Name: 無細胞性と細胞の肺転移モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶ無細胞性と細胞性の肺転移モデルによる腫瘍進行の研究法。ラットを用いたex vivoモデルで原発腫瘍と循環腫瘍細胞を形成し、個別化医療への応用を評価します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

分 p. キム第 2 ジョン ・ w ・ Kirklin 研究奨学金、ジョアン h. コーン研究賞とマイケル ・ m ・胸部手術、グラハム研究財団、ヒューストン メソジスト専門医師グループ許可のためのアメリカ連合から支援助成を受けた。アンについては、原稿の言語編集を感謝いたします。

動物実験のためのプロトコルは、機関動物ケアとヒューストン メソジスト研究所利用委員会によって承認され、すべての規制、法律、ガイドライン、およびポリシーに基づき実施します。
1. ラット肺収穫
<ol><li>ケタミン (100 mg/kg) とその麓のキシラジン (10 mg/kg) の腹腔内 (IP) 投与による 4-6 週齢雄 Sprague-dawley ラットを麻酔します。麻酔と後肢のつま先は、ピンセットでつままれて動きの不在を確認して、確認します。</li>
	<li>10 分後胸部と腹部を剃るし、クロルヘキシジン綿棒で肌を拭いてください。</li>
	<li>鉗子を拾って、使い捨てメスで切開は、皮膚を削除します。メスで切開して胸腔内を開き、左側の肋骨の前方側および横隔膜の右側をハサミで切断することによって両側開胸下を実行します。 注: これは非生存の手術です。</li>
	<li>胸郭をホールド アップし、27 G の針を使用して心臓の右心室にヘパリン (1,000 単位/mL) 2 mL を注入します。 注: これは肺の血栓の形成を防ぐ。</li>
	<li>完全にハサミで胸郭を取り出し、血が出るまでに、通気孔として左心室に 18 G 針を置きます。その後、ヘパリン リン酸緩衝生理食塩水 (12.5 単位/ml; ヘパリン PBS) 15 mL を 25 G 針を使用して右心室に注入します。</li>
	<li>劣ると優れた下大静脈、心臓の右側にある 2 つの大きな静脈を切り取って追加 10 ml ヘパリン PBS 27 G の針を使用して右心室の肺をフラッシュします。 注: 下大静脈は大きな船として心の底の下で視覚化される赤い血でいっぱい。同様に、心臓の上の部分で、上大静脈を視覚化して、大きな船として。</li>
	<li>甲状腺の基地で気管をカットします。半奇静脈とアーチで大動脈の枝のレベルで下行大動脈を慎重に取り外します。</li>
	<li>胸腔内とラットの体の残りの部分から心臓肺ブロックを取り出してください。</li>
	<li>右と左の心室の半分を切断することによって心を実行し、肺動脈 (PA) に右心室を介してカスタム済み 18 G ステンレス鋼針カニューレを配置します。</li>
	<li>2-0 シルク ネクタイでカニューレを固定し、慎重に右心室と心房を公開します。</li>
	<li>左心室内女性ルアー隔壁を置き、2-0 シルク ネクタイで固定します。</li>
	<li>PA カニューレを通じてヘパリン PBS の 20 ml 心臓肺ブロックをフラッシュし、文化メディアまたはヘパリンの PBS を含む 50 の mL の管にそれを置きます。 注: セルラー モデル 3.1 バイオリアクターを設定する手順に進みます。無細胞性モデル、decellularization の 2.1 手順に進みます。</li>
</ol>2. 肺 Decellularization
<ol><li>
Decellularization ユニットの準備
	<ol>
<li>ボトル キャップで 2 つ穴ピアスと穴 (図 1 aと1 b) に女性のルアーをスナップして各 decellularization 商工会議所/ボトルを準備します。それを反対側に黒のナイロン リングで固定します。同様に、静脈内投与セットの添付ファイル (図 1) のための別のボトル キャップで 1 つの穴をドリルします。 注:図 1 aおよび1 bの 2 つの異なる側面から同じペットボトルのキャップです。図 1は、2.1.1 の手順で上記のようの単一の穴と異なるキャップです。</li>
		<li>ボトル キャップ (図 1 aと1 b) の中から女性のルアーに (肺動脈または PA 終了) で 0.5 インチ管と 6 インチ管 (図 1 j) を添付し、両端男性ルアーロックを添付します。Decellularization 商工会議所/ボトルと 500 mL のボトルでロックを設定します。</li>
		<li>女性ルアーのカートリッジ (図 1) によってポンプ ヘッド (図 1Eと1 階) に取り付けられているポンプ チューブ (図 1 H) のどちらかの端に 2 つの 2 フィート チューブ (これは男性ルアーロックで接続されている) の一端を接続します。ロック (図 1I)。</li>
		<li>2 フィートからチューブの (ステップ 2.1.3) 各 decellularization 商工会議所/ボトル キャップ (図 1 L) に女性ルアー ロックの頭に他の端点を接続します。</li>
		<li>250 ml セット ボトル キャップと decellularization c に接続されている 2 フィートのチューブを取り付け、遠位端に挿入されます (図 1) 静脈内投与セットの近位端でスタンドに倒立ボトルを掛けることによって PBS (PBS の 200 mL の) でボトルをヘパリン化先のハンバー/ボトル PA 端 (図 1 b)。廃棄ボトルにこの 2 フィートのチューブを接続します。 注:図 1 Kで示すように、ボトルは段ボールに設定されます。点滴のチューブは肺足場の試薬を分注するハンギング ボトルから出てくる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
肺 decellularization プロセス
	<ol>
<li>Decellularization 商工会議所/ボトルで自由に流れるまで 30 mm Hg (図 1 K) の生理学的な灌流圧でヘパリンの PBS を実行、その後、PA カニューレを介して PA まで心臓肺ブロックを取り付けます。</li>
		<li>Decellularization 商工会議所/ボトル中余分なバッファー/ソリューションに取得しますので、ポンプを連続的に実行してください。</li>
		<li>最初の洗浄水 (図 1 K) の 30 mm Hg の潅流圧で 15 分の PA のヘパリンの PBS を実行します。</li>
