無細胞性と細胞の肺転移モデル

この方法は、腫瘍の進行に関連する主要な質問に答えるのに役立ちます。ex vivoの無細胞性および細胞性肺モデルは、時間の経過とともに成長し、循環腫瘍細胞と転移性病変を形成する原発腫瘍の形成を可能にします。この手法の主な利点は、短縮された時間でのがんの進行とさまざまな種類のがん細胞の成長の研究を可能にすることです。

この技術の意味は、患者の腫瘍細胞をモデルで使用して免疫細胞を含む治療薬の有効性を評価できるため、個別化治療にまで及びます。深く麻酔をかけたラットから始めます。胸部と腹部を剃り、クロルヘキシジン綿棒で皮膚を拭きます。

胸腔を開いた後、横隔膜の右側で左側の胸郭の前面を切開して両側開胸術を行います。胸郭を持ち上げ、27ゲージの針を使用して、鼓動する心臓の右心室に1000単位/ミリリットルのヘパリンを2ミリリットル注入して、肺に血栓が形成されるのを防ぎます。胸郭を取り外した後、血液を排出するための通気口として左心室に18ゲージの針を配置し、次に25ゲージの針を使用して、ヘパリン化PBSの1ミリリットルあたり12.5単位を右心室に注入します。

次に、甲状腺の基部で気管を切断し、ヘミア接合体静脈のレベルで下行する大動脈とアーチの大動脈の枝を慎重に取り除きます。胸腔から心肺ブロックを切除した後、右心室と左心室の半分を切り取り、カスタムメイドの18ゲージステンレス製ニードルカニューレを右心室から主肺動脈に留置します。カニューレを2-0シルクタイで固定し、右心室と心房を慎重に露出させます。

まず、ヘパリン化PBSを30ミリメートル水銀の生理灌流圧で、脱細胞化ユニットのボトルに自由に流れ込むまで実行し、次に心肺ブロックを肺動脈カニューレを介して肺動脈端の脱細胞化ユニットに取り付けます。ヘパリン処理されたPBSで15分間洗浄した後、ヘパリン処理されたPBSボトルを0.15%のドデシル硫酸ナトリウムと脱イオン水を含むものと交換し、肺を2時間灌流して脱細胞化します。脱細胞化後、脱イオンオートクレーブ水に肺足場を通して15分間灌流し、続いて脱イオン水に1%非イオン性界面活性剤を10分間

最後に、ボトルを抗生物質を補充した500ミリリットルのオートクレーブ滅菌PBSと交換します。ポンプを毎分6ミリリットルで運転し、肺を72時間灌流した後、無細胞肺をすぐに使用できるようになります。ポンプカートリッジに70%エタノールをスプレーし、酸素発生器の流出端をポンプチューブに接続し、もう一方の端をバイオリアクターの1.5フィートチューブに接続して酸素発生器をセットアップします。

バイオリアクターボトルを無菌条件下でバイオセーフティキャビネットにセットします。メスのルアーロックのヘッドに三方ストップコックを取り付けて肺動脈の流れを制御し、次に一方向のストップコックを別のメスのルアーロックバルクヘッドに接続して、気管を介して細胞を播種します。ボトルの外側に2インチのチューブ、内側に6インチのチューブを接続して、媒体を循環させます。

バイオリアクターボトルを酸素供給器に接続するためのチューブを準備します。オスのルアーロックを2フィートチューブに取り付け、メスのルアーラグスタイルのTを取り付けてアクセシビリティを確保し、オスのルアーロックとメスのルアーロックを2フィートチューブに取り付けます。細胞培養培地を添加し、バイオリアクターをインキュベーターに移します。

酸素供給器チューブを2つの開放端に接続して、閉ループバイオリアクターにします。ポンプを毎分6ミリリットルで事前運転して、酸素供給器とチューブに培養培地を充填し、チューブ内に気泡が存在しないようにします。チューブに培地が充填されたら、ストップコックを閉じ、バイオリアクターボトルの両端から酸素発生器を外します。

バイオリアクターボトルをバイオセーフティキャビネットに入れ、培地をストップコックに通し、肺足場の肺カニューレを取り付けます。細胞肺モデルを使用する場合は、脱細胞化をスキップします。採取した肺は、バイオリアクターに二次元的にセットすることができます。

培地を再度一方向ストップコックに通して空気を取り除き、気管カニューレを絹糸で気管に結び、バイオリアクターボトルのキャップを閉じます。バイオリアクターをインキュベーターに移し、ポンプを始動します。培地を10〜15分間流して、すべての葉が膨らみ、肺が良好な状態にあることを確認します。

転移モデルについて、無細胞または細胞性肺の足場を次のように変更します。吊り下げ式肺足場でバイオリアクターキャップを開き、ルアーロックシリンジを使用して5ミリリットルの培地を気管に通します。角鉗子を使用して、分岐点で2-0シルクを気管に通します。

分岐点で右肺に向かう気管を結び、培地を通って気管を通って左肺への培地の自由な流れを確認します。A549やH1299などの肺がん細胞を、RPMI 1640完全培養培地に1ミリリットルあたり200万〜300万細胞の濃度で調製します。気管カニューレの上に20ミリリットルのルアーロックシリンジをセットし、シリンジに15ミリリットルの細胞を追加します。

細胞懸濁液が重力によって肺葉を通過するのを待ちます。気泡が通過する前に、残りのセルを追加します。播種したら、シリンジを取り外して15分間待ってから、バイオリアクターに新しい培地を追加します。

それをインキュベーターに戻し、気泡を取り除いた後、毎分6ミリリットルで肺足場を灌流します。無傷の肺の組織病理学は、肺胞と肺細胞を示しています。ここで見られるように、脱細胞化は肺細胞の完全な除去につながり、無細胞肺の組織病理学は無傷の基底膜を明らかにします。

Movatのペンタクロームとエラスチンの脱細胞化肺の染色は、コラーゲン、フィブリン、エラスチンの存在を明らかにし、血管系と気管支は無傷です。脱細胞化肺のDNA分析は、DNA含有量の99%以上の減少を示しています無細胞肺は、細胞培養のためのバイオリアクターで直接使用することができます。組織学的解析により、腫瘍増殖の存在が示されています。

この手順を試みるときは、心臓の右心室にヘパリンを注入することを覚えておくことが重要です。この開発後、この技術は、がん研究の分野の研究者が肺がんの腫瘍細胞の転移につながる遺伝的およびエピジェネティックな変化を探求する道を開きました。