Name: Luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々 な立体構造の形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶAu(III)イオンとBSAの結合による赤色蛍光発生メカニズム。pH依存性立体構造変化と複数結合部位の同定、タンパク質-金属相互作用研究に応用可能。

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東南は、シャーロットからデューク特別なイニシアチブ基金、ウェルズ ファーゴ基金 PhRMA 財団、スタートアップ資金、ノースカロライナの大学からの支援を認めています。

1. BSA-Au(III) 複合体の合成
<ol><li>高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレード水 5 mL 反応瓶で 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。 注: ソリューションが明確に表示されます。</li>
	<li>金 (III) 塩化物三水和物 (塩化金酸) を 5 mM HPLC グレードの水の濃度に溶解します。 注: ソリューションは黄色で表示されます。この濃度で塩化金酸溶液は Au 比 1:13、BSA になります。<ol>
<li>また、どこの濃度と塩化金酸の溶液を調製 0.38 ミリメートルの間 (BSA:Au = 1:1) 20 mm (BSA:Au = 1:50) hplc グレードの水。 注: 異なるギア比の BSA のゴールドは励起発光マップの大幅に異なる赤蛍光パターンになります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C の水浴の BSA の反応バイアルを置き、精力的に磁性攪拌器を使用して 750 rpm で攪拌します。</li>
	<li>攪拌を開始した後すぐに 1 mL の塩化金酸をソリューションに追加します。ソリューションの色は、黄色にクリアから変換する必要があります。</li>
	<li>磁性攪拌器を使用して 750 rpm、37 ° C で 2 分の混合物をかき混ぜなさい。</li>
	<li>反応バイアルに 1 M NaOH の 100 μ L を 12 の pH をもたらすにソリューションに追加します。 注: 水酸化ナトリウムを追加すると、直後にソリューションする必要があります黄色茶色に少し暗くなるし、黄色に再度オンします。</li>
	<li>2 h 750 rpm、37 ° C で攪拌し続けるソリューションは黄色から濃い黄色/茶色色にゆっくりと変更ください。この色の変化は、複雑な赤の蛍光 BSA-Au(III) の形成を示します。</li>
	<li>2 日間室温で放置し、サンプルを許可するソリューションは引き続き黄色茶色に暗くし、蛍光強度が増加します。<ol>
<li>また、ソリューションの色が黄色茶色に進化するにつれてより多くの h を 12 の 37 ° C で攪拌し続けるサンプルをしましょう。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. BSA-Cu(II)-Au(III) の合成
<ol><li>HPLC グレードの水 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。ソリューションが明確に表示されます。</li>
	<li>5 mM の濃度に HPLC グレードの水で銅の (II) 塩化物水和物を溶解します。ソリューションは、光を表示する必要があります青。</li>
	<li>5 mL の反応バイアルに BSA 溶液の 1 mL を追加し、37 ° C の水浴の配置750 rpm で混合物をかき混ぜます。</li>
	<li>すぐに反応バイアルに銅の (II) 塩化物水和物溶液 0.5 mL を加え、2 分混ぜます。ソリューションは引き続きライト ブルー。</li>
	<li>12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます 1 M NaOH の 75 μ L を追加します。ソリューションは、紫色になります。</li>
	<li>5 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。</li>
	<li>反応バイアルに水溶液中の塩化金酸 0.5 mL を追加し、1 M NaOH を使用して 12 に pH を調整します。</li>
	<li>2 h の反応混合物をかき混ぜなさい。 注: ソリューションは、茶色の色に進化すべき。</li>
</ol>3. BSA-Ni(II)-Au(III) の合成
<ol><li>HPLC グレードの水 1 mL に BSA の 25 mg を溶解します。ソリューションが明確に表示されます。</li>
	<li>5 mM の濃度に HPLC グレードの水のニッケル (II) 塩化物水和物を溶解します。ソリューションは、光を表示する必要がありますグリーン。</li>
	<li>5 mL 反応バイアルに BSA 溶液の 1 mL を追加し、水浴に 37 oC. 炒め 750 rpm で混合物を置きます。</li>
	<li>すぐに反応バイアルおよび 2 分のミックスにニッケル (II) 塩化物水和物溶液 0.5 mL を追加します。 注: ソリューションのままライト グリーン。</li>
