Name: 体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ MinDとMinEタンパク質の自己組織化を人工脂質二重膜上で再構成する方法。PDMS微小区画を用いて幾何学的制約下でのパターン形成を制御し、細胞生物学と膜動態の研究を進展させる。

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プロトコルを説明しました MinCDE 平面上の自己組織化の in vitro再構成サポート脂質二重膜、脂質二分子膜覆われて立体構造 PDMS 微細構造の棒形の例を使用します。これらの試金から貴重なデータを取得するために制御する最も重要な要因、蛋白質および膜の品質です。
蛋白質、蛋白質品質を確実に SDS-PAGE と質量分析法を使用して質量を確認する必要があります。さらに、タンパク質、水溶性いない集計データ、分析ゲルろ過や動的光散乱による検証する必要があります。ゲル濾過法は、タンパク質の集約された端数を削除する使用できます。慎重な pH 調整と追加されたヌクレオチドの質が重要なタンパク質に非調整または部分的に劣化したヌクレオチドの付加として株式や自己組織化の試金は蛋白質の活動、そのため廃止を除去するために十分です自己組織化。
蛋白質品質の横にある膜の品質は最も重要な不適切な膜形成はほとんどの場合、欠陥の自己組織化と artefactual 表面構造の起源のための原因。
初めてのプロトコルを実行している場合、人工脂質膜を含む低モル パーセントの Atto-655-ドープなど DiI 標識脂質 (0.05%) でラベル付けに便利です。それによりプロパティおよび膜の品質は直接判断することができます。FRAP を用いた膜の流動性を評価できます。さらがいずれかのすべてでは、あまりにも多くの小胞やないの流体膜ない膜になる洗浄されている場合、直接、SLB の洗浄品質を評価 1 つできます。開いた区域により厳密な膜を洗浄して、それゆえまた、SLB の表面に付着、小胞を削除します。クリーニングと支持面と正しいサイズの親水性、対SU の均質性膜は、流体と同質の脂質を取得するための最も重要な要因それは SUV サイズとサイズ分布を使用してチェックすると便利することができます。動的光散乱します。狭い粒径分布、膜小胞を押し出すのではなく、sonicating それらをお勧めします。クリーニング coverslips、強塩基、基本的な洗剤または水で洗浄した後に直接 coverslips を使用してトリートメントなどの他の方法は、アプリケーションと脂質の混合物によって、良好な結果をもたらす可能性があります。
紹介、オープンの部屋で平面のサポートされている脂質膜の in vitro再構成プロトコルの最初の半分が全反射顕微鏡30、FRAP などの光学系のアクセス可能な表面のレンダリングの利点分析6、単一粒子追跡原子間力顕微鏡26など表面プローブ技術と同様に、34。大均一領域で定義された濃度でより良い統計できます。さらに開いた区域アプローチは蛋白質の集中そしてさらにコンポーネント、それゆえシングルチャンバー20の蛋白質の集中を滴定する許可を迅速かつ簡単な追加を正確に制御できます。アッセイは、FtsZ22,35、ZipA22キメラタンパク質 FtsZ YFP MTS10,35など他の細菌 divisome のコンポーネントを追加して拡張できます。
他のグループは、分システム、体外、代わりに開いた区域17,18,19使用流体セルの再構成に似たようなアプローチをとっています。フロー セル利点がある、特に完全に囲まれた 3 D 環境が必要な18、流れ17,19,23の影響または膜組成23 MinCDE のパターンには調査、または蛋白質パターンは、タンパク質制限条件19の下で観察される場合。それにもかかわらず、分子の濃度の局所制御が難しくなります。膜に強く結合するタンパク質成分、特に心、彼らの出会い18,19。私たちの経験では蛋白質は頻繁チューブ、入り江、注射器やその他のマイクロ部品に非特異的結合を展示します。したがって、ローカル蛋白質濃度入力濃度18とは異なります、またフローセル、19他の人によって観測されたさまざまな異なるタンパク質パターンの入口と出口の間膜上の結果の長さの異なります。
2 番目のプロトコルの半分は、ここで提示棒状組織脂質で覆われているパターンのサポートに開いた区域アプローチを再使用の in vitro再構成膜は、生体内の蛋白質の動作の単純な模倣にもかかわらず蛋白質濃度を正確に制御がバッファー除去のため失われます。だの波長は約 1 桁大きい体外体内より棒状 microcompartments がについて 1 つ桁違いに大きい (10 x 30 μ m) 棒状大腸菌よりもセルに注意してください。
全体的に、このプロトコルは、タンパク質濃度、バッファー組成、膜特性を含むすべての条件を正確に制御できます。3 D の構造化されたサポート使用する空間拘束、生体内の複雑なマイクロ流体装置を必要とせず動作を模倣に師事する反応。