		<li>0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 脱イオン水とヘパリンの PBS ボトルを交換し、decellularization の 2 h の肺を灌流します。</li>
		<li>Decellularization 後、15 分間肺足場をオートクレーブ処理した純水を灌流します。</li>
		<li>次に、脱イオン水で 10 分間の 1% 非イオン性洗剤を灌流します。</li>
		<li>500 ml ボトル内キャップをそのままハング肺を維持する 1 x 抗生物質 (ペニシリン-ストレプトマイシン アムホテリシン) を添加したオートクレーブの PBS の decellularization の商工会議所/ボトルを交換してください。</li>
		<li>静脈内投与セット、decellularization 室肺動脈末に廃棄容器に接続されている 2 フィートのチューブを入れて、6 mL/分 (図 1 L) ポンプを実行を破棄します。</li>
		<li>72 h の肺灌流し、抗生物質 12 時間間隔で PBS を変え続けます。 注: 無細胞性肺は即時の使用の準備ができて。必要になるまで-80 ° C で保存できます。ピンク色の斑点や血栓は、肺の葉で明確に視覚化することは、肺を破棄します。ランダムに DNA や病理組織学的にテストすることが可能です。細胞や DNA の 99.9% が洗い流されるが、完全な無細胞性肺は表示されません。 注: 細胞肺モデルを操作する場合は、decellularization をスキップします。収穫された肺 (ステップ 1) は、バイオリアクター内で直接設定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. バイオリアクター セットアップ
<ol><li>バイオリアクター ボトルとセットアップに必要なアイテムを準備します。<ol>
<li>等距離にある 1 つの 500 mL ボトルのキャップで 3 つの穴をドリルし、黒のナイロン リング (図 2 aおよび2 b) を使用してすべての 3 つの穴で女性ルアーを修正します。 注: 2 つの穴で、ルアーロックでは、一方の端が瓶の内側を向く間「顔、外を終了します。</li>
		<li>バイオリアクターあたりポンプ チューブの 6、管内 2、チューブ、1.5 フィート管、2 フィート管と 10 フィートの人工チューブで 6 をカットします。</li>
		<li>ステンレス鋼、18 G の針をカットし、再度、気管カニューレの生体適合性のチューブの両端を接続します。</li>
		<li>オートクレーブ テープ (図 2) を使用して電磁ワイヤー メッシュ上の両端ルアーロック ロック コネクタを備えた人工チューブをラップします。</li>
		<li>オートクレーブ上記項目し、10 分のために軽い UV でそれらを保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な間隔で簡単に 500 mL のボトルに合わせてトレイの間通常のセル文化のインキュベーター (37 ° C、5% CO2) 内ポンプを設定します。</li>
	<li>ポンプ カートリッジの 70% エタノールをスプレー、ポンプに両端ルアーロック ロックのメスコネクタでポンプのチューブを接続します。</li>
	<li>ポンプ チューブとバイオリアクター内で 1.5 フィートのチューブのもう一方の端に、人工の一端 (流出) を接続して携帯文化のインキュベーター内電磁ワイヤー メッシュを包んだ肺を設定します。</li>
	<li>無菌条件でキャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを設定します。<ol>
<li>PA を通して流れを制御する女性ルアーズの一つの頭に三方活栓 (黄色) を添付します。</li>
		<li>別女性ルアー ロックの隔壁細胞 (図 2 f) 気管を通じて播種の一方向バルブ (青) に接続します。</li>
		<li>外側にチューブの 2 を接続 (白) と、メディアを循環するボトルの内側にチューブの 6。2 フィートのチューブに男性ルアーロックを合わせて女性のルアーロック ラグ スタイル追加または何かを削除するへのアクセスを提供するために t シャツを添付してください。</li>
		<li>3 ウェイ コネクタ (女性ルアー ラグ スタイル t シャツ) の開口部のいずれか一方向バルブを取り付けます。</li>
		<li>ルアーロックを男性と女性のルアーロックを 2 フィート管に接続します。</li>
		<li>10 %fbs と 1% 抗生物質細胞培養培地 (セル条件によって異なります) と RPMI1640 の 200 mL を追加し、バイオリアクターをインキュベーターに転送します。2 つの開放端 (一方向バルブとティー コネクタ) に閉ループ型バイオリアクターに人工のチューブを接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブに気泡が存在しないので、あらかじめ 6 mL/分肺やチューブ、埋めるための細胞培養媒体の携帯文化のインキュベーター内でポンプを実行します。</li>
	<li>チューブが満ちている一度メディア、活栓を閉じるバイオリアクター ボトルから取り出してインキュベーター バイオリアクター ボトルの両端から、人工肺を切断してください。</li>
	<li>キャビネット、バイオ セーフティにおけるバイオリアクター ボトルを入れて、バルブ、文化メディアを渡す、男性のルアーロック コネクタを介して活栓に肺癌の足場 (無細胞性または細胞) の PA カニューレを取り付けます。 注: ここでそれは無細胞性モデル (decellularization プロセスに続く) または新鮮な収穫心臓肺ブロックを使用することが可能 (ネイティブ ラット細胞はすなわち、細胞モデルをそのまま維持されます)。</li>
	<li>空気を抜くと気管に絹糸によって気管カニューレを結ぶ片道活栓を通じて文化メディアを渡します。</li>
	<li>PA と気管の任意のねじれを避けるためにことを確認します。すぐ肺とバイオリアクターのボトル キャップ内部足場、再び、無菌、バイオリアクターをインキュベーターに転送し、6 mL/分の速度でポンプを起動します。</li>
	<li>すべて葉膨らまされると肺に良い形 (図 2) に見えるように 10-15 分間培地を実行します。</li>
</ol>4. 転移モデルと細胞の播種
メモ: セルのシーディングは原発腫瘍の成長に関する上記の肺モデルに進みます。転移モデルのとおり肺足場 (無細胞性または携帯電話) を変更します。
<ol><li>インキュベーターから肺足場とバイオリアクターを取り出して、キャビネット、バイオ セーフティにおけるそれを置きます。</li>
