Name: 人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いたヒトiPS細胞における内因性タンパク質の蛍光タグ付け法。電気穿孔とFACSで編集細胞を濃縮し、クローン樹立で正確なゲノム編集を確認できます。

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ダフネ Dambournet は、多くの洞察力に富んだ議論や編集、イラスト、原稿の批判的読解のアンジェ リーク ・ ネルソン、アンドリュー タッカー ラミン B1 セルのタグ付きの mEGFP ラインを生成するためのタオは遺伝子についてのアドバイスを感謝いたします。遺伝子の編集および品質管理プロセスへの貢献のため細胞科学の幹細胞と遺伝子編集とアレンの協会のアッセイ開発チームを確認したいです。私たちの細胞の遺伝子編集行を作成するために使用私たち WTC ラインは、グラッドス トーン研究所、UCSF でブルース ・ r ・ コンクリン研究所によって提供されました。我々 は細胞科学創設者、ポール g. アレン、励まし、彼のビジョンのためのアレンの協会に感謝し、サポートします。

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HiPSCs の蛍光タンパク質融合を規制内生を生成するため、ここで示す方法は、ライブセル イメージングから様々 な機能の研究に至るまでのアプリケーションと編集遺伝子細胞を生成するための汎用性と強力なアプローチと」患者由来による行13,14,15を使用して皿に病」モデル。それが潜在的モデルや正しい病気の原因となる変異22,23に他のタグまたは小さい遺伝の変更を導入して使用する中に、N または C-末端内因性のタンパク質の大きな FP タグを導入するこのメソッドを使用すると、.小さい挿入相同性の腕のサイズになることがありますが、このメソッドで提示を編集する一般的なアプローチは、24,25をかかることがあります。HiPSCs の使用が彼らの広大なユーティリティは、慎重に最適化と強くお勧めこのプロトコルは他の哺乳類セルラインのゲノムを編集するのには適応があります。
(マイクロ アレイまたは RNA シーケンス データ) から推定するトラン スクリプト豊富な FP がタグ付けに興味の遺伝子を識別するとき良いトラン スクリプトのレベルは常に相関がないが、遺伝子または関心のアイソ フォームを表明したかどうかを評価するためのポイントを始めています。蛋白質レベル。ここで説明されている FACS 濃縮方法が興味のセル型で少なくとも適度に表現される遺伝子の最高を仕事します。この戦略はまた、バック グラウンド強度比への信号が非常に低い12,19centrin、desmoplakin、paxillin など点状および/または離散の局在パターンを示す融合の選択で成功しています。遺伝子が高発現していないまたは派生セル型でしか表現が追加選定を必要があります。
ひと培養細胞で使用されるテンプレート プラスミド crRNA とドナーのデザインの出発点は、人間の参照ゲノム (GRCh38) をする必要があります。異なる培養細胞のゲノムは、同じ種の内で変わることができるので CRISPR/Cas9 はシーケンス固有セル行固有亜種 (一塩基多型または挿入/削除 (オクターリピート)) を識別するために非常に便利ですので参照ゲノムとは異なる、デザインにこれらを組み込みます。これにより crRNAs がホストのゲノムに互換性があること、ドナー テンプレート プラスミド ホモロジー腕が任意のセル行の特定のバリアントが保持されます。推奨される戦略は、設計プロセス中に crRNAs とドナーのテンプレート プラスミド ホモロジー腕にホモの亜種を組み込むことです。ヘテロ接合体の変形を組み込むことはオプションです。大きなノックアウトの実験のため特定の試薬を使用し、このプロトコルの他主な考慮事項を以下に。
Cas9 タンパク質
Cas9 蛋白質を使用しての主な利点は、Cas9 を導入して、RNP 複合として gRNA は、Cas9 と gRNA の発現が数日間続く可能性があり、つながるプラスミド ベースのアプローチと比較してのヌクレアーゼ活性の限られた期間での結果に示されています。大きいとオフ-対象活動26,27。Cas9 蛋白質を使用しての追加の利点は、劈開は一度細胞の中にすぐに利用できることです。これより従来の Cas9 mRNA または Cas9/gRNA プラスミドを使用して転写、翻訳、タンパク質のプロセッシング26,28を必要とするとは対照的します。野生型ピオゲネス s. Cas9 蛋白質が多く商業ソースから可能です。