	<li>12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます 1 M NaOH の 75 μ L を追加します。 注: ソリューションは、濃い黄色になります。</li>
	<li>5 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。</li>
	<li>反応バイアルに水溶液中の塩化金酸 0.5 mL を追加し、12 に pH を調整します。</li>
	<li>2 h の反応混合物をかき混ぜなさい。 注: ソリューションは、茶色の色に進化すべき。</li>
</ol>4. [Cys34-capped-BSA]-Au(III) の合成
<ol><li>N-エチルマレイミド (NEM) 2 mg をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) 1 mL に溶かしてください。</li>
	<li>PBS NEM 溶液 1 mL に BSA の 2 mg を溶解します。</li>
	<li>5 mL の反応バイアルに溶液を移し、1 時間 500 rpm で 20 ° C でかき混ぜます。</li>
	<li>500 mL の PBS、未反応 NEM を削除する一晩マグネチックスターラーで攪拌 50 回転で 12 kDa の透析チューブを使用して、ソリューションを dialyze します。</li>
	<li>0.4 mM の濃度に PBS で塩化金酸を溶解します。 注: ソリューションは、淡い黄色になります。</li>
	<li>反応バイアルを 37 ° C の水浴に転送します。750 rpm で攪拌します。</li>
	<li>すぐに反応バイアルに塩化金酸溶液の 1 mL を追加し、2 分のミックスすることができます。</li>
	<li>12 の pH をもたらすし、2 h のミックスすることができます反応バイアルに 1 M 水酸化ナトリウムの 75 μ L を追加します。</li>
</ol>5. [all-thiol-capped-BSA]-Au(III) の合成
<ol><li>2 M 尿素と 50 mM 重炭酸アンモニウム (NH4HCO3、pH 8.0) HPLC グレードの水のソリューションを準備します。</li>
	<li>上記のソリューションと 5 mL の反応バイアルへの転送の 1 mL に BSA の 3.3 mg を溶解します。</li>
	<li>0.25 M の原液を作る tris(2-carboxyethyl) HPLC 水 1 mL で TCEP 62.5 mg を溶解してホスフィン (TCEP)。</li>
	<li>TCEP の最終濃度が 8 mM になるまで反応バイアルに TCEP の原液を追加します。</li>
	<li>50 ° C で 1 時間湯せんでソリューションを孵化させなさい磁性攪拌器を使用して 500 rpm で攪拌します。</li>
	<li>完全に部屋の温度に冷却ソリューションを許可します。</li>
	<li>HPLC グレードの水の 1 mL の NEM の 12.5 mg を溶解することにより 100 mM NEM の原液を準備します。</li>
	<li>NEM の最終濃度が 16 mM まで反応バイアルに NEM の原液を追加します。</li>
	<li>20 ° C で 2 時間を結合するソリューションを許可します。500 rpm で攪拌します。</li>
	<li>過剰な TCEP、満場一致、尿素を削除する 50 mM NH4HCO3の 500 mL で一晩マグネチックスターラーで 50 rpm で液を攪拌 12 kDa の透析の管を使用して、ソリューションを dialyze します。</li>
	<li>反応バイアルを 37 ° C で水のお風呂に移動し、750 rpm で攪拌します。</li>
	<li>0.66 mM の濃度に HPLC グレードの水で塩化金酸を溶解します。</li>
	<li>すぐに反応バイアルに塩化金酸溶液の 1 mL を追加し、2 分のミックスすることができます。</li>
	<li>解決の pH は 12 まで 1 M NaOH を追加し、2 h ミックスし続けるソリューションします。</li>
</ol>

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</ol>

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PH 12 で作製した BSA-Au(III) 化合物展示発光波長λemで赤い蛍光性 = 640 nm の紫外線 (UV) 光 λexで興奮すると = 365 nm (図 1 a)。赤い蛍光性の出現は遅いプロセスであり、最大の強度を高めるため室温で数日をかかります。赤の蛍光を高速生成する高温を利用できますが、37 ° C で反応を実行する最適な結果なります。2345 ° C 以上の温度で蛋白質の不可逆的な劣化が起こります。調整 pH の BSA は、その高齢者 (pH > 10) に変換、立体配座21 (「A フォーム」) は赤い蛍光性のための重要なpH は中性から出現する赤い蛍光性 (図 1 bC) のしきい値を決定する基本的な細かく調整されます。最大の赤色蛍光強度、pH は 11 の上調整してください。赤い蛍光性が基本 (pH...

