Name: 骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ造血幹細胞移植を用いた骨髄異形成症候群の病態解明法。遺伝子操作された造血細胞の悪性化を評価し、がん幹細胞の機能解析と疾患起始細胞の同定に貢献する。

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この作品は、国立がん研究所の学内研究プログラムによって支えられた (許可番号 ZIA SC 010378 と BC 010983) 健康の国民の協会。

この資料に記載されている動物の手続きベセスダ動物ケアおよび使用委員会で国立がん研究所によって承認され、思いやりのあるケアと実験動物の使用の公衆衛生サービス ポリシーに含まれるポリシーに準拠、動物福祉法とケアと実験動物の使用のためのガイド。
1. セル準備
<ol><li>収穫骨髄有核細胞 (BMNC)<ol>
<li>滅菌材料のみを使用します。スチーム オートクレーブを使用して再利用可能な器具を滅菌します。単回使用の滅菌容器にプラスチック容器、注射器、針を購入します。クラス II、タイプ A2 生物学的安全キャビネットのすべての動物とセルの操作を実行します。</li>
		<li>HF2 の 3 mL を含む下部チューブ ラウンド 14 mL で BMNCs を準備 (ハンクのバランス 2% 牛胎児血清を添加した食塩)。</li>
		<li>C57Bl6 ドナー マウス (陽性 CD45 遺伝子 CD45.2)、年齢 2-6 ヶ月通常 CO2チャンバーを用いたを安楽死させます。</li>
		<li>マウス死体を滅菌するには、スプレー ボトルで体全体を 70% エタノールを噴霧します。足首まで骨盤から足から皮膚の皮をむきます。</li>
		<li>滅菌はさみ (ストレート、シャープ ユニット/シャープ、11.5 cm) および鉗子 (グレーフェ、鋸歯状にされた、0.8 mm の先端幅) を使用して枝肉から大腿骨および脛骨を削除します。接続されている筋肉を明らかにトリミングします。</li>
		<li>脛骨の近位および遠位端をハサミでカットします。脛骨を鉗子で保持、脛骨 (足首) の遠位端脛骨骨髄腔に HF2 の 2.5 mL を含む 27 ゲージ 3 mL シリンジを挿入します。底部チューブ ラウンド 14 mL に穏やかな圧力を使用して脛骨から骨髄細胞をフラッシュします。<ol>
<li>他の脛骨に繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>大腿骨の近位および遠位端をハサミでカットします。3 mL シリンジ大腿骨骨髄腔の遠位端に HF2 の 2.5 mL を含むと、注射器に穏やかな圧力を適用するフラッシュ 20 g 針を挿入することによって大腿骨髄腔に取り付けられました。<ol>
<li>両方の脛骨からすべての骨髄を収集、他の大腿骨に繰り返し、同じ 14 mL で大腿骨の丸い底部チューブ。</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 mL の注射器に接続されている同じ 20 g 針、上下に数回を吸引によって骨髄の質量を分散させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BMNC の抗体の汚損<ol>
<li>カウント BMNC。1.1.8 の手順で生成された BMNC 懸濁液の 20 μ L に 3% 酢酸溶液 20 μ L を追加します。その後、診断および倒立顕微鏡を使用してカウントします。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 450 x g で穏やかなの遠心分離によって、BMNC をペレットします。10 の7セルごと 90 μ L を使用する HF2 とペレットを再懸濁します、細胞懸濁液にビオチン化抗リネージュ抗体カクテルの 10 μ L を追加します。</li>
		<li>4 ° C で 20 分間のインキュベート後 3 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のステンド グラスの細胞を洗います。</li>
		<li>HF2 の 10 の7セルごとの 100 μ L で BMNC を再懸濁します。2 μ L アロフィコシアニン (APC) の共役反ビオチン抗体を 20 分のための 4 ° C で培養後、細胞懸濁液を追加します。</li>
		<li>3 ml の PBS のステンド グラスの BMNC をすすいで流れ cytometry 細胞選別の propidium ヨウ化 (PI) の 0.2 μ G/ml を添加した HF2 と BMNC を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BMNC のフローサイトメトリー細胞選別フローします。<ol>
<li>流れ cytometry セルソーターを調整します。光電子増倍管 (光電子増倍管)、散布図、無染色の細胞を用いた蛍光パラメーターを最適化し、各検出器の線形の範囲内で設定します。</li>
		<li>無染色、PI 染色を準備し、APC 標識リネージュ ステップ 1.2 から並列でカクテルの細胞。スペクトル補償を分析します。</li>
		<li>FSC H対SSC H、H--SSC 640 640 SSC A対と対640 SSC S 640-SSC-W. のシーケンシャル ゲートでダブレット細胞を判別します。</li>
		<li>561 nm で 614/20 帯域通過フィルターで収集された排出興奮して PI を使用して淘汰のセルを除外します。リネージュ APC 671/30 帯域通過フィルター付け 640 nm と収集の発光で細胞を刺激します。</li>
		<li>電圧の高さと蛍光値を記録し、ソートする人口を視覚化するリスト モード データ ファイルに少なくとも 100,000 のイベントを収集します。</li>
		<li>次の 10,000 のセルの 3 つのサンプルを取得した後のスペクトルの補正を計算する: 細胞、細胞、PI と APC 標識細胞と共役反リネージュ抗体カクテルをラベルなし。</li>
		<li>10 %fbs メディアの 0.5 mL を含む 5 mL チューブに明るい蛍光 (LP2) リネージュ負 (LN) dim 蛍光強度 (LP1) と LP 人口リネージュ正 (LP) を並べ替えるには 3 つの領域を設定します。</li>
