人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

このプロトコールの目標は、末端フレームNまたはC末端蛍光タグに融合した内因性融合タンパク質を発現するヒト誘導多能性幹細胞を生成することです。目的のノックインを達成するために、CRISPR-Cas9システムと、野生型S.pyogenes Cas9タンパク質と合成2部CRSPR RNAおよびtracrRNAを使用したリボ核タンパク質ベースのアプローチを使用します。このRNPは、エレクトロポレーションにより、ドナープラスミドとして目的の蛍光タグ配列と同時導入されます。

蛍光タグ付きタンパク質を発現する推定編集された細胞は、FACSによって濃縮されます。その後、正確な編集結果を分析するためのクローンラインが生成されます。この遺伝子編集プロトコルには、従来の過剰発現コンストラクトに比べて多くの利点があります。

蛍光タグがゲノムに導入されるため、得られた融合タンパク質の細胞内局在と動態を内因性制御下で研究することができます。ここでは、二倍体の非形質転換細胞のタグ付きタンパク質を研究できるため、人工多能性幹細胞をモデルシステムとして使用します。さらに、ここに示されている心筋細胞細胞のように、細胞は複数の細胞タイプに分化することができるため、このアプローチは、さまざまな同質遺伝子の細胞状況でタグ付きタンパク質を作成および研究する機会を提供します。

しかし、慎重に最適化することで、このプロトコルは他の哺乳類細胞タイプのゲノム編集に適合させることができます。こんにちは、私はアマンダ・ハウプトです、ここアレン細胞科学研究所の幹細胞および遺伝子編集チームの一員です。今日、私たちはこのアプローチを使用して、内因性融合タンパク質を発現する35種類以上の細胞株を作製しています。

これらを用いて、多種多様なユニークな細胞構造やプロセスを研究しています。このアプローチは、私たちのグループでこれまでに試みられた遺伝子座の最大95%で成功しています。この方法は、生細胞内のタンパク質のダイナミクスをより深く理解することに関心のある細胞生物学者にとって特に有用です。

しかし、編集されたクローンラインが生成されると、研究の可能性は無限大です。この方法により、ゲノム配列に他の混乱を生じさせることなく、モノアレル蛍光タンパク質タグを持つクローンを一貫して同定することができます。また、バイアスレル編集されたクローンを取得することもあります。

このビデオでは、内因的に制御された蛍光融合タンパク質を発現するクローン細胞株のトランスフェクション、FACS濃縮、単離における重要なステップをいくつか紹介します。トランスフェクションの2〜3時間前に、増殖培地に補充した10マイクロモルのROCK阻害剤でhiPSCを治療します。これにより、エレクトロポレーション後の生存が促進されます。

この処理後、細胞はとがった外観になります。トランスフェクションの前に、単一細胞解離領域と円錐形チューブに回収した細胞懸濁液を使用して、細胞を組織閉鎖プレートから細胞を除去する必要があります。トランスフェクションする各実験条件について、6つの細胞に1.84倍の10のアリコートを調製します。

1.5 mil チューブに 2.88 マイクロリットルの 10 マイクロモル ガイド RNA と 2.88 マイクロリットルの 10 マイクロモル Cas9 を添加して、各トランスフェクション用のリボ核タンパク質複合体チューブを調製します。室温で最低10分、最大1時間インキュベートします。前のステップで調製した細胞アリコートをGの211倍で室温で3分間ペレット

次に、上清を吸引し、220マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞ペレットを回転させます。220マイクロリットルの再懸濁細胞を、事前に調製した1.5ミルのRNP複合体チューブに加えます。1マイクロリットルのドナープラスミドにつき1マイクログラムの4.6マイクロリットルを追加します。.