Uv (紫外線) を出展 BSA Au 化合物-顕著なと興奮の赤蛍光ストークス シフト、もともと謝らによって合成されています。1一意かつ安定した赤い蛍光センシング2,3,4の5,6、7、やナノメディシン8 のイメージングなどの分野でさまざまなアプリケーションを検索できます。 ,9,10、11,12,13。この化合物は、近年14,,1516ナノサイエンスの分野で多くの研究者によって広く研究されています。BSA Au 化合物は、Au25ナノクラ スターとして解釈されています。本手法の目標して詳細にこの化合物を調べ、赤い蛍光性の起源を理解することです。提示されたアプローチで、複数の Au 結合部位の存在と蛍光、Au25ナノクラ スターの単一サイトの核に代わるものの起源を示すことができます。その他タンパク質17,18,19金 (iii) との複合体の本質的な蛍光特性を変更する方法を勉強する、同じアプローチを使用できます。
赤蛍光 BSA Au 化合物の合成には、Au (BSA:Au) の蛍光強度と励起発光マップ (EEM)20のピークの場所を最大限に BSA のモル比の狭いコントロールが必要です。それ示すことができる、バインドする錯の複数の結合部位が存在するアスパラギン フラグメント (または Asp フラグメント、BSA の N 末端の最初の 4 つのアミノ酸残基) を含む21,22。金 (iii) を調整して赤 fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20の機構に関与する、BSA (システイン-34) の 34番目のアミノ酸も表示されます。すべてのシステイン Cys ジスルフィド結合を切断、すべてチオール、赤い蛍光をキャッピングは作り出された ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III))。これは赤色の蛍光を生成する錯結合部位としてシステイン Cys 二硫化物結束の必要性を示します。
タンパク質化学の技術は、ナノ科学コミュニティの BSA-Au(III) 錯体の研究に広く使用していないされています。ただし、これらの複合体、同様 BSA 錯結合部位の詳細な理解を得るための特定の側面を理解するこれらの技術を採用する価値のあること。この資料は、これらの技術のいくつかを示すものです。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)、96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>塩化金(III)三水和物、99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>銅(II)塩化二水和物、99.999%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459097</td><td></td></tr><tr><td>ニッケル(II)塩化六水和物、99.9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>654507</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド(NEM)、>99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩 (TCEP)、>98.0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、>98.0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>尿素、99.5%</td><td>Chem-Implex Int'l</td><td>30142</td><td></td></tr><tr><td>ホスケート緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>重曹アンモニウム、99.5%</td> <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>9830</td><td></td></tr></tbody></table>

luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々 な立体構造の形成

Luminophore Formation in Various Conformations of Bovine Serum Albumin by Binding of Gold(III)

示されたプロトコルの目的は BSA、構造変更によって誘発される赤い蛍光を降伏への金 (iii) バインドのプロセスを研究する (λem = 640 nm) BSA-Au(III) 複合体の。メソッドは、赤い蛍光性の出現は、BSA のコンホメーションの pH による平衡遷移と相関していることを表示するために pH を調整します。赤蛍光 BSA-Au(III) 複合体は、BSA の「A フォーム」の構造に対応する pH 9.7、以上の調整でのみ形成できます。Au のモル比に BSA を調整して錯結合のプロセスの経過を監視するためのプロトコルを説明するとします。BSA、赤色の蛍光を出すあたり金 (iii) の最小数は、7 時より小さいです。BSA に複数の金 (iii) 結合部位の存在を説明するための手順でプロトコルについて述べる。まず、銅を追加することによって (Cu(II)) またはニッケル (Ni(II)) 陽イオン錯に続いて、この方法については明らかに結合部位錯赤の蛍光体ではないです。第二に、チオール保護剤によって BSA を変更して、別の nonfluorophore 形成錯結合部位が明らかにされます。第三に、BSA の構造を変更するには、切断とキャッピングの二硫化物結束の可能な錯結合サイトを示します。BSA のコンホメーションと錯バインディングを制御する、説明されたプロトコルは、他のタンパク質と金属イオンとの相互作用を研究に一般に適用できます。