		<li>1 つのドロップを使用して並べ替えセルを包むし、飛行中止モードを浄化します。</li>
		<li>並べ替えられた細胞の純度を確認する各並べ替えられたサンプルにセルの総数が 1,000 記事並べ替え解析を実行します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 450 × g で遠心分離によって細胞を収集し、HF2 の 0.5 ml 細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>並べ替えられたセル番号で検定、トリパン ブルーを確認します。HF2 の移植細胞数を調整します。 注: BMNC の人口の広いスペクトルは移植手順上記 1.2.2 で蛍光色素標識された抗体の組み合わせを追加を使用して分離できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 受信者マウス作製と造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植)
<ol><li>移植の準備<ol>
<li>獣医と飼育コンジェニック受信者マウス (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) 特定病原体無料 (SPF) の動物実験施設でケアを維持します。</li>
		<li>胃腸トラックの除染を予防、致命的な線量 (9 Gy) 照射前 7 日間、受信者にシプロフロキサシン 100 mg/L を含む滅菌水を供給、照射 14 日間保持します。</li>
		<li>とおり致命的な線量 (9 Gy) 照射 Cs のソースからを提供します。訓練を受けた、認定 Cs 演算子を使用します。70 cgy-ルンビア/分全身の γ 線照射を提供する Cs 信号発生器を設定します。特注のホルダーに 10 匹のマウスを置き、照射室にホルダーを挿入します。13 分 9 Gy 全身照射を提供し、マウスをケージに戻ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>造血幹細胞移植<ol>
<li>上記に記載されている 1.3 として流れ cytometry 並べ替えと野生型 (WT) マウス 2 を 5 × 10 とあたり 2 × 105セルのセル用量で受信者マウス (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) コンジェニックから BMNC BMNC 準備精製テストの4セルをミックスします。同じ注射器で細胞をミックスします。 注: WT BMNC 受信者のマウスに放射線を温存効果を提供でき、受信者のマウスの生存のためテスト細胞が造血をサポートしていない場合。WT BMNC 使用このタイプの実験のエクスプレス CD45.1 アレルされ、こうして識別 CD45.1 および CD45.2 を区別する抗体を用いて細胞から。WT BM 細胞は、「ヘルパー セル」、「放射線スペア電池」または「競合細胞」と呼ばれます。</li>
		<li>200 μ L 注入を促進するため滅菌 HF2 を使用して受信者ごとにセルの混合物のボリュームを調整します。</li>
		<li>1 mL 注射器と照射の 24 時間以内、28 ゲージ針を使用して静脈内尾静脈注射を介して致死的に放射線照射した受信者マウスに細胞の混合物を移植します。熱は尾静脈拡張につながるとは、熱ランプの下でねずみのしっぽを配置します。 注: 研究の終わりにすべての受信者のマウスを安楽死させるし、死体解剖、組織学、およびフローサイトメトリーによって病気の進行を評価します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 フローサイトメトリーを用いた生着アッセイ
<ol><li>ドナー細胞の生着を評価するには、受信者のマウスから移植後 16 週、12 週目、6 週で末梢血 (PB) を収集します。</li>
	<li>約 1 分の熱ランプ暖かいケージ内の受信者と、落にマウスを置きます。</li>
	<li>メス (刃 10、#3 メス ハンドル) の尾静脈をカットし、抗凝固剤として EDTA を含むマイクロキャピ ラリー チューブを使用して受信者ごとの PB の 100 μ L を収集します。</li>
	<li>50 μ L 滅菌遠心チューブ内に配置することによって、収集した PB を 2 つの等しい因数に分割します。自動完全な血球数 (CBC) の 1 つの因数 (NCI 病理コアで実行されます) を使用して抗体の汚損のため 2 番目の因数を使用し、フローサイトメトリーします。</li>
	<li>フローサイトメトリーによるドナーの生着を検出、収集した PB の 50 μ L に 1 mL の低張性赤血球換散バッファー (NH4Cl、KHCO3ナ2EDTA、pH 7.2 0.037 g/L の 1 g/L の 8.29 g/L) を追加することによって赤血球 (RBC) を溶解させます。渦混合し、室温で 10 分間インキュベートするサンプル。</li>
	<li>1.5 分は慎重に、上清を吸引し、廃棄のための 4,600 x g で分離の PB を遠心分離機します。</li>
	<li>部分的に軽くタップするか、「弾く」管の底で細胞ペレットを混乱させます。1.3 mL の PBS、ペレットにチューブと 4,600 x g で 1.5 分間遠心に位置して慎重に吸引と破棄上清を追加します。</li>
	<li>タップまたはフリック、細胞ペレットを混乱させるし、細胞ペレットに 5% ラット血清を添加した HF2 を 200 μ l 添加します。</li>
	<li>細胞懸濁液にアロフィコシアニン (APC) と共役アンチ CD45.2 抗体 (1 μ L) を追加します。少なくとも 30 分と簡単に渦混合物のための 4 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>汚損の後、上記の 2 倍の細胞を洗浄し、PI の 1 μ G/ml を添加した HF2 の 400 μ L で再懸濁します。</li>
	<li>4 色流れの cytometer を使用して生着を検出します。B または T のリンパ球などの特定の細胞型を検出する抗体を追加を追加することによって末梢血内のセル型の追加情報を取得します。</li>
	<li>拡散シートを使用してさらにデータの分析を可能にするためシリアル生着データを記録します。</li>
</ol>