ヌクレオフェクションチップとピペットを使用して2つの内容物を2〜3回混合し、100マイクロリットルの懸濁液を調製したエレクトロポレーション装置に移します。先端に気泡を入れないようにしてください。30ミリ秒の1パルスに対して1300ボルトを印加します。

懸濁液を渦巻く動きで準備した6ウェルプレートに静かに移します。プレートを左右および前後にゆっくりと動かして、細胞を分散させます。すべての実験条件とコントロールについて繰り返した後、トランスフェクションした細胞を摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートし、培地をROCK阻害剤を含まない通常の増殖培地に24時間交換します。

その後、24時間ごとにhiPSCに72〜96時間栄養を与え続け、その合流性を監視します。hiPSCが68〜80%のコンフルエントに達すると、FACS濃縮に進みます。トランスフェクションの2〜3時間前に、10マイクロモルのROCK阻害剤を増殖培地に添加してhiPSCを処理し、FACS濃縮後の生存を促進します。

細胞を選別するには、シングルセル解離試薬を使用してプレートから細胞を取り出し、35ミクロンメッシュフィルターでhiPSC懸濁液をろ過してポリスチレン丸底チューブに入れます。前方散乱光と横散乱光を使用して、高さと幅、3連符の破片、ダブレットを含むセルを並べ替えます。ライブバッファーのみの制御セルを使用して、FP陽性ゲートを設定します。たとえば、バッファーのみのセルがゲート内に収ま

幹細胞をソーティングするときは、ディスカッションセクションで提案されているように、細胞の生存を促進するために機器の設定を適応させます。FACSによるFP陽性細胞の割合によって決定される典型的なノックイン効率は、0.1%から5%の範囲であり、10マイクロモルのROCK阻害剤を補充した室温成長培地の0.5〜2ミルを含む1.5〜15ミルのポリプロピレンチューブに細胞を分類します。収集した細胞をGの211倍で室温で3分間遠心分離します。

上清を慎重に吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した200マイクロリットルの成長培地に細胞ペレットを再懸濁します。最大3,000個のアソートセルを、新鮮なマトリゲルコーティングされた96ウェルプレートの1つのウェルに移します。選別した細胞を摂氏37度で5%CO2中で24時間インキュベートし、培地を5マイクロモルROCK阻害剤を添加した増殖培地に24時間交換します。

その後、48時間後に、24時間ごとにROCK阻害剤なしで細胞に定期的な増殖培地を与え続け、72〜96時間、コンフルエンシーを監視します。細胞が十分に成熟し、96ウェルプレートから継代できるようになったら、徐々に大きなプレートに継代することをお勧めします。したがって、たとえば、96ウェルプレートの1つのウェルから、24ウェルプレートの1〜2ウェルに移動します。

そして、そこから6ウェルプレートなどに入れ、下流の目的に十分な細胞ができるまで。通常、最小で300万から400万個のセルです。懲罰的に編集された細胞のFACSが豊富な集団からクローン株を生成するには、単一細胞懸濁液に継ぎ、10センチメートルのプレートに1万個の細胞をプレートし、コロニーを5〜7日間成長させます。

コロニーが巨視的に見える場合、コロニーは分離するのに十分な大きさです。解剖顕微鏡では、P200ピペットを使用して、プレート表面から個々のコロニーを優しく掻き取り、吸引します。コロニーを含むボリュームを96ウェルプレートの1つのウェルに移します。

すべてのコロニーを移した後、プレートを組織培養インキュベーターで摂氏37度、CO25%で24時間インキュベートします。24時間後に培地をROCK阻害剤を含まない通常の増殖培地に交換します。次に、コロニーのサイズが約3倍になるまで、24時間ごとに72〜96時間細胞に栄養を与え続けます。

ゲノムDNA抽出のためのアンタリスを凍結保存するのに十分な細胞を持つためには、細胞を96ウェルプレートで増殖させ、継代する必要があります。詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。96ウェルプレートを通過させるには、8チャンネルアスピレーターを使用して、最初のカラムから媒体を除去および廃棄します。

P200マルチチャンネルピペットを使用して、プレートの最初の列に約200マイクロリットルのDPBSを加えて細胞を洗浄します。次に、8チャンネルアスピレーターを使用して、最初のカラムからDPBS洗浄液を取り外して廃棄します。次に、40マイクロリットルの解離試薬を最初のカラムに加えます。

これらの手順を一度に1列ずつ繰り返し、96ウェルプレートの合計6列まで作業します。井戸を交差汚染しないようにヒントを変更します。解離試薬を最初のカラムに添加してから3〜5分間、プレートをインキュベーターに置きます。