	<li>気管を通じて培地 5 mL を渡すし、絞首刑とバイオリアクター キャップを開き、ルアーロック注射器を使用して肺の足場 (図 2 f)。</li>
	<li>この段階でもう一人は肺転移モデルの変更のために必要です。</li>
	<li>シルク 2-0 準備し、分岐ポイントで気管を通過する角度鉗子を使用を取得します。</li>
	<li>分岐点で右肺に気管を結ぶ、文化メディアを渡すことにより肺気管を通じてメディアの自由な流れを確認します。 注: 気管分岐時点で結びついている、一度気管を通じて播種された細胞、自動的に左葉にシードします。気管を通じてプッシュの培地で細胞を播種する前にテストできます。転移モデルでメディアは、のみを膨らませるが、左葉と右葉,10に移動します。</li>
	<li>20 mL ルアーロック注射器を気管カニューレの上を設定し、RPMI1640 完全培地 (図 2 f) 50 mL に ATCC 肺癌細胞 (A549、H1299) を追加します。</li>
	<li>バイオ セーフティ キャビネットの播種細胞を実行します。注射器で細胞の 15 の mL を追加し、重力によって肺の葉を通過せてください。空気の泡が通過する前に、セルの残りの部分を追加します。</li>
	<li>無細胞性肺癌播種、バイオリアクター瓶に滴り灌流のメディアを収集して気管を通過するもう一度 3 x みましょう。 注: 灌流のメディアは時々 シードがん細胞にあります。したがって、効率的なシーディングのためメディア再び戻す気管内注射器を介して。</li>
	<li>一度シード、シリンジは、15 分待つ、新鮮なメディアを追加、バイオリアクターをインキュベーターに返します。チューブ内の空気の泡を削除します。</li>
	<li>6 mL/分でメディアを灌流するためにポンプを起動します。</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
<li>Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Cancer+Statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Lung Cancer Statistics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).</li>
<li>Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+CDX+models+as+a+tool+for+preclinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Lung+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development.</a> Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Bissell, M. J., Hines, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+don%27t+we+get+more+cancer%3F+A+proposed+role+of+the+microenvironment+in+restraining+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression.</a> Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+in+an+ex+vivo+3D+lung+model+produce+matrix+metalloproteinases+not+produced+in+2D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture.</a> PloS One. 7 (9), e45308(2012).</li>
<li>Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+from+a+4-dimensional+lung+cancer+model+are+resistant+to+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+A549+cells+from+tissue+of+4D+model+predicts+poor+prognosis+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer.+Journal+International+du+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients.</a> International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+four-dimensional+lung+cancer+model+mimics+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+cancer+cells+grown+on+acellular+rat+lung+matrix+create+perfusable+tumor+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).</li>
<li>Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cells+form+primary+tumors+on+ex+vivo+four-dimensional+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model.</a> Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).</li>
<li>Mishra, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lung+Fibroblasts+Inhibit+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Metastasis+in+Ex+Vivo+4D+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model.</a> The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).</li>
<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