ガイド RNA
目的の FP 挿入部位付近の crRNA ターゲットがターゲットを持つゼロまたは数予測をオフ - ホストのゲノム29,30,31,32を見つけるための多くの公開ツールがあります。HDR と HDR 結果の精度の効率は、crRNA ターゲット特定の軌跡12で使用によって大きく異なります。このため、いくつかの crRNAs をテスト (2-4、できれば 50 以内に目的の挿入部位の bp) 軌跡あたりは、これは編集の実験が成功の確率を高める可能性がありますので勧め。GRNA を提供するための現在の可能性を含める合成 2 部 crRNA と tracrRNA、合成単一 gRNAs (sgRNAs)の in vitro転写 sgRNAs、または U6 プロモーターから sgRNA を発現する細胞にプラスミドを提供します。このプロトコルは高い切断活性の最適化されていません。そのまま 2 部の crRNA と tracrRNA (材料表参照) は、セルに少なくとも潜在的な摂動を起こしながらモノラル対立 FP タグ セルラインを生成することを目標に使用されました。
ドナー テンプレート プラスミド
相同性のいくつか腕シーケンスを提供ドナー テンプレート プラスミドが HDR イベント中に宿主ゲノムに組み込まれます、ため crRNA 認識部位に点突然変異を導入次の HDR Cas9 で胸の谷間をさらに防ぐためするべき。通常最も簡単な分裂的な変更は PAM シーケンスを変異です。いくつかの非正規の PAM のシーケンスは、野生型ピオゲネス s. Cas9 でまだ認識できる、ために、NGG、NAG、NGA の33を使用しないようにすることをお勧めします。相同性腕を変異、非同義変異とまれなコドンの導入を避けます。PAM シーケンスに同義的な変化は不可能、種地域で 3 つの同義の点突然変異をすることを検討 (10 bp PAM に近位) crRNA 結合部位の。これらの地域は重要な規制シーケンスを含めることができますので、5ʹ 非翻訳領域 (UTR) でこれらの変更を行うときに十分な注意が必要があります。コンサルティングの遺伝的保全データベース UCSC のゲノムのブラウザー比較ゲノミクスのトラックは、これらのケースでのガイダンスを提供できるよう非常に節約された拠点17への変更よりも、非保存の拠点への変更より良い容認されるかもしれない。FP シーケンスの単なる挿入がある (図 1) のように crRNA 結合部位を破壊する十分なただし、新しく追加されたシーケンスは crRNA バインディングおよび PAM シーケンスの永続化のためにチェックしなければなりません。
FP とネイティブ蛋白質のアミノ酸のリンカーが融合蛋白質34の機能を節約するためにお勧めします。多くの場合特定料金のサイズ アミノ酸リンカーを選択可能性があります。場合は内因性にターゲットを絞ったようなデザイン cDNA 融合融合タンパク質よく研究されている、CRISPR/Cas9 ノックアウトの実験12,19同じリンカー シーケンスが使えます。このような情報を使用できない場合は、GTSGGS などの短いリンカーもされて正常に12を使用します。他の研究は、さまざまなターゲット35の汎用小型 3-アミノ酸リンカー順序との成功を実証しています。
トランスフェクションと FACS 濃縮
多くの市販のトランスフェクション試薬は、エレクトロポレーション システムを使用するサイズ、料金、および構成の広い範囲で試薬を提供することができますに対し分子の特定の種類の細胞への配信のため処方されています。HiPSCs ようにセルに transfect ハードの一般的なトランスフェクション法に加えて、エレクトロポレーションはまたこのメソッドで説明されているように CRISPR/Cas9 を介した FP ノックのすべての 3 つのコンポーネントを提供することの利点を運ぶ。トレーシー ・ メソッド (データは示されていない)、また RNP 配信26,28,36 の他のユーザーによって使用されていますと、他の市販試薬と比較して最高の結果を生成するエレクトロポレーションが見つかりました.
HiPSCs を編集するため、このプロトコルを使用する場合、特別な注意は編集プロセスの最適な細胞生存率と最小限の分化遺伝子の前後にセルの穏やかな取扱いの確保にすべき。特に、FACS 濃縮方法が最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液を用いて幹細胞を並べ替えに適応する必要があります (生理食塩水など材料の表を参照)、および低いサンプル圧力 (10 psi)。幹細胞の最適生存率の結果、並べ替え、単一のセルではなく FACS 濃縮 hiPSCs が一括で並べ替えられ、細胞の生存率と幹細胞の整合性を最適化する人口として展開します。ただし、単一セルの並べ替えが以下の敏感な細胞のタイプの適切なあります。細胞の生存を促進するため、細胞は FACS 濃縮のため収穫後 1 時間よりは、もはや文化に戻り、並べ替えプロセス全体を通じて室温で保管します。いくつかの細胞の種類、細胞の生存は並べ替えプロセスを通して氷 (4 ° C) の上のインキュベーターの細胞によって強化があります。