<ol><li>Corey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+the+complexity+of+stem-cell+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).</li>
<li>Garcia-Manero, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+syndromes%3A+2015+Update+on+diagnosis%2C+risk-stratification+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management.</a> American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).</li>
<li>Heaney, M. L., Golde, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10341278">Myelodysplasia.</a> The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18467609">Myelodysplastic syndromes.</a> Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).</li>
<li>Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+features+of+myelodysplastic+syndromes%3A+results+from+regional+cancer+surveys+and+hospital-based+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics.</a> International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).</li>
<li>Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+genetic+pathways+and+cooperating+genetic+abnormalities+in+the+pathogenesis+of+therapy-related+myelodysplasia+and+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia.</a> Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).</li>
<li>Uy, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+clonal+structure+of+MDS+and+AML+in+response+to+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy.</a> Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).</li>
<li>Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98+gene+fusions+and+hematopoietic+malignancies%3A+common+themes+and+new+biologic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights.</a> Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).</li>
<li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXD13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant%2C+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li>
<li>Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. <a target="_blank" href="https://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/286455">Preleukemic acute human leukemia.</a> Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).</li>
<li>Thanopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+NOD%2FSCID-beta2+microglobulin+null+mice+with+multilineage+neoplastic+cells+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).</li>
<li>Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+distinct+clonal+MDS-derived+hematopoietic+precursors+in+NOD%2FSCID-beta2-microglobulin-deficient+mice+after+intramedullary+transplantation+of+hematopoietic+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells.</a> Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).</li>
<li>Benito, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID+mice+transplanted+with+marrow+from+patients+with+myelodysplastic+syndrome+%28MDS%29+show+long-term+propagation+of+normal+but+not+clonal+human+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors.</a> Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).</li>
<li>Medyouf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelodysplastic+cells+in+patients+reprogram+mesenchymal+stromal+cells+to+establish+a+transplantable+stem+cell+niche+disease+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).</li>
<li>Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+a+myelodysplastic+syndrome+by+a+long-term+repopulating+hematopoietic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+Distinct+Subsets+of+Lineage-Biased+Multipotent+Progenitors+Control+Blood+Production+in+Normal+and+Regenerative+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions.</a> Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloablative+hematopoietic+stem+cell+transplantation+improves+survival+but+is+not+curative+in+a+pre-clinical+model+of+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome.</a> PLoS One. 12 (9), e0185219(2017).</li>
</ol>