前のヴィヴォ4 D 肺腫瘍の成長と転移研究室のセットアップを勉強する機会を提供します。ネイティブ肺マトリックスは、正常な組織への支援を提供し、組織形成、細胞分化、細胞マトリックス相互作用の細胞間相互作用を維持する複雑なシステムです。それは腫瘍の成長への影響や他の細胞との相互作用を研究する、腫瘍微小環境のコンポーネントを追加する機会を提供します。
肺の収穫は、前のヴィヴォ4 D 肺モデルの重要なステップです。胸部の開封後ヘパリン注射を管理するための遅延可能性があります、decellularization 中に試薬の自由な流れに影響を与えるかもしれない肺の血栓。無色の液体が口から来るまでヘパリンの PBS の適切なフラッシュは、セルラー モデルで特に重要です。PA に害を避けるために重要であるが、上大静脈の注意切削です。Decellularization プロセス中に気泡肺足場への移動を避けるために非常に重要です。空気泡の存在は、試薬の流れを止めることや不適切な decellularization に貢献遅く可能性があります。泡は 10-20 mL ...

がん転移はほとんど癌関連死の背後にある原因、がんと闘うための努力で究極の挑戦を提起します。このメソッドの全体的な目標は、三次元 (3 D) 細胞の増殖だけでなく、流れの次元四次元 (4 D) の細胞培養のプロトコルを設計することです。[すなわち腫瘍、循環腫瘍細胞 (CTCs) と転移巣] 転移プロセスの 3 つの異なるフェーズを表します。
過去 3 年間は、世界中の科学者は、比類のない豊富な治療法や進行自由な存続の見通しを改善した別の癌で転移性進行のメカニズムを理解するための情報を得られました。乳がんなどのいくつかの癌の臨床管理は著しく1;ただし、いくつかの癌、肺癌などまだ貧しい人々 の生存の2があります。In vitroとin vivoの動物モデルは病気の開発を支えるメカニズムに新しい洞察力を生成するのに尽力されています。ここ数年で細胞由来の異種移植片 (CDX) と患者由来の異種移植片 (PDX) もっと興味彼らは人間の腫瘍の3成長カイネティクスなど多くの関連する機能、組織学的特徴、行動を維持するとされています。特性、および療法への応答。ただし、各モデルには、CTC の形成と遠隔臓器4,5,6に転移のメカニズムを理解する限界があります。
最近では、オルガンのリエンジニア リングおよび灌流ベースの細胞培養の概念を用いた 4 D前のヴィヴォ肺の癌モデルを開発しました。がん分泌と同様人間と時間をかけて成長 perfusable 腫瘍結節を形成することによって人間の肺の癌の成長を模倣したタンパク質生産7。それは癌患者の予後を予測するとまたシスプラチン治療8,9時に腫瘍の回帰分析による治療反応を示す遺伝子発現シグネチャを表します。肺のモデルは、それは転移巣を形成することができますので、さらに変更されました。Ctc は、血管系に原発巣および intravasate から開発し、対側肺転移巣10を形成するために extravasate。遺伝子発現の研究では、転移巣、Ctc、原発腫瘍の明確な発現プロファイルと表現型10に必要な遺伝子のサブセットのアップレギュレーションを示唆しています。がんの患者さんで見られる生物学的条件の存在のためにこの転移プロセスが発生します。このモデルの利点は自然行列とアーキテクチャの存在と腫瘍結節の形成につながる栄養素の血流。さらに、それはまた時間をかけて腫瘍進行に及ぼす腫瘍微小環境や薬のさまざまなコンポーネントを勉強する機会を提供します。このモデルは、実験室のセットアップの癌細胞 (肺がん、乳がん、肉腫など) の範囲を拡大する使用できます。

