パラ分泌細胞間シグナル研究に近位の培養法

この方法は、2種類の細胞間の相互パラクリン相互作用とジャクスタクリン相互作用に関する細胞間コミュニケーション分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、典型的な培養条件下でパラクリンシグナル伝達を正確に捕捉すると同時に、効果的なジュスタクリンシグナル伝達を防ぐ、非常にシンプルで再現性の高い手法であることです。この手法の意味は、がん細胞と腫瘍微小環境との間のクロストークのメカニズムの理解を深めることにまで及びます。

この方法は、がん細胞と腫瘍間質との間の相互作用についての洞察を提供することができますが、創傷治癒や血管新生などの他のシステムにも適用できます。卵巣癌細胞を80%コンフルエント混合物から1ミリリットルの0.25%トリプシンで40〜60秒間分離することから始め、続いて6ミリリットルの完全な増殖培地で反応を中和します。遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全増殖培地に再懸濁します。

カウントした後、細胞を完全な成長培地濃度のミリリットルあたり100,000個の卵巣癌細胞に希釈し、実験条件ごとに3つの逆0.4マイクロメートルの細孔組織培養処理ポリカーボネート膜細胞培養インサートを適切なサイズの滅菌組織培養皿に入れます。実験条件に従ってインサートにラベルを付け、がん細胞を各インサートの底に同心円状に慎重にピペットで固定し、膜の中央から外側に移動して800マイクロリットルのドームを形成します。インキュベーション中に細胞を含む培地のドームがインサートの端から流れ出さないように、インサートの底面に細胞を播種するときは細心の注意を払ってください。

すべてのインサートが播種されたら、皿に蓋をして、インサートを細胞培養インキュベーターに慎重に置きます。約4時間後、HPMCを2ミリリットルの0.25%トリプシンで1〜2分間剥離し、続いて12ミリリットルの完全増殖培地で反応を中和します。遠心分離によりHPMCを回収し、ペレットを10ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁して計数します。

細胞を完全な成長培地のミリリットルあたり300, 000 HPMCに希釈し、6ウェル培養プレートの各ウェルに2.5ミリリットルの新鮮な完全な成長培地を追加します。滅菌鉗子を使用して、各インサートを右側を上にして6ウェルプレートの各ウェルに配置し、下部卵巣がん細胞の付着面が培地に浸されるようにします。次に、1.5ミリリットルのHPMCを各インサートのウェルに播種します。

次に、プレートを細胞培養インキュベーターに72時間置きます。インキュベーションの終わりに、各ウェルからインサートを慎重に取り外し、インサートの両側をPBSですすいでください。各インサートを新しい6ウェルプレートに置き、インサートウェルに0.5ミリリットルのトリプシンを、ボトムウェルに2ミリリットルのトリプシンを追加します。

摂氏37度で2分間過ごした後、各インサートに1ミリリットルの完全増殖培地を加え、メンブレンを引き裂いたり、細胞懸濁液を下のウェルにこぼしたりしないように、溶液を数回慎重にピペットで動かします。ピペッティング中は、1つのチャンバーからの細胞が他のチャンバーと交差汚染しないように注意する必要があります。再懸濁した細胞を標識された収集チューブに移し、さらに2ミリリットルの完全増殖培地でトリプシンを中和します。

インサートの底部に細胞を採取するには、6ウェルプレートの対応するウェルから2ミリリットルのトリプシンでメンブレンの底部を2〜3回洗い流し、分離した細胞が適切なウェル底に捕捉されるようにします。すべての細胞が剥離したら、各ウェルのトリプシンを6ミリリットルの新鮮な増殖培地で中和し、細胞懸濁液を標識されたコレクションチューブに移します。次に、遠心分離によってすべての細胞を回収し、標準的なプロトコルに従ってRNA抽出および単離のために、チューブあたり0.7ミリリットルのフェノールおよびグアニジンチオシアン酸ベースの溶解試薬にペレットを再懸濁します。

卵巣がん細胞を用いたHPMCの近位培養は、がん細胞の非存在下でインサートに播種された対照HPMCと比較して、フィブロネクチンおよびトランスフォーミング成長因子またはTGFベータ1の発現を増加させます。フィブロネクチンとTGFベータの発現は、HPMCとの近位培養で卵巣癌細胞でも有意に増加します。逆に、HPMC馴化培地で処理された卵巣癌細胞は、TGFベータ1発現に変化を伴わずに、フィブロネクチン発現が有意に減少することを示しています。

しかし、中和抗体によるTGFベータ1の遮断は、HPMCsとの近位培養における卵巣癌細胞におけるTGFベータ1の発現の有意な減少をもたらす。興味深いことに、TGFベータ1の発現のわずかな増加は、おそらく代償応答として、制御された非近位培養卵巣癌細胞で観察される。卵巣がん細胞を用いた近位培養は、HPMCにおけるE-カドヘリン発現をわずかに増加させ、HPMCに近接して増殖した卵巣がん細胞では、対照群と比較してE-カドヘリンの顕著な減少が観察されることから、転移部位における卵巣がん細胞と正常細胞との間のパラクリンシグナル伝達を研究するための近位培養系の有効性がさらに実証されました。

この手順を試行する際には、播種する細胞の数と近位培養の期間を最適化することが重要です。この手順に続いて、イムノブロッティングなどの他の方法を実行して、腫瘍細胞中皮細胞共培養中のタンパク質発現の変化と下流の処理シグナル伝達経路の活性化に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、腫瘍微小環境、免疫学、発生生物学の分野の研究者が、分泌因子を介した細胞間のパラクリンの相互相互作用を探求する道を開きました。