FP 陽性細胞の一括拡大は、系統を生成する前に融合蛋白質のローカリゼーションのための画像解析による人口を評価する機会を提供します。セルの結果豊かな人口は、いくつかの研究のために十分かもしれないが、これらの集団はよく FP 様々 な強度の信号を表示します。分離系統機能実験12のより適切な意思統一信号 (図 3) があります。
クローンの細胞ラインの生成
編集とクローン線の生成処理中、細胞の形態を監視することが重要です。フィーダー無料条件で栽培による植民地は、滑らかなエッジとも、十分に詰めてセンター12,18,19を表わすべきであります。分化した細胞は、文化の 5% 未満で観察すべき。個々 のコロニーを選ぶとき、それらにその展示形態を選択します。イベントを継 96 ウェル プレート、中に形態のためのクローンをチェックし、これが差別化につながるや遺伝的不安定性の徴候である可能性がありますが大きくなり過ぎたものを中止します。
クローンの細胞ラインの生成できる遺伝確認正確な編集のため Cas9 誘起二重鎖切断がゲノムのために重要なある頻繁に修復される不正確定款目的の軌跡でタグにもかかわらず。前述の PCR アッセイことを示した累積 10 ユニークなゲノム遺伝子座の間で多く (45%) FP 発現クローンのゲノム12ドナー プラスミド バックボーン統合対象の座または (稀に) ランダムに苦しみました。また、GFP 陽性の 23% のクローンを作成 (n = 177) 10 ユニークな遺伝子座の間で、またはタグなしの対立遺伝子、NHEJ12可能性があります予想される crRNA 切削現場近くの突然変異を隠すことがわかった。多くの系統 (~ 100 クローン/編集) のこの遺伝子解析 FP 式と単独で予想される融合蛋白質のローカリゼーションは正確な編集12 には保証しないので、細胞集団では不可能です遺伝検証の重要性を強調しました。.さらに、これらの PCR に基づく試金は、有意義な分析が完了する前に系統発生の必要性を正当化、確実に細胞の豊かな人口に実行できません。挿入された FP タグの遺伝学的確認と (モノラル対立編集したクローン) で未編集の対立遺伝子の遺伝的整合性の検証は、タグ式を超えてターゲットの軌跡で正確な編集を確認する必要です。
Bi 対立編集率が低いと (サンガーとエキソーム配列によって試金) としてターゲットを突然変異の欠如は、この方法で (未発表データ)12を使用して、日付に観察されています。これは、CRISPR/Cas9 実験26,27短期持続 RNP の使用を記述する先行研究と一致。Bi 対立編集クローン細胞の欠如特定の軌跡がありますまたはセルの 2 つを容認することができないのためと推定される bi 対立編集されたセルがあった以前に公開された実験の重要な蛋白質のコピー タグ別 (TUBA1B)12が、一つの座 (LMNB1) の観察。Bi 対立の完全に検証されたクローン細胞株は、mEGFP19このメソッド タグ ST6 β-ガラクトシド α 2, 6 シアル酸転移酵素 1 (ST6GAL1) および RAB5A メンバー RAS 癌遺伝子家族 (RAB5A) を使用して生成されています。
ゲノムの編集の精度を確認し、超えてさらにクローン線を特徴付けるし、満たすすべての幹細胞、ゲノム、クローンの識別に使用することができます品質管理試金の様々 ながあるし、細胞生物学的基準は研究を将来的に使用.細胞生物学・機能の試金を使用して、適切な表現、ローカリゼーション、および融合タンパク質12の機能を確認できます。未編集のペアレンタル コントロールに比較は、編集プロセスのローカリゼーション ・動態・機能に及ぼす影響の評価に役立ちます。他のアッセイなど成長解析とゲノム安定性をテストすることができますは、タグ付きタンパク質がセルに摂動かどうか。使用すると、このプロトコルでは、多能性マーカーと微分の潜在性の評価が下流の貴重なクローン研究12を決定する際に重要なことができます。文化を拡張したため、遺伝的不安定性、成長率を監視していくことが示されているし、クローン細胞の染色体はまた重要な12,37。ただし、最終的なもの編集されたセルの使用レベルと幅広い品質管理分析が最終的に決定して、アプリケーションによって異なります。