<table><tbody><tr><td>Sprague Dowley rat</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>Male</td></tr><tr><td>Chlorhexidine swab</td><td>Prevantics, NY, USA</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18ゲージ針</td><td>McMaster Carr, USA</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 silk tie</td><td>Ethicon, San Angelo, TX, USA</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S ポンプ</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S ポンプヘッド</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S ポンプカートリッジ</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tube</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex ポンプチューブ</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>メス ルアー ロック コネクタ</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>オス ルアー ロック コネクタ</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>ブラック ナイロン リング</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>静脈内セット</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Oxygenator</td><td>Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-Wire</td></tr> <tr><td>mesh</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New Yorkワイヤー</td></tr><tr><td>メスルアーラグスタイルTEE</td><td>コールパーマー、イリノイ州バーノンヒルズ、米国</td><td>45508-56</td><td></td></tr>男性<tr><td>ルアー一体型ロックリングから200seriesバーブ</td><td>コールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州、米国</td><td>45518-08</td><td></td></tr>メス<tr><td>ルアースレッドスタイルのカプラー</td><td>コールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ</td>州<td>、米国45508-22</td><td></td></tr><tr><td>クレーブコネクタ</td><td>ICUメディカル</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo & 貿易;4ウェイストップコックw /スイベルオスルアーロック</td><td>スミスメディカル</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlexポンプチューブ</td><td>コールパーマー、バーノンヒルズ、イリノイ州、カ</td><td>ニューレ用</td><td>06598-13</td></tr></tbody></table>

