体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

この方法は、細胞の組織化と膜に関する重要な質問、たとえば、幾何学的な手がかりがプロセスでどのような役割を果たすかに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、タンパク質濃度など、パターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御できることです。まず、テキストプロトコルで説明されているように、マルチラメラ小胞を生成します。

次に、最初にホットプレート上に摂氏70〜99度の水を入れたビーカーを準備し、液体窒素を保持する容器を準備して、脂質を7〜10サイクル凍結解凍します。バイアルを大きなピンセットで液体窒素に保持し、窒素の沸騰が止まるまで待ちます。次に、溶液が完全に解凍されるまでバイアルをお湯に移します。

混合物によっては、脂質混合物が目にはっきり見えるまで、これらの手順を繰り返します。次に、脂質エクストルーダーを組み立て、システムをMin bufferで予備すすぎます。脂質混合物を50ナノメートルの細孔サイズの膜を通して35〜41回押し出します。

メンブレンを横切らなかった凝集体を避けるために、奇数のパスで終了するようにしてください。ガラスカバースリップを逆さまのガラスシャーレまたはその他の不活性な表面に分散させます。ガラスピペットを使用して、各カバースリップの中央に7滴の濃硫酸を追加します。

次に、酸滴の中央に50%過酸化水素を2滴加えます。反応を覆い、少なくとも45分間インキュベートします。次に、ピンセットを使用してカバーガラスを個別に持ち上げ、超純水で酸を洗い流します。

洗浄したカバースリップを焦げ付き防止ホルダーまたは同様の輸送装置に入れます。次に、各カバーガラスを超純水で広範囲にすすぎ、加圧ガスで表面を乾燥させます。カバースリップのきれいな面に油性マーカーで印を付けます。

チャンバーを組み立てるには、まず0.5ミリリットルの反応チューブの蓋と円錐形の部分を切り取り、鋭利なハサミで廃棄します。次に、チューブの上縁にUV接着剤を塗布し、ピペットチップを使用して接着剤を均等に分散させます。チューブを逆さまにしてカバースリップのきれいな面に接着します。

最後に、360ナノメートルのランプまたはLEDの下に複数のチャンバーを5〜15分間配置して、UV接着剤を硬化させます。担持脂質二重層形成のためには、ヒートブロックを摂氏37度に予熱し、2ミリリットルの反応チューブをMinまたはSLBバッファーと1チャンバーにつき1本のチューブでインキュベートします。組み立てられ硬化したチャンバーに窒素を吹き込み、UV硬化および組み立て中に沈殿した可能性のあるほこりやその他の粒子を取り除きます。

次に、チャンバーをヒートブロックに置きます。20マイクロリットルの透明脂質アリコートを130マイクロリットルのMin緩衝液で希釈し、0.53ミリグラム/ミリリットルの作業濃度を構築します。各チャンバーに75マイクロリットルの脂質混合物を追加します。

次に、タイマーを 3 分に設定します。インキュベーション時間中、小胞は親水性ガラス表面で破裂し、融合してコヒーレントSLBを形成します。60秒が経過したら、各チャンバーに150マイクロリットルのMinバッファーを追加します。

残りの120秒後、200マイクロリットルのMinまたはSLBバッファーを追加して各チャンバーを洗浄し、数回慎重にピペッティングして、さらに200マイクロリットルを取り外して追加します。各チャンバーを1回洗浄したら、2ミリリットルのバッファーが使い果たされるまで、最初のチャンバーを完全に洗浄します。担持脂質二重膜の洗浄には、チャンバー内の動きの範囲を完璧にし、正しい洗浄強度を見つけるために、ある程度の経験が必要です。

パターン化されたシリコンウェーハからPDMS微細構造を作製するには、まずプラスチックカップを使用して10グラムのPDMSベースと1グラムのPDMS架橋剤を計量します。混合装置を使用して、PDMS混合物を混合および脱気します。次に、ピペットチップを使用して、少量のPDMSをシリコンウェーハ上の構造に直接滴下します。

すぐに1カバースリップをPDMSドロップに置き、清潔なピペットチップの上端を取り、カバースリップをシリコンウェーハにそっと押し付けます。PDMSは、カバースリップとシリコンウェーハの間に薄く広がっている必要があります。カバーガラスを貼ったウェーハをオーブンに入れ、PDMSを摂氏75度で3〜4時間、または一晩硬化させます。

次に、ウェーハをオーブンから取り出し、室温まで冷まします。カミソリの刃で、付属のPDMSの入ったカバースリップをシリコンウェーハから慎重に取り外します。次に、ガラスについて前述したように、プラスチックチャンバーをPDMSに取り付けます。

チャンバーが取り付けられたカバースリップを取り、プロセスガスとして酸素を入れたプラズマクリーナーに入れます。カバースリップをプラズマで清掃します。この作業では、30%の電力と0.3ミリバールの酸素圧を1分間使用しました。

次に、ガラスで前に説明したように、チャンバー内でSLBを準備します。自己組織化アッセイを行うには、チャンバー内のバッファー容量を200マイクロリットルのMinバッファーからタンパク質とATP溶液の量を差し引いた値に調整します。次に、MinD、MinE、および必要に応じてMinCとラベル付けしたMinDを添加し、ピペッティングで成分を穏やかに混合します。

次に、2.5ミリモルATPを追加して、MinDEの自己組織化を開始します。次の10〜30分間で、蛍光顕微鏡で定期的なMinDEパターンの形成と適切に形成された微細構造を確認します。規則的なMinDEパターンが形成されたら、2回ピペットでゆっくりと上下させて成分を混合します。

100マイクロリットルのピペットを使用して大量のバッファーを取り出し、残りの部分を10マイクロリットルのピペットで慎重に取り出します。イメージング時間を長くするには、湿らせたスポンジをチャンバー内に差し込みます。スポンジがカバースリップの表面に接触しないようにしてください。

微細構造中の残留バッファーが乾燥しないように、すぐにチャンバーを蓋で閉じてください。微細構造をイメージングする前に、マイクロキャビティ内のタンパク質が振動している間、PDMS微細構造上でMinDEの自己組織化が停止していることを確認してください。この代表的なビデオでは、デュアルカラーイメージングにより、MinDとMinEが自己組織化して、支持脂質二重膜上のらせん状パターンに適合する進行表面波になる様子を示しています。

ここでは、シングルカラーイメージングにより、MinDとMinEがPDMS微細構造で極間振動を行っていることが示されています。振動は、コンパートメントの極で最大の濃度とコンパートメントの中央で最小の濃度を持つ、時間平均化されたMinD濃度勾配を確立します。この手順に続いて、膜結合速度と滞留時間を決定するために、単一粒子追跡などの他の方法を実行できます。

ピラニア溶液での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に個人用保護具などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。