キヌレニンとキヌレン酸の高速液体クロマトグラフィーによる測定: 認知およびラットの睡眠に関する生化学

この方法は、生化学的アプローチと行動学的アプローチを組み合わせて、ラットにおける急性キヌレニンチャレンジの影響に関する神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ラットの脳および血漿中のキヌレニン経路代謝物を測定するための信頼性と一貫性のある方法を提供することです。この手順を実演するのは、私の研究室の学生研究助手であるCarly Fabianです。

腹腔内キヌレニン投与後の適切な実験エンドポイントで、凍結採取した血漿を湿った氷上で解凍し、解凍したサンプルを超純水で希釈します。希釈したサンプル100マイクロリットルを6%過塩素酸の25マイクロリットルの個々の容器に移し、サンプルを遠心分離機でボルテックスします。次に、各チューブから100マイクロリットルの上清を個々の250マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、キヌレニンおよびキヌレニン酸を測定します。

脳サンプルからのキヌレン酸測定は、凍結採取した脳サンプルをドライアイスで解凍し、精密な分析天秤で各サンプルを個別に計量します。すべてのサンプルを秤量したら、チューブを湿った氷の上に移し、各組織サンプルを超純水で1〜10重量比で希釈し、続いて超音波装置で均質化します。各サンプルスラリーの100マイクロリットルを新しいチューブに分注し、ボルテックスと遠心分離のために25マイクロリットルの25%過塩素酸を追加します。

次に、100マイクロリットルの上清を個々の250マイクロリットルの微量遠心チューブに移し、キヌレン酸を測定します。キヌレニン分析用の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)装置を調製するには、まず、個々のHPLCインテークチューブを移動相、超純水、および100%アセトニトリル容器に入れます。次に、5%アセトニトリルと95%超純水を毎分0.5ミリリットルで運転するように装置をプログラムし、HPLCマシンを20〜30分間稼働させます。

安定した圧力とベースラインが達成されたら、溶液組成を 5% アセトニトリルと 95% 酢酸ナトリウムの移動相に変更し、装置をさらに 30 分間平衡化します。装置が平衡化している間に、蛍光検出器のランプをオンにします。誘導体化に先立ち、酢酸亜鉛溶液を移動相ポストカラムと組み合わせた蠕動ポンプで別々にポンプで送り、ポストカラムポンプを毎分0.1ミリリットルの流量で約20分間オンにし、約500psiの安定した圧力に達するまで

装置で分析の準備ができたら、サンプルシーケンスパラメータを制御し、複数のサンプルの自動注入を許可するようにシステムソフトウェアを設定します。「Run Sample」画面で「File」をクリックし、新しいウィンドウで「Create New Sample Set」まで下にドラッグし、「Empty」を選択します。すべての標準試料とサンプルを、分析すべき順序で個別にリストアップし、配列の最初と最後に標準試料をアッセイします。

機能列で、標準試料とサンプルを指定し、5つの試料ごとに水を注入するプログラムを設定します。各サンプルの実行時間を 15 分に設定し、標準試料から 20 マイクロリットルのサンプルを注入し、その後、実験的に適切な方法で 20 マイクロリットルの血漿サンプルと 30 マイクロリットルの脳ホモジネート サンプルを注入します。次に、測定する化合物に応じて励起波長と発光波長を設定し、シーケンスを実行します。

データを定量化するには、Browse Project'画面を開き、Sample Sets'タブで定量化するサンプルセットをダブルクリックします。注入のリストから、すべての標準試料をハイライト表示し、新しいウィンドウで右クリックして[Process]を選択します。次に、ドロップダウンメニューを使用して「キャリブレーションと定量」を選択し、「すべての標準を再度強調表示」を選択し、右クリックして「レビュー」を選択しますクロマトグラムが開いたら、各標準を統合してキャリブレーションして標準曲線を生成します。

次に、サンプルセットのタブに戻り、サンプルセットをダブルクリックして定量し、デモンストレーションに従ってレビューし、各サンプルを統合および定量して、以前に作成した標準曲線に基づいて各サンプルの濃度を出力します。キヌレニンを投与した動物から採取した組織サンプルのHPLC分析により、キヌレニンの保持時間が約6分、キヌレニン酸の保持時間が約11分であることが明らかになりました。血漿キヌレニンと海馬のキヌレニン酸の定量化により、急性キヌレニン注射は脳のキヌレニン酸レベルを増加させ、注射後2時間でピークに達し、注射後4時間でベースラインに戻ることが明らかになりました。

受動的回避パラダイムトレーニングの試験では群差は観察されませんが、対照動物はテスト試験中にダークサイドに入るまでの潜伏時間が有意に増加し、文脈学習を示していますが、24時間前にキヌレニンを注射された動物は同じ潜時の増加を示さず、学習の欠損を示しています。さらに、明期の急性キヌレニン上昇が睡眠覚醒アーキテクチャに与える影響の評価は、キヌレニン注射後の最初の2時間で急速眼球運動の総睡眠時間が減少することを示しています。これらのデータは、これらの期間中の覚醒時間の増加と非急速眼球運動睡眠のわずかな減少によって反映されており、急性のキヌレニン上昇も睡眠覚醒ダイナミクスの乱れを引き起こすことを示しています。

この手順に続いて、行動分析などの他の方法を実行して、認知と睡眠の調節におけるキヌレン酸形成の上昇の役割に関する追加の質問に答えることができます。