無細胞性と細胞の肺転移モデル

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

腫瘍の進行のさまざまな時点で腫瘍の細胞を分離することは困難です。自然な行列と腫瘍細胞との相互作用、栄養素の継続的な流れを示すことができる前のヴィヴォ肺モデルだけでなく、腫瘍細胞が通常の細胞成分と相互作用を示し、天然マトリックス モデルを作成しました。前のヴィヴォ無細胞性肺モデルは、ラット心臓肺ブロックを分離し、decellularization プロセスを使用してすべてのセルを削除することによって作成されます。右主気管支は縛し、腫瘍細胞は注射器で気管に格納されます。セルは移動し、左肺を設定します。肺は、肺動脈が、閉回路でメディアの継続的な流れを受け取るバイオリアクターに格納されます。左肺上に成長した腫瘍は、原発腫瘍です。循環のメディアに分離されている腫瘍細胞は循環腫瘍細胞と右肺に腫瘍細胞が転移巣。携帯電話前のヴィヴォ肺モデルが decellularization プロセスをスキップすることにより作成されます。各モデルは、異なる研究の質問に答えるに使用できます。

ラットから採取した肺はそのまま血管と肺胞11 (図 3 aと3 b) を保持しています。Decellularization に無細胞性肺、エラスチン、フィブロネクチン、コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分は11 (図 3、 3 D 3 e、 3 f) に保持されます。ヘマトキシリンとエオシン (H &amp; E) によって観察することができる肺の存在のネイティブ ラット細胞の完全な除去につながる、decellularization 染色細胞、DNA 量 (の減少を示す DNA 解析11の欠落を示す図 3 Dと<str...