ゲノム編集戦略、細胞プロセスを研究に CRISPR/Cas9 特にの使用になってますますアクセスし貴重な1,2,3,4,5,6,7. CRISPR/Cas9 の多くのアプリケーションの一つは、遺伝子やタンパク質製品8 の活動のためのレポーターとして特定のゲノム遺伝子座に GFP など大規模な外因性シーケンスの (監督ホモロジー修理 (HDR)) で導入.この手法を使用して、内局と5 興味の蛋白質のダイナミクスを可視化する結果の内生的規制の融合蛋白質を使用できます。、内因性の開いたリーディング ・ フレームに蛍光タンパク質シーケンスに参加できます。 ,6,9,10,11。タグ内因蛋白質過剰発現システムに比べて多くの利点を提供して、人間のゲノムの大規模なシーケンスの挿入は通常選択範囲または濃縮可能なセルの人口を得るために戦略を求めて非効率的なプロセス簡単に学ぶ5,12であります。
このプロトコルでは、目的の genomic 位置に蛍光タンパク質 (FP) をエンコードの DNA シーケンスの挿入について説明します。プロトコルには、デザインとドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑なリボ核タンパク質 (RNP) の配信 (野生型ピオゲネス s. Cas9 タンパク質合成の CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化 crRNA (tracrRNA)) が含まれています。述べる推定編集した細胞蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えおよび細胞ラインの生成プロセスの充実です。日には、このメソッドは、エピジェネティックまたは (稀に) bi 対立緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグ分類主要な細胞構造を表す 20 5 蛋白質によるラインを生成する使用されています。これらの努力からの結果の編集されたセルは、予想される遺伝的挿入、正しくローカライズの融合蛋白質を表現、多能性と安定した染色体12 (と未発表のデータ) を維持確認されています。このメソッドは、他の複数の生成にも使用されていますシングルとデュアル (同じセルにタグ付きの 2 つの異なる蛋白質) 編集 hiPSCs (未発表データ) の集団。
多くの従来の細胞とは異なり彼ら、二倍体、karyotypically ので安定性非変形、増殖性健康なドナー由来ヒト Ips はこれらのゲノム編集の努力のため選ばれました。これらのプロパティは、基本の細胞生物学と疾患モデリングを勉強するため魅力的なモデルを提供します。なお、hiPSCs の微分の潜在性は様々 な系統、同質細胞オルガノイド、組織「皿に病気」モデル13 などを用いたセル型並列で複数の発達段階を研究する機会を提供します ,14,15。このプロトコルは hiPSCs (WTC 線) の開発は、他の哺乳類セルラインを使用してプロトコルの開発のために有益かもしれません。