プレートの最初のカラムの細胞が底部から浮き上がり始めたら、P200マルチチャンネルピペットを使用して160マイクロリットルのDPBSを最初のカラムに追加し、各ウェルの12時、3時、6時、および9時の位置で細胞を穏やかにトリチュレートします。細胞懸濁液を含む全容積をVボトム96ウェルプレートに移します。解離試薬が含まれている残りのカラムについて、ウェルを交差汚染しないようにチップを変更して、これらの手順を繰り返します。

遠心分離機でV底板をGの385倍で室温で3分間回転させます。この時点までに示した96ウェル継代用のサブは、このプレート形式で細胞を継代するたびに同じ方法で行われる。次に、細胞を96ウェル形式で凍結保存する準備ができている場合の進め方を示します。

詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。前のセクションで示した遠心分離ステップの後、P200マルチチャンネルピペットを使用して上清を吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した60マイクロリットルの成長培地に再懸濁します。すべてのウェルで繰り返し、交差汚染しないようにヒントを変更します。

30マイクロリットルの細胞懸濁液を非マトリゲル被覆96ウェル組織培養プレートに移します。残りの30マイクロリットルの懸濁液を姉妹プレートに移し、混合せずに各ウェルに170マイクロリットルの凍結バッファーを迅速に追加します。このプロセスは、個々のプレートの1つが解凍された後に細胞のバックアップ集団が存在するように、重複した姉妹プレートで行われることに注意してください。

凍結保存された細胞を96ウェルプレートの他のすべてのカラムにのみ挿入することで、より速い解凍が可能になります。プレートをパラフィルムで包み、蓋付きの室温の発泡スチロールボックスに入れます。箱全体をマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。

24時間後、プレートを発泡スチロールの箱から移し出し、マイナス86°Cで最大4週間選別することができます。ヒト人工多能性幹細胞を96ウェルフォーマットで凍結保存すると、細胞培養の時間的中断が可能になります。研究者は、クローン鉱山でゲノム検証アッセイを実施して、将来の研究のために解凍する遺伝的に望ましいクローンを特定できます。

WTC hiPSC株に標的特異的ガイドRNA Cas9タンパク質と慎重に設計されたドナーテンプレートプラスミドをトランスフェクションしてから4日後、0.95%の細胞がGFPを発現していることが観察されました。FACSを用いて、すべてのGFP陽性細胞を濃縮集団として選別しました。予備的な顕微鏡検査により、mEGFP核ラミンB1融合タンパク質の核膜への局在が予想されることが明らかになりました。

蛍光標識されたタンパク質は、さまざまな強度の細胞の約95%で観察されました。クローンライン作製後、均一なmEGFP強度のクローンを取得し、さらに解析して精密な編集を行いました。結論として、我々は、内因的に制御された蛍光融合タンパク質の発現のためのヒト誘導多能性幹細胞の遺伝子編集のためのトランスフェクション法を示した。

典型的なノック非効率性は低いため、ここに示すFACS法のような一部の濃縮戦略は、融合タンパク質を発現する推定的に編集された細胞の集団をもたらします。濃縮された集団は、生物学的研究に用いることができるか、またはこの方法に記載されるようにクローン株を生成することができ、それによって、正確に遺伝子編集された細胞株を同定することが可能になる。Cas9が誘発するゲノムの二本鎖切断は、意図した遺伝子座にタグが組み込まれているにもかかわらず、しばしば不正確に修復されることを覚えておくことが重要です。

さらに、モノアレル編集されたクローンでは、タグなし対立遺伝子には、非相同末端結合修復によって引き起こされる可能性が最も高いインデルが頻繁に含まれています。これらの知見は、クローン細胞株のゲノム解析を通じてのみ明らかになったCRISPR Cas9ノックイン後の遺伝的検証の重要性を強調しています。期待される融合タンパク質の発現だけでは、正確な編集が保証されるわけではありません。

このプロトコルをヒト人工多能性幹細胞の編集に使用する場合は、書かれたプロトコルに詳述されている推奨事項に従って、細胞の穏やかな取り扱いを確保し、最適な細胞生存と最小限の自然分化を実現するように注意してください。このビデオと関連するプロトコルおよび材料リストが、お気に入りのタンパク質についてご自身の研究室で同様の実験を行うのに役立つことを願っています。ご覧いただきありがとうございます。