時空間パターンは規制の細胞分裂1,2形態から多細胞と細胞レベルで、複雑なタスクを調整する性質に不可欠です。反応拡散系は、これらのパターンの確立に重要な役割を果たすが、まだよく理解されています。これまでのところ反応拡散系と特徴づけられる最高の生物学的システムの典型的な例は大腸菌・ MinCDE システム3,4,5,6,7です。MinCDE システムはフューチャー部門サイトとしてセルの中心を決定するエシェリヒア属大腸菌の細胞極に細胞極から発振します。このシステムは、鉱山と空間反応行列8として膜蛋白質のアクティブ化 atp アーゼ、atp アーゼ心に基づいています。ミンツはパターン形成機構の一部ではないが、実際の機能エージェント: 主な divisome 蛋白質 FtsZ5,6の阻害剤。ミンツの心にバインドし、従って続く振動、細胞極で極大値と極小セル中央には、タンパク質の時間平均濃度勾配の結果のみを midcell9,10 時忘 FtsZ を許可.MinCDE システムは細菌2、時空間の組織配置と輸送タンパク質複合体11とプラスミド12およびセルを調整するための鍵は、ウォーカーの Atpase の大きな家族の一員部門13と染色体分離14。したがって、MinCDE 反応拡散系だけでなく、典型的な反応拡散系を表しますもの関連性細菌における時空間の組織のため注目を集めています。
MinCDE システムは、生体内での機能を解明は、タンパク質と遺伝子の削除の操作は通常細胞分裂の欠陥の結果、複雑です。さらに、膜の組成や生体内で細胞質のプロパティを変更することは非常にチャレンジングな15,16。システムと影響因子を変更は細胞分裂としてそのような本質的な機能に邪魔されてさらにその細胞の複雑な環境で解釈するは難しい。私たちと他の人ためになっているの in vitro再構成アプローチ、コア コンポーネントにシステムの削減: 心、鉱山、エネルギー源として ATP と反応行列6,17,として脂質18. このボトムアップ ・ アプローチにより、生きている細胞の複雑な詳細に自己組織化のメカニズムを調査します。旅行表面蛋白質フォーム波の波長、通常体内のより大きい大きさについてとはいえ6とパターン17,19これらの条件の下での他の種類。パターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御を容易に開いた区域の使用: ATP 濃度、バッファー組成、膜組成10蛋白質プロパティ20タンパク質濃度66、としてエージェント21と他の divisome 蛋白質22混雑感など他の要因を追加。比較では、フローセル18,19,23 MinCDE システムの in vitro再構成を流れ17,23, タンパク質の影響を調査する使用ことができます。条件19、膜組成19完全 3次元閉じ込め18タンパク質パターンの制限、蛋白質/成分濃度および複雑なシーケンシャル コンポーネントを加えてより多くの正確なコントロールをレンダリングします。
この開いた区域を使用して、我々 も、1 つはどのように幾何学的な境界の影響パターン形成21、最近現象を調べることができる平面脂質二重層のサポートをパターン化調査生体内で細菌を使用されても微細構造7に成形。システム20の影響パターン形成も私にどのように定義された突然変異を調査するこのアッセイを採用しました。さらに、光、アッセイに鉱山、アゾベンゼン架橋のペプチドを導入し、全反射顕微鏡24イメージングによるパターン形成を制御できる方法を調査する同じ基本的な法形式を採用されています。
わかった、だがパターンを複製するために形成を観察生体内での in vitroシステム,監禁されたキー。サポートされている脂質二重膜で覆われただが生体外で(10 x 30 μ m) の大きい波長に調整寸法ロッド型 microcompartments の使用許可だがポール - 振動とタンパク質の勾配形成の再構成10,25。このアッセイで人工脂質膜が上に開いたまま棒状の microcompartments のいくつかの百のレプリカが含まれるパターンの PDMS 基板上に堆積します。これにより、開いた区域の反応を設定できます、それにより小さいボリュームに反応を拘束、microcompartments の縁にバッファーを下げたその後。にもかかわらず、これらのコンパートメントは片側空気バッファー インターフェイスを持って、表さない膜にフル 3 D の閉じ込めがそれ故に、蛋白質ダイナミクス体内振動10、25の真似。フル 3 D の閉じ込めと比べると、18の結果非常に類似を表わす、オープン微細構造分析は比較的単純で簡単に処理し、専門マイクロ装備整ってない所で実行することも、クリーン ルーム設備。