何を開示する必要があります。

MDS はクローン性造血幹細胞の障害であるが、MDS「幹」、または開始セルは特徴付けされていますいません。以前、MDS 骨髄による造血幹細胞移植、大球性貧血、白血球減少、好中球減少、異形成15の形態学上の証拠によって特徴付けられる NHD13 マウスを用いた WT マウスに移植できることを示した。さらに、競争力のある再試金は NHD13 MDS 骨髄由来細胞の成長の優位性を識別しました。一緒に取られて、これらの調査結果は、MDS 幹または開始セルの存在を意味します。追加実験が進行中の今、肺浸潤を目的とした特性データシート開始セル15より定義された幹・前駆細胞のマーカー (CD150、CD48、c キットと Sca 1) を使用して16系統と組み合わせるマーカー染色法はこのプロトコルで記述されています。
MDS を識別する広範な流れ cytometry 並べ替えプロシージャを含む NHD13 マウスを使用してセルを開始します。主 BMNCs ...

骨髄異形成症候群 (MDS) は、造血の効果が、異形成の形態学上の証拠と急性骨髄性白血病 (AML)1,2 への変換のための傾向によって特徴付けられるクローン血液疾患の多様なセットを表す ,3,4。無効造血骨髄で成熟逮捕と hypercellular 骨髄1,3にもかかわらず末梢血血球減少によっての結果として認識されます。MDS の発症率は、米国で毎年 10万人あたり 2-12 ケースとしていろいろと推定されている、MDS の発症率は年齢とともに増加この与えられた米国の人口3、老化を理解する重要な条件を作る 5。MDS のほとんどの場合に、明確な病因がない、MDS のいくつかのケースはがん化学療法6ベンゼンなどの溶剤を含む知られている遺伝毒性要因への曝露に起因すると考えられています。
MDS 患者は通常データシート セル7の変異を取得しています。比較的稀に、MDS 患者の数は、NUP98、EVI1、RUNX1、MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) などの遺伝子を含むバランスのとれた染色体転座を取得しています。私たちの研究室は8NUP98 遺伝子を含む染色体転座の長年の興味。トランスジェニック マウスを表す Vav1 プロモーターによって調整される NUP98 HOXD13 (NHD13) 遺伝子とエンハンサー要素は MDS、末梢血血球減少によって、異形成や急性骨髄性白血病9 への変換の形態学上の証拠などの主要な機能のすべてを表示.
MDS 60 年以上10で認識されているクローン幹細胞障害と見なされます、細胞免疫不全マウスで MDS を接がに取り組み成功していない主、データシート セル接が悪い11、ので 12,13,14マウス臨床病気を開発しません。どの造血細胞は MDS を送信ことができますを識別するために、私たちが NHD13 モデルになってし、末梢血血球減少によってを含む人間の MDS の基本的な機能のすべてを示した病気の実体として MDS を接が可能性が我々 を示した異形成とアジア ・ マイル リミテッド15に変換します。このレポートでは、MDS を開始するセルを識別するためにさらに造血幹・前駆細胞 (HSPC) を分別する方法と同様に、これらの実験の技術的な詳細を紹介します。