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters、または</td><td></td><td> in silicoドナープラスミド設計</td></tr><tr><td>TEバッファーpH 8.0</td><td>IDT、または類似の</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO2インキュベーター、または類似</td>の<td>ThermoFisher Scientific、または類似の</td><td>51030408バイオ</td><td></td></tr><tr><td>インフォマティクスソフトウェアピペット(1000 &micro;L、200 &micro;L、20 &micro;L、10 &micro;L、2、マイクロ;L)</td><td>レイニン、または同様の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ(1000 &micro;L、200 &micro;L、20 &micro;L)</td><td>レイニン、または類似の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット(200 & micro;L)</td><td>レイニン、または類似</td><td></td><td></td></tr>の<tr><td>血清ピペット(25 mL、10 mL、5 mL)</td><td>Costar、または</td>Quiksip用の類似<td></td><td></td></tr><tr><td>のブランド8チャンネルマニホールド、オートクレーブ可能な</td><td>Millipore Sigma、または同様の</td><td>BR704526-1EA</td>は<td>、Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips、Pure 10、</td></tr><tr><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips、Pure 10</td><td>Thermo Fisher、または類似</td>の<td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2ピペット</td><td>コントローラーDrummond、または類似の</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てパスツールピペット</td><td>VWR、または類似の</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>クラスII、タイプA2生物学的安全キャビネット</td><td>CELLGARD、または同様の</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックス、成長因子低減</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>ロットは、hiPSCで使用する前にテスト済み</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-phenol red)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>WTC hiPSC line</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC line</td><td>Corie</td><td>GM25256</td> ll に推奨される増殖培地 この<td>プロトコルで使用される hiPSC ラインは Coriell</td></tr> <tr><td>を通じて入手可能です組織培養ディッシュ 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-well Cell Culture Plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ポリスチレン コニカル</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 合成 crRNA、未修飾 (カスタム配列)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>組換え野生型 連鎖球菌 pyogenes Cas9-NLS 精製タンパク質、40 & micro;M</td><td>カリフォルニア大学バークレー校 QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カスタムドナープラスミド (PriorityGENE)</td><td>Genewiz</td><td></td> ドナーインサートデザインは、Genewiz DNA LoBind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021 NucleoBond Xtra Maxi EF Clontech 740424.50 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Neon Transfection System ThermoFisher によって合成され、pUC57 バックボーンにクローニングされました<td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System, 100 & マイクロ;L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ セルストレーナーキャップ付き</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 高透明度ポリプロイレンコニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo バージョン10.2</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL 血液銀行生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>8504</td><td>は、防腐剤フリーのFACSバッファーオ</td></tr><tr><td>リンパスSZX7ステレオ顕微鏡、または同様の</td>オ<td>リンパス、または同様の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート、96ウェル</td><td>ファルコン</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート、Vボトム</td><td>CELLSTAR351180</td><td></td><td></td></tr><tr>として使用されています<td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>96ウェルプレート形式の細胞の凍結保存バッファーとして使用</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル 細胞培養プレート</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 crispr/cas9 を使用して

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

エクスプレス内因性タンパク質融合フレーム N 末端または C 末端蛍光タグひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を生成するためのプロトコルが表示されます。原核生物の CRISPR/Cas9 システム (クラスター化された定期的に空間短回文 CRISPR/繰り返し関連付けられている 9) は、大規模な外因性シーケンス相同監督修理 (HDR) でゲノムの遺伝子座に導入するに使えます。目的のノックアウトのために、このプロトコルはリボ核タンパク質 (RNP) を採用しています-ベースのアプローチを細胞への野生型化膿連鎖球菌Cas9 タンパク質、合成 2 一部ガイド RNA (gRNA) やドナー テンプレート プラスミドの配信先エレクトロポレーション。蛍光付けられた蛋白質を表現する推定編集されたセルは、蛍光性によって作動セル (FACS) の並べ替えで濃縮されています。系統が生成され、精密な編集の結果を分析することができます。興味の遺伝子の genomic 位置に蛍光タグを導入し、結果内局と融合タンパク質のダイナミクスを内因性規制、従来の過剰発現の重要な改善点に師事することができます。システム。遺伝子のタグ付けのためのモデル システムとして hiPSCs の使用は、二倍体、トランスのセルに付けられた蛋白質を調査する機会を提供します。HiPSCs は、複数の細胞のタイプに区別できます、のでこのアプローチを作成し、さまざまな同質細胞コンテキストの付けられた蛋白質を研究する機会を提供します。