ここでは、提案する脂質二分子膜の in vitro光学顕微鏡によると、マイナーですべてのコンポーネントとの容易なアクセスの制御は、オープンのチャンバーを用いたパターン形成サポート MinCDE の再構成のための実験プロトコル変更、表面プローブ技術26適応可能であるも。平面脂質二分子膜の横にある蛋白質の閉じ込めにできる方法も紹介ロッド型 PDMS の微細組織に及ぼす単純なパターン化されたサポートされている脂質二重層を使用して取得します。これらのアッセイ MinCDE システム向けに最適化が転送することも FtsZ27や28最小限アクチン皮質などの膜を同様の方法で操作する他の蛋白質のシステムに。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli極性脂質抽出物</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&prime;-三リン酸二ナトリウム塩三水和物</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アデノシン5&prime;-二リン酸一カリウム塩二水和物</td>シ<td>グマ</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>ロス</td><td>6781.1</td><td></td></tr>トリ<tr><td>スベース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>ロス</td><td>9277.1TCEP-HCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>テルモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20491</td><td></td></tr>エ<tr><td>チレンジアミン四酢酸</td><td>メルクミリポア</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸98%</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr>過<tr><td>酸化水素50%</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>バイオモル</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>メルク</td><td>102950</td>ウ<td>バソール</td></tr><tr><td>グリセロール 86%</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB 中</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE Atto</td><td></td><td>Tec AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>PDMS架橋剤</td><td>ダウ・コーニング・コーポレーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68および#63はどちらも良好に機能します</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ#1 24x24 mm</td><td>メンゼルGl&auml;</td><td>PDMS微細構造にのみ使用される</td>サービス <td></td></tr><tr><td>0.5 mL 反応チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp;</td><td></td>0030123301</tr><tr><td>培養フラスコ 2L</td><td>Corning</td><td>例: 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfiltration カラム: HiLoad Superdex 75 PG または 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG 脱塩カラム プレパックカラム</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>透析装置:Slide-A-Lyzer透析カセット、3.5K MWCO、0.1-0.5mLまたは0.5-3mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333または66330</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrapure water:Milli-Qタイプ1超純水システム</td>メル<td>ク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動タンパク質精製システム:&Auml;kta Pure</td><td>GE Healthcare ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バスソニケーター</td><td>ブランソン</td><td></td><td>例:モデル1510</td></tr><tr><td>ARE-250ミキサー</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー Zepto</td><td>Diener 電子</td><td></td><td>使用 