ナノモル量の検出。
議定書に従って、 de novoの内因性カイナの生産を刺激する直接 bioprecursor キヌレニンを腹腔内注入 (i. p.) ラットで。カイナ生産の度を決定する生化学的評価と組み合わせて、海馬依存性の記憶 (受動的回避反応パラダイム) で、キヌレニンの影響に挑戦はまた、睡眠アーキテクチャ (脳波、筋電図信号)検討した11。これらの技術の組み合わせは、キヌレニン チャレンジ生体内でラットの生化学的, 機能的影響の研究のためことができます。

<table><tbody><tr><td>Wistar rats</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>成人男性、250-350 g</td></tr><tr><td>L-キヌレニン硫酸</td><td>Sai Advantium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 カラム (4 mm x 150 mm)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Clips</td><td>Stoelting Co.</td><td>59022</td><td></td></tr><tr><td>取り付け材料 ネジ</td><td>PlasticsOne</td><td>00-96 X 1/16</td><td></td></tr><tr><td>非吸収性縫合糸</td><td>MedRep Express</td><td>699B</td><td>CP Medical Monomid Black Nylon 縫合糸、4-0、P-3、18インチ、12 本入りボックス</td></tr><tr><td>吸収性縫合</td>糸 <td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 コーティング Vicryl バイオレット 1X27'' SH-1</td></tr><tr><td>歯科用セメント</td><td>Stoelting Co.</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>ドリルビット</td><td>Stoelting Co.</td><td>514551</td><td>0.45 mm</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Alliance HPLCシステム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E2695分離モジュール</td><td>Waters</td><td>176269503</td><td></td></tr><tr><td>2475蛍光検出器</td><td>Waters</td><td></td><td></td>186247500</tr><tr><td>ポストカラム試薬マネージャー</td><td>ウォーターズ</td><td>725000556</td><td></td></tr><tr><td>Lenovo コンピューター</td><td>ウォーターズ</td><td>668000249</td><td></td></tr><tr><td>エンパワーソフトウェア</td><td>ウォーターズ</td><td>176706100</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strongラット</td></tr></ストロング><tr><td>エクストラトールMDFサウンド減衰キュービクル</td>用><td></td><td></td><td></td>パッシブ回避ボックス MedAssociates ENV-018MD インテリア:22インチ (W) x 22インチ (H) x 16インチ (D)</tr><tr><td>センターチャンネルモジュレーターシャトルボックスチャンバー</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MC</td><td></td></tr> ラット<tr><td></td>用ステンレス鋼グリッドフロア MedAssociates ENV-010MB-GF <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動ギロチンドア</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010B-S</td><td></td></tr><tr><td>ラット用クイックディスコネクトシャトルグリッドフロアハーネス</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-010MB-QD</td><td></td></tr><tr><td>刺激ライト、1インチ白色レンズ、モジュラーパネルに取り付けられています</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-221M</td><td></td></tr><tr><td>ラットチャンバー用ボリュームコントロール付き</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-223AM</td><td></td></tr><tr><td>SmartCtrl 8入力/16出力パッケージ</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-716P2</td><td></td></tr><tr><td>シャトルボックス用8チャンネルIR制御</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-253C</td><td></td></tr><tr><td>赤外線源とデクターアレイストリップ</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-256</td><td></td></tr><tr><td>卓上インターフェースキャビネット、120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080C</td><td></td></tr><tr><td>デュアルレンジ定電流嫌悪刺激モジュール</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-410B</td><td></td></tr><tr><td>ソリッドステートグリッドフロアスクランブラーモジュール</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-412</td><td></td></tr><tr><td>デュアル A/B ショックコントロールモジュール</td><td>MedAssociates</td><td>ENV-415</td><td></td></tr><tr><td>2' 3 ピンミニモレックスエクステンション</td><td>MedAssociates</td><td>SG-216A-2</td><td></td></tr><tr><td>10' ショック出力ケーブル、DB-9 M/F</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219G-10</td><td></td></tr><tr><td>シャトルショックコントロールケーブル 15フィート、6</td><td>MedAssociates</td><td>SG-219SA</td><td></td></tr><tr><td>小型卓上キャビネットと電源、120 V 60 Hz</td><td>MedAssociates</td><td>SG-6080D</td><td></td></tr><tr><td>PCIインターフェースパッケージ</td><td>MedAssociates</td><td>DIG-700P2-R2</td><td></td></tr><tr><td>シャトルボックス回避ユーティリティパッケージ</td><td>MedAssociates</td><td>SOF-700RA-7</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Sleep-Wake Monitoring Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponehmah software</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNP-P3P-610</td><td></td></tr><tr><td>MX2 8 Source Acquisition interface</td><td>Data Sciences International (DSI)</td><td>PNM-P3P-MX204</td><td></td></tr><tr><td>デルのコンピュータ、Optiplex 7020、Windows 7、64ビット</td><td>データサイエンスインターナショナル(DSI)</td><td>271-0112-013</td><td></td></tr><tr><td>デル19インチコンピュータモニタ</td><td>データサイエンスインターナショナル(DSI)</td><td>271-0113-001</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックケージ用レシーバ、8x</td><td>データサイエンスインターナショナル(DSI)</td><td>272-6001-001</td><td></td></tr><tr><td>Cisco RV130 VPNルーター</td><td>データサイエンスインターナショナル(DSI)</td><td>RV130</td><td></td></tr><tr><td>Matrix 2.0</td><td>Data Sciences International(DSI)</td><td>271-0119-001</td><td></td></tr>ネットワーク<tr><td>スイッチ</td><td>Data Sciences International(DSI)</td><td>SG200-08P</td><td></td></tr><tr><td>Neuroscoreソフトウェア</td><td>Data Sciences International(DSI)</td><td>271-0171-CFG</td><td></td></tr><tr><td>2つの生体電位チャネル送信機、モデルTL11M2-F40-EET</td><td>データサイエンスインターナショナル(DSI)</td><td>270-0134-001</td><td></td></tr></tbody></table>