この実験の目的は、LMNB1 遺伝子 (タンパク質の N 末端) の 5ʹ の終わりに mEGFP シーケンスを導入することにより核ヒトラミン B1 蛋白質 mEGFP (単量体強化された GFP) の融合をだった。リンカー (アミノ酸配列 SGLRSRAQAS) は、マイケル ・ デビッドソン蛍光タンパク質コレクション21から以前の cDNA の構造に基づいて選ばれました。潜在的な crRNA の認識とで胸の谷間を混乱させる可能にするので各候補者 crRNA のドナー テンプレート プラスミドの crRNA 結合領域は、mEGFP とリンカー順序のインシリコ挿入後中断された、点突然変異は必要ありません。ドナー シーケンス (図 1) の Cas9。ドナーの配列には、1 kb の相同性腕 mEGFP リンカー順序の両端の側面が含まれています。結果として得られる 2,734 シーケンスを確認、pUC57 バックボーンに複製された DNA の bp とエンドトキシン マキシ準備を使用して結果のドナー テンプレート プラスミドを精製しました。ドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑な RNP 導入させた、推定編集した細胞を濃縮した、mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の局在を蛍光顕微鏡 (図 2) で確認しました。CrRNA1 トランスフェクションから結果だけは両方の crRNA シーケンス生産推定編集集団12ここでは、とおりです。
推定編集を表す 0.95 %megfp 陽性細胞が細胞に含まれている transfected LMNB1 crRNA1 gRNA、Cas9 蛋白質またはドナー テンプレート プラスミド エレクトロポレーション反応 (バッファーのみ) には含まれていない、負の制御と比較されたときmEGFP 核ヒトラミン B1 人口 (図 3 a)。この結果は、ノックイン効率以前に報告された12として、このメソッドを使用して多くのゲノム遺伝子座の間で観察の範囲内だった。
MEGFP 陽性細胞は、FACS により分離され、核封筒に mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の予想される局在を確認するライブ顕微鏡によるイメージングします。FACS 濃縮後細胞 LMNB1 crRNA1 の人口からの約 90% は mEGFP 陽性 (顕微鏡検査によって決定される) として示唆いくつかの mEGFP 陰性細胞は共同並べ替えプロシージャ中に GFP 陽性細胞の精製されました。これは、成功を編集するため、遺伝子選別できる 96 クローンのピッキングに使用できる濃縮の許容可能なレベルだった。一般的に、成功した濃縮のためのカットオフは 50 %gfp 陽性。
並べ替えられたセルの人口の大半は非分裂細胞の核膜 (核周辺) に蛍光を表示され、有糸分裂提供する自信を持って正しいゲノム中に細胞質内の拡張核ラミナを LMNB1 で編集軌跡。豊かな人口には、明るいまたは暗い信号を持つセルが含まれています。この信号強度の違いは正しいと不適切な結果とハイライトの系統が遺伝的検証をさらに生成するユーティリティ研究 (説明参照) の編集の組み合わせを反映可能性があります (図 3 b)12。系統発生後検証顕微鏡実験 (図 3 c) で均一の GFP 強度を示した細胞が遺伝子。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 図 1.LMNB1 遺伝子の N 末端 GFP タグの戦略を設計する。GFP タグ染色体 5 にある LMNB1 の最初のエクソンの N ターミナル挿入 5ʹ 設計されました。5ʹ と 3ʹ の両方の相同性の武器は 1 kb と開始コドン (ATG) と 2 番目のコドン (ホモロジー腕だけ部分的に図で表される) との間を満たす。2 候補者 crRNAs まだゲノム内で一意でありながら、可能な限り目的の挿入サイトに近い切断する Cas9 をご案内しています。MEGFP とアミノ酸リンカーのシーケンスは開始コドン (ノンスケール mEGFP とリンカー順序) の挿入だけ 3ʹ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 図 2.タグ付きの内生生産ワークフローによる系統。トランスフェクション コンポーネント、ホモロジー腕 (HAs、金で示されている) を含むドナー テンプレート プラスミド (金 crRNA と紫の tracrRNA と赤の Cas9 蛋白質を示す)、Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 複合体を含むと FP リンカー順序 (で示されている緑) +electroporated。4 日後推定編集 FP 陽性細胞 FACS による濃縮 96 ウェル プレート (1,000 〜 細胞) の単一ウェルに、細胞のすべてを播くことによって集団として拡大し、労働人口数百万のまで文化の拡大細胞が「豊かな人口」として試金することができる (プロトコル手順 3.8 を参照してください).FP 陽性細胞の収量は、HDR12; 可変レートの変動により実験によって異なります成功した濃縮は通常 300 〜 5,000 を含めることができます約 1.6 × 10 のトランスフェクション後のセル6腰セル。予備のイメージング研究は、豊かな人口の融合蛋白質の局在と信号を確認しました。コロニーは拡大し凍結保存のための 96 ウェル プレートに手動で選ばれました。ゲノムの品質管理審査をさらに液滴デジタルを使用して PCR (ddPCR) および他の PCR に基づく試金を使用して前述の12として正しく編集したクローンを識別します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 図 3.推定編集したセル人口の濃縮します。(A) 、LMNB1 の流れの cytometry プロット編集セル 4 日後トランスフェクションします。Y 軸は、GFP の強度を表示し、x 軸表示前方散乱。並べ替えのゲートは、バッファー制御に基づいて設定しました。HiPSCs は摂動に敏感なのでライブ/デッド汚れが省略され、非常に保守的な FSC/SSC ゲートが代わりに使用されました。(B)濃縮後、LMNB1 Cr1 の人口編集細胞核封筒 (予想 LMNB1 局在) にローカライズする GFP と細胞の ~ 90% を示した。人口は、いくつかの GFP 陰性細胞と同様、程度は GFP の細胞に含まれています。スケール バーは、10 ミクロンです。(C)系統世代後の細胞は、細胞周期依存の違いと、均一な GFP 強度を示した。スケール バーは、20 ミクロンです。