プロセスガスとして酸素</td></tr><tr><td>正変位ピペット</td><td>ブランド</td><td></td><td>ガラスチップ</td></tr><tr><td>付きトランスファーペットモデルLSM780共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td>、<td>ツァイスC-アポクロマート40X/1.20水浸対物レンズ</td></tr><tr><td><ストロング>プラスミド</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>細胞分子生物物理学部門、MPI生化学、シュヴィレ教授</td>、<td>His-MinDおよび非タグ付きMinEをコードする</td>シュヴィレ<td></td>プラスミド</tr>により、<tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>の収量を向上MPI生化学部門 Schwille</td>プラスミドコード化学科 Schwille<td></td><td>教授 His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td>細胞<td>分子生物物理学部門 MPI生化学専攻 Schwille</td><td></td>プラスミドコード化学科 <td>His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td> 細胞<td>分子生物物理学部門 生化学専攻 Schwille</td><td></td><td>プラスミドコーディング教授His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>MPI of Biochemistry, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmid encoding His-MinC</td></tr></tbody></table>

体外自己組織化人工脂質膜上のタンパク質パターンの再構成

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

細胞の基本的な時空間組織の多くの側面は、反応拡散型システムによって支配されます。このようなシステムのin vitro再構成が実行できない彼らのメカニズムの詳細な研究が可能になります体内。ここでは、MinCDEエシェリヒア属大腸菌細胞中の細胞分裂隔壁の位置する系の生体外の再構成のプロトコルを提供します。アッセイは、のみに必要なコンポーネントの自己組織すなわち膜、心の 2 つの蛋白質と私と ATP の形でエネルギーを供給する設計されています。我々 したがってサポートされている脂質二重膜が形成が観察にオープン反応チャンバーを作製します。商工会議所のオープンな設計は、脂質二重層の最適な準備と一括コンテンツの制御操作します。2 つの蛋白質の心と、私と同様、ATP、細胞膜上一括ボリュームに追加されます。イメージングは、共焦点、広視野設計支援と同様の全反射型顕微鏡として、多くの光学系によって可能です。プロトコルのバリエーションとして、脂質二重膜は、PDMS のミクロのセル状構造、ガラスではなくパターンのサポートに形成されます。これらのコンパートメントの縁に一括ソリューションを下げるより小さいコンパートメントで反応を囲み、体内振動現象の模倣ができる境界を提供します。一緒に取られて、私たちプロトコルについて説明して空間拘束なしの MinCDE システムを再構成する濃度範囲など他の要因の追加のパターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御する研究者を許可します。または蛋白質、体系的に比較的単純な実験のセットアップでシステムの複雑さを増加します。

蛋白質の浄化のプロトコルを次には、Min タンパク質は十分な純度が得られるはず。参考として図 1は心、心、鉱山、ミンツを蛍光標識の SDS-PAGE イメージを提供します。人工脂質膜の非パターン化のだが自己組織化分析を実行するプロシージャの個々 のステップは、図 2のとおりです。このプロトコルを使用すると、(図 3) 庫内正規だが表面波の旅を観察できます。波長で、チャンバ内で多少異なりますが、一般的なパターンのよいます。UV 接着剤のフォームがガラスのプロパティと異なるプロパティを持っているように見える膜表面が (図 3を参照)、定量的な比較は、商工会議所の端を使用しないでください。表面波は伝搬方向 (図 3 b) 強度をプロットすることによって分析できます。心蛍光波のリーディング エッジから高速ではなく高原は、後縁は急激に少なくし、鉱山蛍光心波の開始からほぼ直線的に増加、心後トレーリング エッジでその最大数に達した、それ6著しく落ちる。