<table><tbody><tr><td>14 mL丸底チューブ</td><td>Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 antibody</td><td>Southern Biotech</td><td>1800-15</td><td>LOT# A077-T044O</td></tr><tr><td>3 mL Syringe</td><td>Monoject</td><td>8881513934</td><td></td></tr><tr><td>27-G needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>20-G needle</td><td>BD</td><td></td><td></td>305176</tr><tr><td>Lineage Cocktail</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-858</td><td>LOT# 5170418221</td></tr><tr><td>抗ビオチン抗体</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-288</td><td>LOT# 5171109046</td></tr><tr><td>1 mL Syringe</td><td>Excelint</td><td>26027</td><td>インスリン シリンジ</td></tr><tr><td>加熱ランプ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E70001901</td><td></td></tr><tr><td>FACSマシン</td><td>Cytec</td><td>FACScan</td><td>2レーザー、5色検出器</td></tr><tr><td>FACS選別装置</td><td>ベックマン・コールター</td><td>MOFLO ASTRIOS</td><td>5レーザー、23パラメータ、6ポピュレーション 同時に選別</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>ガンマ線照射器</td><td>ベストセラトロニクス</td><td>ガンマセル40</td><td></td></tr><tr><td>採血管</td><td>RAM 科学</td><td>76011</td><td></td></tr><tr><td>レシピエントマウス</td><td>Charles River</td><td>B6-LY5.1/Cr, CD45.1</td><td></td></tr><tr><td>NUP98-HOXD13 マウス</td><td>n/a</td><td>C57Bl/6, CD45.2</td><td>Colony maintained at NIH</td></tr><tr><td>5 mL round bottom tube</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr></tbody></table>

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

骨髄異形成症候群 (MDS) は、造血の効果が、末梢血血球減少によって、異形成、急性白血病への変換のための傾向によって定義される造血幹細胞障害の多様なグループです。NUP98 HOXD13 (NHD13) トランスジェニック マウス末梢血血球減少によって、異形成と急性白血病への変換の観点から人間の MDS を要約するでしょう。我々 は以前、MDS 骨髄核細胞 (BMNC) を移植による野生型の受信者に mds 遺伝子組み換えマウスから MDS が転送することを示した。起源の MDS のセルを明確に理解、特定を移植する方法を開発した、immunophenotypically に造血のサブセットが定義されています。この記事で私たちは移植造血幹・前駆細胞の特定の人口の分離とのプロセスを説明します。次の移植は、移植の効率とドナー MDS 細胞の持続性を評価する方法をについて説明します。

いくつかの実験結果の代表的な数値を示します。図 1は、代表的なフローサイトメトリー実験を並べ替えを示しています。正常な造血分化中細胞は特定の造血系統にコミットになる彼ら系列を定義するセル表面のマーカーを取得し、自己複製の可能性を失います。したがって、野生型マウスでは、幹細胞の自己複製はリネージュ負 BMNC に限定されます。この実験で我々 は、正と高血統陽性細胞はリネージュ リネージュ負、低に NHD13 骨髄から BMNC に分類されます。これらの並べ替え済み細胞が、自己再生能力を決定する WT に移植しました。
図 2は、否定的な細胞系列の別の実験からの結果を示しています。 または mds NHD13 ドナーから並べ替えられていない細胞が致死的照射 WT に移植しました。WT 競合細胞 (セクション 2.2.1 上記参照) CD4...