キヌレニンとキヌレン酸の高速液体クロマトグラフィーによる測定: 認知およびラットの睡眠に関する生化学

A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats

トリプトファン分解のキヌレニン経路 (KP) は、精神疾患に関与しています。具体的には、アストロ サイト由来の代謝産物キヌレン酸 (カイナ) 両方のNで拮抗薬-メチル-d-アスパラギン酸 (NMDA) と α 7 ニコチン性アセチルコリン (α7nACh) 受容体、健康と病気における認知プロセスに関与しています。統合失調症患者の脳でカイナ レベルが上昇するいるとグルタミン酸作動性およびコリン作動性受容体での誤動作は作因的認知機能の障害、病気の精神病理学のコア ドメインに関連すると考えられます。カイナは、統合失調症者の病態生理学的に重要な役割を果たす可能性があります。ラットにおける前臨床研究はカイナの急性の高度は、彼らの学習・記憶プロセスに影響を与える可能性を示しているし、直接 bioprecursor キヌレニンに動物を扱うことによって齧歯動物の脳内の内因性カイナを昇格することが可能です。現在のプロトコル詳細でこの実験的アプローチを説明し、キヌレニン血糖と脳カイナ形成 (高速液体クロマトグラフィーを使用して)、a) の生化学的解析を組み合わせた b) 行動テスト プローブを海馬依存性の文脈の記憶 (受動的回避反応パラダイム) と c) 睡眠・覚醒行動 [脳波と筋電図 (EMG) を組み合わせた遠隔録音] の評価ラット。一緒に取られて、高いカイナ、睡眠、認知の関係を研究して、このプロトコルの詳細に記述するキヌレニン標高とカイナ形成生体内でラットの関数の結果を理解するための実験的アプローチ。このプロトコルの変化により得られた成果は、KP とカイナが睡眠と健康と病気の状態で認知を調節する際に極めて重要な役割を果たす仮説をテストします。

カイナの脳を高める方法として腹腔内キヌレニン注射の使用を検証するため、組織の HPLC 分析を行った。標準曲線 (図 1) は、関連ソフトウェアを使用でき、組織サンプルの定量化のために建設されました。キヌレニンとカイナの代表的なクロマト グラムを図 2に掲載されています。キヌレニン 6 分の保持時間が観測され、カイナは 11 分の保持時間を持っていた。KP ダイナミクスを観察するこのプロトコルでキヌレニンの 100 mg/kg を投与し、組織はすぐに次の注射、または 2 または 4 h 後注入 (図 3 a) 収集されました。プラズマ キヌレニン (図 3 b) そして海馬カイナ (図 3 c) を定量化しました。キヌレニン代謝物の高速液体クロマトグラフィー定量で使用される特定...