蛋白質品質の横にある人工脂質膜の品質は MinCDE の定期的自己組織化にとって最も重要なです。一方で、膜はあまりにも過度に洗浄または基になる表面が洗浄され、従って余りに強く荷電、穴が膜で形作ることができる (図 6 a上)。一方、膜をきちんと洗っていない、または基になる表面はきれいに hydrophilized、小胞膜に固執するだろうまたは膜の流動性が損なわれます (図 6 a下)。でも明らかではない、直接標識脂質膜を観察し、これらの問題も検出できます心蛍光信号から、パターンが通常、および、マキシマの蛍光は同種ではないが、「穴」が含まれています、または図 6Aの中央のパネルのように、明るい。
PDMS 組織の棒状だが自己組織化の手順は図 4のとおりです。いくつかのプロトコルの手順は、タンパク質や脂質を再利用できるよう、繰り返される必要はありません。ようなパターン化した基板上に基板を洗浄して (プラズマ クリーニング) で hydrophilized、PDMS にサポートされている脂質二重層を形成、自己組織化の試金が 200 μ L のボリュームに設定されています。適切な膜を形成して、だが膜の自己組織化をチェックするには、部屋が作成されます。適切な膜形成、だがフォームが通常個々 の微細構造間、PDMS の表面に表面波を旅されているし、また自己組織化微細構造の下部に波を自由にすることができます、全体の上に移動します。膜で覆われた表面 (図 5 a)。バッファー除去後コンパートメント間表面を表示しない伝搬だがパターン (図 5 b)、それは完全に乾燥する必要があります。だがパターンは、まだ動いていますより多くのバッファーを削除する必要があります。タンパク質は、膜に覆われた PDMS、自己組織化は、上部インターフェイス (図 5) の空気に、棒状 microcompartments 今閉じ込められました。これらの条件の下で 2 つの蛋白質は図 5に示すように、極から極へ振動を実行できます。私の心の一部は、膜結合型では常に、またバッファー除去中にバッファー除去後の濃度は濃度を入力に匹敵します。この効果によりバッファー除去前にパターンの位置に依存するいると、濃度がまた同じ coverslip の個々 の微細構造によって異なります。シリコンのウエハ生産やシリコンウエハーから PDMS 成形は、不完全な微細構造分析 (図 6 b) に使用できませんで起因できます。さらに、バッファーのため除去組織は、プロセス中に乾く可能性があり、それ故に、さらなる分析 (図 6 b) から除外します。結果として 1 つのチャンバーに微細構造のほんの一部は目的のポール - 振動を示しています。微細構造タンパク質の動態を分析するには、kymograph は、全体構造 (図 5 e) 選択範囲を描画することによって取得できます。MinCDE はポールのポールから振動、ミンツと心はコンパートメント (図 5 階) の真ん中にコンパートメント極で最大濃度と最小濃度の時間平均濃度勾配が表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> 図 1: SDS-PAGE によるタンパク質精製の最終製品を表示します。彼の心 (33.3 kDa)、彼の eGFP-心 (60.1 kDa)、彼の mRuby3-心 (59.9 kDa)、彼鉱山 (13.9 kDa)、彼ミンツ (28.3 kDa) が順に表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> 図 2: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと非パターン化脂質二重膜 (手順 1-6) の自己組織化のプロトコルのタイミング。破線のボックスは、クリーニングでこれら 2 つのオプションのいずれかが使用できることを示します。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> 図 3: だがアッセイの共焦点顕微鏡によるイメージングします。A)正規分のスパイラル、どの波伝搬速度や強度プロット速度からの測定を得ることができます。使用濃度: 0.6 μ M (30 %egfp の心) を気 1.8 μ M 彼の地雷 (30% 彼-鉱山-Alexa647) B) A の地域の例を正規化輝度プロット マークC)全体アッセイ商工会議所の概要 (スケール バー: 1 mm、タンパク質濃度に等しい上記)。スパイラルと同様ターゲット パターンを観察することができますどちらの方向を回します。拡大領域は、UV 接着剤に波のパターンの異なる方法を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> 図 4: プロセス フロー図の個々 の手順を示すと棒状の微細構造 (手順 1-5、7、8) における自己組織化のプロトコルのタイミング。灰色の箱手順を示す製品が再利用できるプロトコルから人工脂質膜の非パターン化に。円で印の付いた矢印を示すプロトコルを一時停止および後で再開できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> 図 5: 代表的な決算だがパターン PDMS microcompartments の棒状に形成します。A)だが進行表面波を形成する PDMS 表面の自己組織化 (1 μ M 心 (30 %egfp 心)、2 μ M 鉱山、2.5 mM ATP)。