BSA-Au(III) 複合体の蛍光からそれが観測されています BSA の本質的な青色蛍光の変換 (λem = 400 nm) 赤い蛍光 (λem = 640 nm) pH 9.7 平衡については、遷移 (図 1)。BSA-Au(III) EEM Au モル比異なる BSA では図 2に示すように、このデータは、どのように異なる励起波長で同じ発光波長が得られますモル比を変更することを示しています。金 (iii)、ni (ii), 銅 (ii) は、競争力のある BSA (図 3) で知られているサイト (Asp フラグメント) にバインドします。Cys34 キャップ BSA 錯結合 EEM ピーク パターンの変更を示しています、これらの結果を示す蛍光パターンを変更する特定の結合部位の変更方法。すべてチオール頂いた B...

金陽イオン (Au(III)) ウシ血清アルブミン (BSA) としてコンフォメーション依存のユニークな BSA Au 蛍光を特徴付けるのためのと同様、提示の様々 なコンフォメーションにバインディングを勉強のためのプロトコル。

Luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々 な立体構造の形成

The purpose of the presented protocols is to study the process of Au(III) binding to BSA, yielding conformation change-induced red fluorescence (&#955;em ...

この方法は、フルオロフォア形成や中間タンパク質複合体など、ナノサイエンス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、特定の金属結合部位やタンパク質を説明するのに役立つことです。まず、マグネチックスターバーを含む5ミリリットルの反応バイアルで、25ミリグラムのBSAを1ミリリットルのHPLCグレードの水に溶解します。次に、クロロアウリン酸とHPLCグレードの水の5ミリモル溶液を調製します。BSA溶液を含む反応バイアルを摂氏37度のウォーターバスに入れ、マグネチックスターラーを使用して750RPMで撹拌します。攪拌が始まった直後に、BSA溶液に1ミリリットルのクロロアウリン酸溶液を加えます。2分間撹拌した後、1モルの水酸化ナトリウムを100マイクロリットルの溶液に加えて、PHを12にします。反応バイアル中のHPLCグレードの水1ミリリットルに25ミリグラムのBSAを溶解します。次に、HPLCグレードの水に塩化銅二水和物の5ミリモル溶液を調製します。磁気攪拌棒を含む5ミリリットルの反応バイアルにBSA溶液1ミリリットルを加え、摂氏37度の水浴に入れます。溶液を750RPMで攪拌します。直ちに0.5ミリリットルの塩化銅二水和物溶液を反応バイアルに加える。2分間撹拌した後、75マイクロリットルの1モル水酸化ナトリウムを溶液に加えてPHを12にし、2時間撹拌します。これに続いて、HPLCグレードの水にクロロアウリン酸の5ミリモル溶液を調製します。0.5ミリリットルのクロロアウリン酸溶液を反応バイアルに加えます。次に、1モルの水酸化ナトリウムを使用してPHを12に調整し、溶液を2時間攪拌します。マグネティックスターバーを含む5ミリリットルの反応バイアルに1ミリリットルのBSA溶液を加え、摂氏37度の水浴に入れます。溶液を750RPMで攪拌します。直ちに、あらかじめ調製した5ミリモルの塩化ニッケル六水和物溶液0.5ミリリットルを反応バイアルに加えます。2分間撹拌した後、75マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムを加えてPHを12にし、2時間撹拌します。0.5ミリリットルの5ミリモルクロロオーリン酸溶液を反応バイアルに加えます。.次に、1モルの水酸化ナトリウムを使用してPHを12に調整し、反応混合物を2時間撹拌します。2ミリグラムのN-エチルマレイミドを1ミリリットルのPBSに溶解します。次に、2ミリグラムのBSAを1ミリリットルのマレイミド溶液に溶解します。溶液をマグネチックスターバーを含む5ミリリットルの反応バイアルに移し、摂氏20度、500RPMで1時間撹拌します。1時間後、500ミリリットルのPBSで12キロダルトンの透析チューブを使用して溶液を透析します。マグネチックスターラーで一晩50RPMで攪拌し、未反応のエチルマレイミドを除去します。翌日