キヌレニン経路 (KP) 生理代謝の変化は、精神疾患に関与しています。変更されたキヌレニン経路代謝、体内の齧歯動物での機能的帰結を調査新規治療法の解明を助けるかもしれない。現在のプロトコルは、ラットにおける急性キヌレニン挑戦の影響を調査する生化学的および行動のアプローチを組み合わせたものです。

The kynurenine pathway (KP) of tryptophan degradation has been implicated in psychiatric disorders. Specifically, the astrocyte-derived metabolite ...

この方法は、生化学的アプローチと行動学的アプローチを組み合わせて、ラットにおける急性キヌレニンチャレンジの影響に関する神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ラットの脳および血漿中のキヌレニン経路代謝物を測定するための信頼性と一貫性のある方法を提供することです。この手順を実演するのは、私の研究室の学生研究助手であるCarly Fabianです。腹腔内キヌレニン投与後の適切な実験エンドポイントで、凍結採取した血漿を湿った氷上で解凍し、解凍したサンプルを超純水で希釈します。希釈したサンプル100マイクロリットルを6%過塩素酸の25マイクロリットルの個々の容器に移し、サンプルを遠心分離機でボルテックスします。次に、各チューブから100マイクロリットルの上清を個々の250マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、キヌレニンおよびキヌレニン酸を測定します。脳サンプルからのキヌレン酸測定は、凍結採取した脳サンプルをドライアイスで解凍し、精密な分析天秤で各サンプルを個別に計量します。すべてのサンプルを秤量したら、チューブを湿った氷の上に移し、各組織サンプルを超純水で1〜10重量比で希釈し、続いて超音波装置で均質化します。各サンプルスラリーの100マイクロリットルを新しいチューブに分注し、ボルテックスと遠心分離のために25マイクロリットルの25%過塩素酸を追加します。次に、100マイクロリットルの上清を個々の250マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、キヌレン酸を測定します。キヌレニン分析用の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)装置を調製するには、まず、個々のHPLCインテークチューブを移動相、超純水、および100%アセトニトリル容器に入れます。次に、5%アセトニトリルと95%超純水を毎分0.5ミリリットルで運転するように装置をプログラムし、HPLCマシンを20〜30分間稼働させます。安定した圧力とベースラインが達成されたら、溶液組成を 5% アセトニトリルと 95% 酢酸ナトリウムの移動相に変更し、装置をさらに 30 分間平衡化します。装置が平衡化している間に、蛍光検出器のランプをオンにします。誘導体化に先立ち、酢酸亜鉛溶液を移動相ポストカラムと組み合わせた蠕動ポンプで別々にポンプで送り、ポストカラムポンプを毎分0.1ミリリットルの流量で約20分間オンにし、約500psiの安定した圧力に達するまでオンにします。装置で分析の準備ができたら、サンプルシーケンスパラメータを制御し、複数のサンプルの自動注入を許可するようにシステムソフトウェアを設定します。「Run Sample」画面で「File」をクリックし、新しいウィンドウで「Create New Sample Set」まで下にドラッグし、「Empty」を選択します。すべての標準試料とサンプルを、分析すべき順序で個別にリストアップし、配列の最初と最後に標準試料をアッセイします。機能列で、標準試料とサンプルを指定し、5つの試料ごとに水を注入するプログラムを設定します。各サンプルの実行時間を 15 分に設定し、標準試料から 20 マイクロリットルのサンプルを注入し、その後、実験的に適切な方法で 20 マイクロリットルの血漿サンプルと 30 マイクロリットルの脳ホモジネート サンプルを注入します。次に、測定する化合物に応じて励起波長と発光波長を設定し、シーケンスを実行します。データを定量化するには、Browse Project'画面を開き、Sample Sets'タブで定量化するサンプルセットをダブルクリックします。注入のリストから、すべての標準試料をハイライト表示し、新しいウィンドウで右クリックして[Process]を選択します。次に、ドロップダウンメニューを使用して「キャリブレーションと定量」を選択し、「すべての標準を再度強調表示」を選択し、右クリックして「レビュー」を選択しますクロマトグラムが開いたら、各標準を統合してキャリブレーションして標準曲線を生成します。次に、サンプルセットのタブに戻り、サンプルセットをダブルクリックして定量し、デモンストレーションに従ってレビューし、各サンプルを統合および定量して、以前に作成した標準曲線に基づいて各サンプルの濃度を出力します。キヌレニンを投与した動物から採取した組織サンプルのHPLC分析により、キヌレニンの保持時間が約6分、キヌレニン酸の保持時間が約11分であることが明らかになりました。血漿キヌレニンと海馬のキヌレニン酸の定量化により、急性キヌレニン注射は脳のキヌレニン酸レベルを増加させ、注射後2時間でピークに達し、注射後4時間でベースラインに戻ることが明らかになりました。受動的回避パラダイムトレーニングの試験では群差は観察されませんが、対照動物はテスト試験中にダークサイドに入るまでの潜伏時間が有意に増加し、文脈学習を示していますが、24時間前にキヌレニンを注射された動物は同じ潜時の増加を示さず、学習の欠損を示しています。さらに、明期の急性キヌレニン上昇が睡眠覚醒アーキテクチャに与える影響の評価は、キヌレニン注射後の最初の2時間で急速眼球運動の総睡眠時間が減少することを示しています。これらのデータは、これらの期間中の覚醒時間の増加と非急速眼球運動睡眠のわずかな減少によって反映されており、急性のキヌレニン上昇も睡眠覚醒ダイナミクスの乱れを引き起こすことを示しています。この手順に続いて、行動分析などの他の方法を実行して、認知と睡眠の調節におけるキヌレン酸形成の上昇の役割に関する追加の質問に答えることができます。