B) 、microcompartments 間の平面サーフェス上のタンパク質の自己組織化を停止バッファーは、微細構造の高さを下げたが後、。C) 1 つの棒状の microcompartment の回路図。D)バッファー除去後だがポール - 振動の代表的なイメージ。E) D に示すように強調表示された線に沿って振動の Kymograph)。F)画像と D に示すように時系列の平均蛍光強度の分布) microcompartment 極で極大値と極小区画の中央には、タンパク質のグラデーションを明確にします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> 図 6: 否定的な実験結果の例です。A)過剰洗浄膜小胞の付着につながる最適な小胞の準備と脂質組成穴を蓄積されます。中央の 2 つのパネルは、問題となる表示分振動を観察する方法の両方の組み合わせを示します。膜が 0.05% で標識された Atto655 ドープ。(バーをスケール: 50 μ m)B)上部パネル: 乾燥してあまりにも多くのバッファー除去またはバッファーが時間の経過とともに蒸発するとき、microcompartments が発生することが。底板: ウエファーの生産や PDMS 成形中に不完全なコンパートメントを形作ることができます。(バーをスケール: 30 μ m)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
1 の補足ファイル:彼の心のためのプラスミド マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
2 の補足ファイル:彼の EGFP 心のプラスミド マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
3 の補足ファイル:彼の mRuby3 心のプラスミド マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
4 の補足ファイル:その鉱山のプラスミド マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
5 の補足ファイル:彼ミンツのプラスミド マップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
6 の補足ファイル:Microcompartments のロッド型のシリコン基板の CAD ファイルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

我々 は開いた区域の脂質の心と私の自己組織化アッセイの in vitroのプロトコルを提供します。さらに、我々 は反応閉じ込めによる生体内での条件を模倣する脂質被覆 PDMS microcompartments のアッセイを囲む方法をについて説明します。

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

この方法は、細胞の組織化と膜に関する重要な質問、たとえば、幾何学的な手がかりがプロセスでどのような役割を果たすかに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、タンパク質濃度など、パターン形成に影響を与えるすべての側面を正確に制御できることです。まず、テキストプロトコルで説明されているように、マルチラメラ小胞を生成します。次に、最初にホットプレート上に摂氏70〜99度の水を入れたビーカーを準備し、液体窒素を保持する容器を準備して、脂質を7〜10サイクル凍結解凍します。バイアルを大きなピンセットで液体窒素に保持し、窒素の沸騰が止まるまで待ちます。次に、溶液が完全に解凍されるまでバイアルをお湯に移します。混合物によっては、脂質混合物が目にはっきり見えるまで、これらの手順を繰り返します。次に、脂質エクストルーダーを組み立て、システムをMin bufferで予備すすぎます。脂質混合物を50ナノメートルの細孔サイズの膜を通して35〜41回押し出します。メンブレンを横切らなかった凝集体を避けるために、奇数のパスで終了するようにしてください。ガラスカバースリップを逆さまのガラスシャーレまたはその他の不活性な表面に分散させます。ガラスピペットを使用して、各カバースリップの中央に7滴の濃硫酸を追加します。次に、酸滴の中央に50%過酸化水素を2滴加えます。反応を覆い、少なくとも45分間インキュベートします。次に、ピンセットを使用してカバーガラスを個別に持ち上げ、超純水で酸を洗い流します。洗浄したカバースリップを焦げ付き防止ホルダーまたは同様の輸送装置に入れます。次に、各カバーガラスを超純水で広範囲にすすぎ、加圧ガスで表面を乾燥させます。カバースリップのきれいな面に油性マーカーで印を付けます。チャンバーを組み立てるには、まず0.5ミリリットルの反応チューブの蓋と円錐形の部分を切り取り、鋭利なハサミで廃棄します。次に、チューブの上縁にUV接着剤を塗布し、ピペットチップを使用して接着剤を均等に分散させます。チューブを逆さまにしてカバースリップのきれいな面に接着します。最後に、360ナノメートルのランプまたはLEDの下に複数のチャンバーを5〜15分間配置して、UV接着剤を硬化させます。