luminophore-formation-various-conformations-bovine-serum-albumin

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は、共役高分子ポリジアセチレン（PDA）およびフルオロフォアの生体分子の検出のためのPDAのリポソームの表面に付着した間のFRETを示しています。 PDAのリポソームはまた、プローブとして使用する生体分子のための彼らの表面上の受容体分子が含まれていました。リガンド -...

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

このビデオでは、極薄エクソソーム切片の内腔領域に局在するバイオマーカーの金免疫染色を実演しています。この技術により、罹患細胞が分泌するエクソソーム内の標的分子を可視化することで、疾患の早期診断が可能になります。...

エキソソーム切片の金免疫染色:エキソソーム内腔の診断マーカーを可視化する技術

薬物負荷タンパク質をテンプレートとして使用した超小型蛍光金ナノクラスター（Au NCs）のin-situ合成に基づく低分子薬物スクリーニングのプロトコールが提示されます。この方法は、タンパク質をテンプレート化したAu...

タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

水系からの金の収着とリサイクルに関する基本的な情報を得るために、S層タンパク質上のAu(III)とAu(0)ナノ粒子の相互作用を調査しました。タンパク質ポリマーの吸着はICP-MSで、タンパク質性単分子膜の吸着はQCM-Dで調べました。その後のAFMにより、ナノ構造のイメージングが可能になります。...

SLP1ポリマーと単層のAuのインタラクションから<em&gt; Lysinibacillusスフェリカス</em&gt; JG-B53 - 生体分子金属研究のためのツールと​​して、QCM-D、ICP-MSおよびAFM

ナノ粒子ベースの光学プローブは、ラマン分光法とUV-Vis分光法を使用して抗原を検出するための手段として設計されています。ここでは、UV-Vis/ラマン分光法イムノアッセイ用のプローブを調製するためのプロトコルについて、将来のマルチプレックス機能を組み込むための方法について説明します。...

紫外可視およびラマン分光法イムノアッセイプラットフォームを製作

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

可動性の高い、近赤外線発光光発光金ナノクラスターの調製法と、フローサイトメトリーおよび共焦点レーザー走査顕微鏡によるHeLa細胞内での直接検出の信頼性と再現性の高い方法について説明する。...

近赤外線発光金ナノクラスターの生物応用のための合成

本プロトコルは、新規自己核生成抑制機構に基づく金ナノ粒子合成技術を用いて細胞内のメタロチオネインタグ付きタンパク質を検出するためのクローン可能な電子顕微鏡標識技術を記載する。...

細胞内EM可視金ナノ粒子の直接合成によるタンパク質局在解析(英語)

ここでは、アミロイドβ 1-40(Aβ 1-40)被覆された20 nm金凝集体の準可逆的自己組織化を記述する体系的な方法を紹介します。ペプチド間のナノサイズ依存性の準可逆的ネットワークは、特定のアミノ酸またはAβ...

アミロイドβ 1-40被覆金コロイドのpH依存性可逆的自己組織化の特性評価

また、不凍タンパク質として知られている氷結合タンパク質（IBPS）は、氷の成長を阻害し、組織の凍結保存に使用するための有望な添加剤です。...

アイス結合タンパク質の調査用のLabVIEWオペ新規ナノリッター浸透圧計

学ぶAu(III)イオンとBSAの結合による赤色蛍光発生メカニズム。pH依存性立体構造変化と複数結合部位の同定、タンパク質-金属相互作用研究に応用可能。

Luminophore 金の結合によるウシ血清アルブミンの様々な立体構造の形成

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