ここでは、プロトコルを提案前のヴィヴォ肺がんモデルの腫瘍の進行の手順を模倣し、原発巣を特定するのに役立ちます循環腫瘍細胞と転移巣。

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

この方法は、腫瘍の進行に関連する主要な質問に答えるのに役立ちます。ex vivoの無細胞性および細胞性肺モデルは、時間の経過とともに成長し、循環腫瘍細胞と転移性病変を形成する原発腫瘍の形成を可能にします。この手法の主な利点は、短縮された時間でのがんの進行とさまざまな種類のがん細胞の成長の研究を可能にすることです。この技術の意味は、患者の腫瘍細胞をモデルで使用して免疫細胞を含む治療薬の有効性を評価できるため、個別化治療にまで及びます。深く麻酔をかけたラットから始めます。胸部と腹部を剃り、クロルヘキシジン綿棒で皮膚を拭きます。胸腔を開いた後、横隔膜の右側で左側の胸郭の前面を切開して両側開胸術を行います。胸郭を持ち上げ、27ゲージの針を使用して、鼓動する心臓の右心室に1000単位/ミリリットルのヘパリンを2ミリリットル注入して、肺に血栓が形成されるのを防ぎます。胸郭を取り外した後、血液を排出するための通気口として左心室に18ゲージの針を配置し、次に25ゲージの針を使用して、ヘパリン化PBSの1ミリリットルあたり12.5単位を右心室に注入します。次に、甲状腺の基部で気管を切断し、ヘミア接合体静脈のレベルで下行する大動脈とアーチの大動脈の枝を慎重に取り除きます。胸腔から心肺ブロックを切除した後、右心室と左心室の半分を切り取り、カスタムメイドの18ゲージステンレス製ニードルカニューレを右心室から主肺動脈に留置します。カニューレを2-0シルクタイで固定し、右心室と心房を慎重に露出させます。まず、ヘパリン化PBSを30ミリメートル水銀の生理灌流圧で、脱細胞化ユニットのボトルに自由に流れ込むまで実行し、次に心肺ブロックを肺動脈カニューレを介して肺動脈端の脱細胞化ユニットに取り付けます。ヘパリン処理されたPBSで15分間洗浄した後、ヘパリン処理されたPBSボトルを0.15%のドデシル硫酸ナトリウムと脱イオン水を含むものと交換し、肺を2時間灌流して脱細胞化します。脱細胞化後、脱イオンオートクレーブ水に肺足場を通して15分間灌流し、続いて脱イオン水に1%非イオン性界面活性剤を10分間注入します。最後に、ボトルを抗生物質を補充した500ミリリットルのオートクレーブ滅菌PBSと交換します。ポンプを毎分6ミリリットルで運転し、肺を72時間灌流した後、無細胞肺をすぐに使用できるようになります。ポンプカートリッジに70%エタノールをスプレーし、酸素発生器の流出端をポンプチューブに接続し、もう一方の端をバイオリアクターの1.5フィートチューブに接続して酸素発生器をセットアップします。バイオリアクターボトルを無菌条件下でバイオセーフティキャビネットにセットします。メスのルアーロックのヘッドに三方ストップコックを取り付けて肺動脈の流れを制御し、次に一方向のストップコックを別のメスのルアーロックバルクヘッドに接続して、気管を介して細胞を播種します。ボトルの外側に2インチのチューブ、内側に6インチのチューブを接続して、媒体を循環させます。バイオリアクターボトルを酸素供給器に接続するためのチューブを準備します。オスのルアーロックを2フィートチューブに取り付け、メスのルアーラグスタイルのTを取り付けてアクセシビリティを確保し、オスのルアーロックとメスのルアーロックを2フィートチューブに取り付けます。細胞培養培地を添加し、バイオリアクターをインキュベーターに移します。酸素供給器チューブを2つの開放端に接続して、閉ループバイオリアクターにします。ポンプを毎分6ミリリットルで事前運転して、酸素供給器とチューブに培養培地を充填し、チューブ内に気泡が存在しないようにします。チューブに培地が充填されたら、ストップコックを閉じ、バイオリアクターボトルの両端から酸素発生器を外します。バイオリアクターボトルをバイオセーフティキャビネットに入れ、培地をストップコックに通し、肺足場の肺カニューレを取り付けます。細胞肺モデルを使用する場合は、脱細胞化をスキップします。採取した肺は、バイオリアクターに二次元的にセットすることができます。培地を再度一方向ストップコックに通して空気を取り除き、気管カニューレを絹糸で気管に結び、バイオリアクターボトルのキャップを閉じます。バイオリアクターをインキュベーターに移し、ポンプを始動します。培地を10〜15分間流して、すべての葉が膨らみ、肺が良好な状態にあることを確認します。転移モデルについて、無細胞または細胞性肺の足場を次のように変更します。吊り下げ式肺足場でバイオリアクターキャップを開き、ルアーロックシリンジを使用して5ミリリットルの培地を気管に通します。角鉗子を使用して、分岐点で2-0シルクを気管に通します。分岐点で右肺に向かう気管を結び、培地を通って気管を通って左肺への培地の自由な流れを確認します。A549やH1299などの肺がん細胞を、RPMI 1640完全培養培地に1ミリリットルあたり200万〜300万細胞の濃度で調製します。気管カニューレの上に20ミリリットルのルアーロックシリンジをセットし、シリンジに15ミリリットルの細胞を追加します。細胞懸濁液が重力によって肺葉を通過するのを待ちます。気泡が通過する前に、残りのセルを追加します。播種したら、シリンジを取り外して15分間待ってから、バイオリアクターに新しい培地を追加します。それをインキュベーターに戻し、気泡を取り除いた後、毎分6ミリリットルで肺足場を灌流します。無傷の肺の組織病理学は、肺胞と肺細胞を示しています。ここで見られるように、脱細胞化は肺細胞の完全な除去につながり、無細胞肺の組織病理学は無傷の基底膜を明らかにします。Movatのペンタクロームとエラスチンの脱細胞化肺の染色は、コラーゲン、フィブリン、エラスチンの存在を明らかにし、血管系と気管支は無傷です。脱細胞化肺のDNA分析は、DNA含有量の99%以上の減少を示しています無細胞肺は、細胞培養のためのバイオリアクターで直接使用することができます。組織学的解析により、腫瘍増殖の存在が示されています。この手順を試みるときは、心臓の右心室にヘパリンを注入することを覚えておくことが重要です。この開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が肺がんの腫瘍細胞の転移につながる遺伝的およびエピジェネティックな変化を探求する道を開きました。