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

このプロトコールの目標は、末端フレームNまたはC末端蛍光タグに融合した内因性融合タンパク質を発現するヒト誘導多能性幹細胞を生成することです。目的のノックインを達成するために、CRISPR-Cas9システムと、野生型S.pyogenes Cas9タンパク質と合成2部CRSPR RNAおよびtracrRNAを使用したリボ核タンパク質ベースのアプローチを使用します。このRNPは、エレクトロポレーションにより、ドナープラスミドとして目的の蛍光タグ配列と同時導入されます。蛍光タグ付きタンパク質を発現する推定編集された細胞は、FACSによって濃縮されます。その後、正確な編集結果を分析するためのクローンラインが生成されます。この遺伝子編集プロトコルには、従来の過剰発現コンストラクトに比べて多くの利点があります。蛍光タグがゲノムに導入されるため、得られた融合タンパク質の細胞内局在と動態を内因性制御下で研究することができます。ここでは、二倍体の非形質転換細胞のタグ付きタンパク質を研究できるため、人工多能性幹細胞をモデルシステムとして使用します。さらに、ここに示されている心筋細胞細胞のように、細胞は複数の細胞タイプに分化することができるため、このアプローチは、さまざまな同質遺伝子の細胞状況でタグ付きタンパク質を作成および研究する機会を提供します。しかし、慎重に最適化することで、このプロトコルは他の哺乳類細胞タイプのゲノム編集に適合させることができます。こんにちは、私はアマンダ・ハウプトです、ここアレン細胞科学研究所の幹細胞および遺伝子編集チームの一員です。今日、私たちはこのアプローチを使用して、内因性融合タンパク質を発現する35種類以上の細胞株を作製しています。これらを用いて、多種多様なユニークな細胞構造やプロセスを研究しています。このアプローチは、私たちのグループでこれまでに試みられた遺伝子座の最大95%で成功しています。この方法は、生細胞内のタンパク質のダイナミクスをより深く理解することに関心のある細胞生物学者にとって特に有用です。しかし、編集されたクローンラインが生成されると、研究の可能性は無限大です。この方法により、ゲノム配列に他の混乱を生じさせることなく、モノアレル蛍光タンパク質タグを持つクローンを一貫して同定することができます。また、バイアスレル編集されたクローンを取得することもあります。このビデオでは、内因的に制御された蛍光融合タンパク質を発現するクローン細胞株のトランスフェクション、FACS濃縮、単離における重要なステップをいくつか紹介します。トランスフェクションの2〜3時間前に、増殖培地に補充した10マイクロモルのROCK阻害剤でhiPSCを治療します。これにより、エレクトロポレーション後の生存が促進されます。この処理後、細胞はとがった外観になります。トランスフェクションの前に、単一細胞解離領域と円錐形チューブに回収した細胞懸濁液を使用して、細胞を組織閉鎖プレートから細胞を除去する必要があります。トランスフェクションする各実験条件について、6つの細胞に1.84倍の10のアリコートを調製します。1.5 mil チューブに 2.88 マイクロリットルの 10 マイクロモル ガイド RNA と 2.88 マイクロリットルの 10 マイクロモル Cas9 を添加して、各トランスフェクション用のリボ核タンパク質複合体チューブを調製します。室温で最低10分、最大1時間インキュベートします。前のステップで調製した細胞アリコートをGの211倍で室温で3分間ペレット化します。次に、上清を吸引し、220マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーで細胞ペレットを回転させます。220マイクロリットルの再懸濁細胞を、事前に調製した1.5ミルのRNP複合体チューブに加えます。1マイクロリットルのドナープラスミドにつき1マイクログラムの4.6マイクロリットルを追加します。.ヌクレオフェクションチップとピペットを使用して2つの内容物を2〜3回混合し、100マイクロリットルの懸濁液を調製したエレクトロポレーション装置に移します。先端に気泡を入れないようにしてください。30ミリ秒の1パルスに対して1300ボルトを印加します。懸濁液を渦巻く動きで準備した6ウェルプレートに静かに移します。プレートを左右および前後にゆっくりと動かして、細胞を分散させます。すべての実験条件とコントロールについて繰り返した後、トランスフェクションした細胞を摂氏37度、5%CO2で24時間インキュベートし、培地をROCK阻害剤を含まない通常の増殖培地に24時間交換します。その後、24時間ごとにhiPSCに72〜96時間栄養を与え続け、その合流性を監視します。hiPSCが68〜80%のコンフルエントに達すると、FACS濃縮に進みます。トランスフェクションの2〜3時間前に、10マイクロモルのROCK阻害剤を増殖培地に添加してhiPSCを処理し、FACS濃縮後の生存を促進します。細胞を選別するには、シングルセル解離試薬を使用してプレートから細胞を取り出し、35ミクロンメッシュフィルターでhiPSC懸濁液をろ過してポリスチレン丸底チューブに入れます。前方散乱光と横散乱光を使用して、高さと幅、3連符の破片、ダブレットを含むセルを並べ替えます。ライブバッファーのみの制御セルを使用して、FP陽性ゲートを設定します。たとえば、バッファーのみのセルがゲート内に収まるようにします。幹細胞をソーティングするときは、ディスカッションセクションで提案されているように、細胞の生存を促進するために機器の設定を適応させます。FACSによるFP陽性細胞の割合によって決定される典型的なノックイン効率は、0.1%から5%の範囲であり、10マイクロモルのROCK阻害剤を補充した室温成長培地の0.5〜2ミルを含む1.5〜15ミルのポリプロピレンチューブに細胞を分類します。収集した細胞をGの211倍で室温で3分間遠心分離します。上清を慎重に吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した200マイクロリットルの成長培地に細胞ペレットを再懸濁します。最大3,000個のアソートセルを、新鮮なマトリゲルコーティングされた96ウェルプレートの1つのウェルに移します。選別した細胞を摂氏37度で5%CO2中で24時間インキュベートし、培地を5マイクロモルROCK阻害剤を添加した増殖培地に24時間交換します。その後、48時間後に、24時間ごとにROCK阻害剤なしで細胞に定期的な増殖培地を与え続け、72〜96時間、コンフルエンシーを監視します。細胞が十分に成熟し、96ウェルプレートから継代できるようになったら、徐々に大きなプレートに継代することをお勧めします。したがって、たとえば、96ウェルプレートの1つのウェルから、24ウェルプレートの1〜2ウェルに移動します。そして、そこから6ウェルプレートなどに入れ、下流の目的に十分な細胞ができるまで。通常、最小で300万から400万個のセルです。懲罰的に編集された細胞のFACSが豊富な集団からクローン株を生成するには、単一細胞懸濁液に継ぎ、10センチメートルのプレートに1万個の細胞をプレートし、コロニーを5〜7日間成長させます。コロニーが巨視的に見える場合、コロニーは分離するのに十分な大きさです。解剖顕微鏡では、P200ピペットを使用して、プレート表面から個々のコロニーを優しく掻き取り、吸引します。コロニーを含むボリュームを96ウェルプレートの1つのウェルに移します。すべてのコロニーを移した後、プレートを組織培養インキュベーターで摂氏37度、CO25%で24時間インキュベートします。