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々 な悪性造血細胞の評価に役立ちます。

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

この方法は、悪性腫瘍を開始する細胞の特性評価に関する悪性腫瘍分野のいくつかの質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、これらの癌幹細胞の機能解析の基礎を提供することです。この技術の意味は、疾患を起こす細胞の同定に役立つため、骨髄異形成症候群またはMDSの治療のどこにまで及ぶ。養子移送のためにレシピエントを準備するために、移植の1週間前に、特定の病原体のない動物施設で7日間、シプロフロキサシン1リットル当たり100ミリグラムを補充した無菌水を提供する。7日目には、訓練を受けた認定セシウム17オペレーターがセシウム源機器を1分間に70センチグレイの総体ガンマ照射を提供するように設定しました。カスタム設計のホルダーに10匹のマウスを入れる。ホルダーを照射器室に挿入し、13分間で9つのグレーの全体照射を行う。その後、彼らのケージに動物を返します。翌朝、2〜6匹の蛾の古いC57ブラック6マウス全体に70%のエタノールをスプレーし、はさみを使用して骨盤から足首に皮膚を取り除きます。はさみと一緒に鉗子を使用して、フェムラと脛骨を取り除く。骨から筋肉をきれいに整えます。脛門の近位と遠位の端をカットし、鉗子で1脛目を拾います。27本のギゲ針を装着した3ミリリットルの注射器を骨髄腔に挿入し、2%の牛胎児血清またはHF2を補ったハンクス緩衝生理食塩水2.5ミリリットルを含む14ミリリットルの丸底管に骨髄を洗い流します。すべての骨髄が採取されたら、20ゲージ針先端を通して組織を数回吸引し、骨髄塊をカウント用の単一の懸濁液に分散させる。骨髄有核細胞、またはBMNCにフローソーティングのために標識するには、遠心分離によって細胞を収集し、HF2濃度の90マイクロリットル当たり10〜7BMNCでペレットを再懸濁する。次に、ビオチン化された抗系統抗体カクテルの10マイクロリットルをセルサスペンションに加え、摂氏4度で20分間インキュベーションします。その後、3ミリリットルのPBSで遠心分離機洗浄を行う。ペレットを10倍の10倍の7細胞に100マイクロリットルのHF2で再懸濁する。2マイクロリットルのAPCコンジュゲート型抗ビオチン抗体で細胞を二次標識する。光から保護された摂氏4度で20ミヌエット後、新鮮なPBSの3ミリリットルで細胞を洗浄する。氷上のヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり0.2マイクログラムを添加したHF2のペレットを再懸濁します。未染色細胞を使用してフローサイトメトリー細胞選別機をキャリブレーションし、各検出器の線形範囲内ですべての光増倍管、散乱、蛍光パラメータを最適化します。非標識、PI標識および抗系系APC標識細胞に対して10,000個の細胞の3つのサンプルを取得する。並べ替えの最後に、各サンプルから1,000個の細胞を分析し、ソートされた細胞の純度と生存率を確認します。遠心分離機のサンプルをスピンダウンします。その後、カウント用のHF2の0.5ミリリットルでペレットを再中断します。選別された細胞の養子移動のために、滅菌HF2のコンジェニックレシピエント動物から5番目の野生型BMNCに2倍の100マイクロリットルを混合する。2〜5倍の10〜4番目の100マイクロリットルの100マイクロリットルで、レシピエント動物1匹あたりのマイクロ遠心分離管中の無菌HF2に関心のある選別ドナーBMNC。1ミリリットルのシリンジを1つロードし、200マイクロリットルの細胞を持つレシピエントあたり28ゲージを装備する。次いで、受信側マウスをヒートランプの下に置き、尾静脈拡張を誘導する。尾静脈を介して各致死的に照射されたレシピエント動物に細胞混合物を送達する。幹細胞の自己再生は、陰性の野生型BMNCに限定されるため、系統陰性、低系統陽性、および高系統陽性細胞を選別し、野生型レシピエントに移植し、各細胞集団の自己再生能力を決定する。MDSモデル動物から移植された移植性ドナートランス遺伝子BMNCは、それらのCD45.2細胞表面マーカー発現によってex vivoを区別することができる。トランスジェニックMDSドナー動物からの血統陰性BNMC、または未分類のBMNCの移植後16週間後までに、トランスジェニック細胞は、CD45.2陽性ドナー細胞の増加割合によって証明されるように野生型細胞を競い合い、致死的に照射されたレシピエント動物の末梢血において観察した。ここでトランスジェニックMDS細胞を移植したマウスから白血病の形質転換から細胞が示されている。多数の爆風と未熟な形の存在に注意してください。手順を試みる間、それは細胞に過度のストレスを与え、細胞死または機能的損失をもたらす可能性があるため、ex vivo操作の時間を制限することを覚えておくことが重要です。開発後、この技術は、遺伝子組み換えマウスの病気の原因を探求するために悪性腫瘍を入れるためのフィールドプログラムの研究者のための道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。...

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。...

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

最小限、または測定可能な残存病変 (MRD) の検出は、リスク アセスメントを精製急性骨髄性白血病 (AML) の再発を予測するための重要な予後バイオ マーカーです。これらの包括的なガイドラインと、MRD の一貫性と正確な同定と検出のためのベスト...

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC...

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

MDS の診断は非有益な細胞遺伝学または形態学的条件の不在で難しいです。MFC では、MDS の診断プロセスを改良を助けることができます。臨床練習のために便利になる、MFC...

データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

大腿骨内注射は、少数の造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を骨髄腔に直接配置することにより、生着を可能にします。ここでは、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射の実験プロトコルについて説明します。...

免疫不全マウスへのヒト造血幹細胞および前駆細胞の大腿内注射 

学ぶ造血幹細胞移植を用いた骨髄異形成症候群の病態解明法。遺伝子操作された造血細胞の悪性化を評価し、がん幹細胞の機能解析と疾患起始細胞の同定に貢献する。

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

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