acellular-and-cellular-lung-model-to-study-tumor-metastasis

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、ヒト癌細胞株の転移能を決定するために使用される実験的転移アッセイの手順を説明します。...

実験的転移アッセイ

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

このプロトコルの目標は、乳房の腫瘍形成を研究することです。この技術では、マウスの乳腺腫瘍を切除し、腫瘍から初代細胞を調製します。肺転移を研究するための肺抽出プロトコルが含まれています。さらに、マウス胚からのマウス胚性線維芽細胞を分析するための別のプロトコルが含まれている。...

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。...

肺腫瘍細胞募集試験

マウスの蛍光レポーターを利用して、肺転移内の腫瘍細胞間質相互作用のex...

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

転移性クローンが遠く離れた場所にコロニーを形成する能力は、その増殖能力および/または大きな増殖なしに宿主の微小環境で生き残る能力に依存します。ここでは、転移性クローンによる両方のタイプの肝臓コロニー形成を定量的に可視化できる動物モデルを紹介します。...

肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

この記事の目的は、肺転移アッセイ (プーマ) のプロトコルの詳細な説明を提供するためにです。このモデルは、広視野蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して肺の転移性骨肉腫 (OS)...

肺転移アッセイを用いた骨肉腫の肺転移を植民地化の勉強に実用的な考慮事項

血中循環がん細胞 (Ctc) がん転移中に肺を植民地化を促進する上での役割を解読する動物モデルです。ここでは、私たちが設立され、正常に実行体内法を具体的にテスト肺植民地化の Ctc の高分子フィブロネクチン (polyFN)...

肺組織に腫瘍のセルの視覚化を循環させるため肺植民地化アッセイの確立

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。...

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

ここでは、肺の高解像度の生体内イメージングを可能にするマウス胸郭用の永久に留置された光学窓の外科的移植のためのプロトコルを提示する。ウィンドウの永続性は、肺の動的細胞プロセス、特に播種された腫瘍細胞の転移進行など、ゆっくりと進化している細胞プロセスの研究に適しています。...

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

この原稿は、同所注射された乳房腫瘍からの自然肺転移の確立および縦断的成長モニタリングの方法論を説明しており、転移カスケードのすべての段階での介入に適しています。...

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

学ぶ無細胞性と細胞性の肺転移モデルによる腫瘍進行の研究法。ラットを用いたex vivoモデルで原発腫瘍と循環腫瘍細胞を形成し、個別化医療への応用を評価します。

無細胞性と細胞の肺転移モデル

さらに動画を探す