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Behavior

行動

手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。...

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

このビデオは、麻酔をかけたマウスに脳波(EEG)および筋電図(EMG)電極アセンブリを埋め込むためのプロトコルを示しています。このプロセスには、マウスを定位固定装置フレームに固定し、頭蓋骨に正中線を切開し、電極用の穴を開け、信号記録用の電極ユニットを固定することが含まれます。回復後、記録された信号を使用してマウスの睡眠覚醒動作が分析されます。...

脳波および筋電図記録によるマウスの睡眠行動の解析

自由に行動するマウスの脳波(EEG)と筋電図(EMG)の記録は、行動と生理機能を睡眠と覚醒と関連付けるための重要なステップです。本明細書に記載の実験プロトコルは、マウスにおけるEEGおよびEMG記録を取得するためのケーブルベースのシステムを提供する。...

マウスで睡眠を測定するためのポリグラフ記録手順

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

3 つのモノアミン神経伝達物質の一斉分析や乳児の尿中代謝物の 2 つの (ECD) の電気化学検出高速液体クロマトグラフィー (HPLC) に結合する便利な固相抽出を提案する.脳障害の早期診断のための潜在的なバイオ マーカーとして代謝物 MHPG...

抽出と神経伝達物質カテコールアミン及びその代謝物の高速液体クロマトグラフィーによる分析のための便利な方法

睡眠測定活動ベース ホーム ケージの監視の高スループット方法について述べる。このメソッドでは、脳波・...

齧歯動物の睡眠時間の非侵襲的で高スループットの測定

ここでは、腹側海馬脳波との組み合わせで、てんかんと非てんかんラットのアスパラギン酸とグルタミン酸のリリースを分析する体内マイクロダイアリシス法について述べる。アスパラギン酸とグルタミン酸の細胞外濃度は、病気のさまざまな段階と相関があります。...

自由行動ラットの脳波記録中に興奮性アミノ酸の透析

睡眠喪失と概日ミスアライメントは、多くの操作上の事故やインシデントに貢献します。疲労軽減を目的とした対策や作業スケジューリング設計の有効性は、運用環境での評価が難しい場合があります。この原稿は、複雑な運用環境で睡眠、概日、疲労、およびパフォーマンスデータを収集するためのアプローチをまとめたものです。...

複雑な運用環境での睡眠、概日、疲労、パフォーマンスデータの収集

ここでは、ミュンヘンChronoTypeアンケート、金標準概日相バイオマーカー、アクティグラフィ対策に基づいて、参加者を概日表現型群に正確に分類した後のパフォーマンスにおける日当リズムを調べる方法を紹介する。...

人間の概日のフェノタイピングと現実世界での日系性能試験

ここで説明するキヌレニン経路で生成される4種類のトリプトファン代謝産物(キヌレニン、3−ヒドロキシキヌレニン、キサンチュレン酸、3−ヒドロキシアントラニル酸)を、液体クロマトグラフィーによって分析した培養液から採取した培地中の単一の四重極質量分析法を用いて説明する。...

癌細胞培養から採取した培地における液体クロマトグラフィー-質量分析法による選択キヌレニンの同時定量化

学ぶラットの脳と血漿中のキヌレニン経路代謝産物を高速液体クロマトグラフィーで測定する方法。認知機能と睡眠への影響を評価し、精神疾患の治療戦略に関する知見を提供します。

キヌレニンとキヌレン酸の高速液体クロマトグラフィーによる測定: 認知およびラットの睡眠に関する生化学

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