24時間後に培地をROCK阻害剤を含まない通常の増殖培地に交換します。次に、コロニーのサイズが約3倍になるまで、24時間ごとに72〜96時間細胞に栄養を与え続けます。ゲノムDNA抽出のためのアンタリスを凍結保存するのに十分な細胞を持つためには、細胞を96ウェルプレートで増殖させ、継代する必要があります。詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。96ウェルプレートを通過させるには、8チャンネルアスピレーターを使用して、最初のカラムから媒体を除去および廃棄します。P200マルチチャンネルピペットを使用して、プレートの最初の列に約200マイクロリットルのDPBSを加えて細胞を洗浄します。次に、8チャンネルアスピレーターを使用して、最初のカラムからDPBS洗浄液を取り外して廃棄します。次に、40マイクロリットルの解離試薬を最初のカラムに加えます。これらの手順を一度に1列ずつ繰り返し、96ウェルプレートの合計6列まで作業します。井戸を交差汚染しないようにヒントを変更します。解離試薬を最初のカラムに添加してから3〜5分間、プレートをインキュベーターに置きます。プレートの最初のカラムの細胞が底部から浮き上がり始めたら、P200マルチチャンネルピペットを使用して160マイクロリットルのDPBSを最初のカラムに追加し、各ウェルの12時、3時、6時、および9時の位置で細胞を穏やかにトリチュレートします。細胞懸濁液を含む全容積をVボトム96ウェルプレートに移します。解離試薬が含まれている残りのカラムについて、ウェルを交差汚染しないようにチップを変更して、これらの手順を繰り返します。遠心分離機でV底板をGの385倍で室温で3分間回転させます。この時点までに示した96ウェル継代用のサブは、このプレート形式で細胞を継代するたびに同じ方法で行われる。次に、細胞を96ウェル形式で凍結保存する準備ができている場合の進め方を示します。詳細については、書面によるプロトコルを参照してください。前のセクションで示した遠心分離ステップの後、P200マルチチャンネルピペットを使用して上清を吸引し、10マイクロモルのROCK阻害剤を添加した60マイクロリットルの成長培地に再懸濁します。すべてのウェルで繰り返し、交差汚染しないようにヒントを変更します。30マイクロリットルの細胞懸濁液を非マトリゲル被覆96ウェル組織培養プレートに移します。残りの30マイクロリットルの懸濁液を姉妹プレートに移し、混合せずに各ウェルに170マイクロリットルの凍結バッファーを迅速に追加します。このプロセスは、個々のプレートの1つが解凍された後に細胞のバックアップ集団が存在するように、重複した姉妹プレートで行われることに注意してください。凍結保存された細胞を96ウェルプレートの他のすべてのカラムにのみ挿入することで、より速い解凍が可能になります。プレートをパラフィルムで包み、蓋付きの室温の発泡スチロールボックスに入れます。箱全体をマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。24時間後、プレートを発泡スチロールの箱から移し出し、マイナス86°Cで最大4週間選別することができます。ヒト人工多能性幹細胞を96ウェルフォーマットで凍結保存すると、細胞培養の時間的中断が可能になります。研究者は、クローン鉱山でゲノム検証アッセイを実施して、将来の研究のために解凍する遺伝的に望ましいクローンを特定できます。WTC hiPSC株に標的特異的ガイドRNA Cas9タンパク質と慎重に設計されたドナーテンプレートプラスミドをトランスフェクションしてから4日後、0.95%の細胞がGFPを発現していることが観察されました。FACSを用いて、すべてのGFP陽性細胞を濃縮集団として選別しました。予備的な顕微鏡検査により、mEGFP核ラミンB1融合タンパク質の核膜への局在が予想されることが明らかになりました。蛍光標識されたタンパク質は、さまざまな強度の細胞の約95%で観察されました。クローンライン作製後、均一なmEGFP強度のクローンを取得し、さらに解析して精密な編集を行いました。結論として、我々は、内因的に制御された蛍光融合タンパク質の発現のためのヒト誘導多能性幹細胞の遺伝子編集のためのトランスフェクション法を示した。典型的なノック非効率性は低いため、ここに示すFACS法のような一部の濃縮戦略は、融合タンパク質を発現する推定的に編集された細胞の集団をもたらします。濃縮された集団は、生物学的研究に用いることができるか、またはこの方法に記載されるようにクローン株を生成することができ、それによって、正確に遺伝子編集された細胞株を同定することが可能になる。Cas9が誘発するゲノムの二本鎖切断は、意図した遺伝子座にタグが組み込まれているにもかかわらず、しばしば不正確に修復されることを覚えておくことが重要です。さらに、モノアレル編集されたクローンでは、タグなし対立遺伝子には、非相同末端結合修復によって引き起こされる可能性が最も高いインデルが頻繁に含まれています。これらの知見は、クローン細胞株のゲノム解析を通じてのみ明らかになったCRISPR Cas9ノックイン後の遺伝的検証の重要性を強調しています。期待される融合タンパク質の発現だけでは、正確な編集が保証されるわけではありません。このプロトコルをヒト人工多能性幹細胞の編集に使用する場合は、書かれたプロトコルに詳述されている推奨事項に従って、細胞の穏やかな取り扱いを確保し、最適な細胞生存と最小限の自然分化を実現するように注意してください。このビデオと関連するプロトコルおよび材料リストが、お気に入りのタンパク質についてご自身の研究室で同様の実験を行うのに役立つことを願っています。ご覧いただきありがとうございます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic...

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on...

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このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたヘテロ接合性またはホモ接合ヌクレオチド変化の生成を容易にする方法を提供する。...

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シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26...

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。...

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

Caenorhabditis elegansの生殖細胞における内因性蛍光タグ付けのためのCRISPR/Cas9マイクロイン注射ワークフローで、in...

CRISPR/Cas9を媒介したカエノラブディティス・エレガンスにおける生殖細胞特異遺伝子の内因性蛍光タグ付け

学ぶCRISPR/Cas9を用いたヒトiPS細胞における内因性タンパク質の蛍光タグ付け法。電気穿孔とFACSで編集細胞を濃縮し、クローン樹立で正確なゲノム編集を確認できます。

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

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