担持脂質二重層形成のためには、ヒートブロックを摂氏37度に予熱し、2ミリリットルの反応チューブをMinまたはSLBバッファーと1チャンバーにつき1本のチューブでインキュベートします。組み立てられ硬化したチャンバーに窒素を吹き込み、UV硬化および組み立て中に沈殿した可能性のあるほこりやその他の粒子を取り除きます。次に、チャンバーをヒートブロックに置きます。20マイクロリットルの透明脂質アリコートを130マイクロリットルのMin緩衝液で希釈し、0.53ミリグラム/ミリリットルの作業濃度を構築します。各チャンバーに75マイクロリットルの脂質混合物を追加します。次に、タイマーを 3 分に設定します。インキュベーション時間中、小胞は親水性ガラス表面で破裂し、融合してコヒーレントSLBを形成します。60秒が経過したら、各チャンバーに150マイクロリットルのMinバッファーを追加します。残りの120秒後、200マイクロリットルのMinまたはSLBバッファーを追加して各チャンバーを洗浄し、数回慎重にピペッティングして、さらに200マイクロリットルを取り外して追加します。各チャンバーを1回洗浄したら、2ミリリットルのバッファーが使い果たされるまで、最初のチャンバーを完全に洗浄します。担持脂質二重膜の洗浄には、チャンバー内の動きの範囲を完璧にし、正しい洗浄強度を見つけるために、ある程度の経験が必要です。パターン化されたシリコンウェーハからPDMS微細構造を作製するには、まずプラスチックカップを使用して10グラムのPDMSベースと1グラムのPDMS架橋剤を計量します。混合装置を使用して、PDMS混合物を混合および脱気します。次に、ピペットチップを使用して、少量のPDMSをシリコンウェーハ上の構造に直接滴下します。すぐに1カバースリップをPDMSドロップに置き、清潔なピペットチップの上端を取り、カバースリップをシリコンウェーハにそっと押し付けます。PDMSは、カバースリップとシリコンウェーハの間に薄く広がっている必要があります。カバーガラスを貼ったウェーハをオーブンに入れ、PDMSを摂氏75度で3〜4時間、または一晩硬化させます。次に、ウェーハをオーブンから取り出し、室温まで冷まします。カミソリの刃で、付属のPDMSの入ったカバースリップをシリコンウェーハから慎重に取り外します。次に、ガラスについて前述したように、プラスチックチャンバーをPDMSに取り付けます。チャンバーが取り付けられたカバースリップを取り、プロセスガスとして酸素を入れたプラズマクリーナーに入れます。カバースリップをプラズマで清掃します。この作業では、30%の電力と0.3ミリバールの酸素圧を1分間使用しました。次に、ガラスで前に説明したように、チャンバー内でSLBを準備します。自己組織化アッセイを行うには、チャンバー内のバッファー容量を200マイクロリットルのMinバッファーからタンパク質とATP溶液の量を差し引いた値に調整します。次に、MinD、MinE、および必要に応じてMinCとラベル付けしたMinDを添加し、ピペッティングで成分を穏やかに混合します。次に、2.5ミリモルATPを追加して、MinDEの自己組織化を開始します。次の10〜30分間で、蛍光顕微鏡で定期的なMinDEパターンの形成と適切に形成された微細構造を確認します。規則的なMinDEパターンが形成されたら、2回ピペットでゆっくりと上下させて成分を混合します。100マイクロリットルのピペットを使用して大量のバッファーを取り出し、残りの部分を10マイクロリットルのピペットで慎重に取り出します。イメージング時間を長くするには、湿らせたスポンジをチャンバー内に差し込みます。スポンジがカバースリップの表面に接触しないようにしてください。微細構造中の残留バッファーが乾燥しないように、すぐにチャンバーを蓋で閉じてください。微細構造をイメージングする前に、マイクロキャビティ内のタンパク質が振動している間、PDMS微細構造上でMinDEの自己組織化が停止していることを確認してください。この代表的なビデオでは、デュアルカラーイメージングにより、MinDとMinEが自己組織化して、支持脂質二重膜上のらせん状パターンに適合する進行表面波になる様子を示しています。ここでは、シングルカラーイメージングにより、MinDとMinEがPDMS微細構造で極間振動を行っていることが示されています。振動は、コンパートメントの極で最大の濃度とコンパートメントの中央で最小の濃度を持つ、時間平均化されたMinD濃度勾配を確立します。この手順に続いて、膜結合速度と滞留時間を決定するために、単一粒子追跡などの他の方法を実行できます。ピラニア溶液での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に個人用保護具などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

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Biochemistry

生物化学

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