単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化
2018年8月18日
Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.
この方法は、アポトーシス細胞の取り込みを媒介するシグナル伝達分子の役割など、エフェロサイトーシス分野における重要な疑問に答えるために使用できます。この手法の主な利点は、他の方法では必ずしも明らかではない部分的または断片的なアポトーシス細胞の取り込みを含む、アポトーシス細胞の取り込みを明確に定量化できることです。この方法は、免疫細胞によるエフェロサイトーシスに関する洞察を得ることができますが、上皮細胞やがん細胞などの他の細胞タイプにも適用できます。
一般に、この方法に不慣れな人は、顕微鏡の取得設定を最適化するのが難しいため、苦労します。ヒトマクロファージとアポトーシスJurkat細胞を調製した後、血球計算盤を使用してアポトーシス細胞をカウントします。次に、十分な量のアポトーシス細胞を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
Jurkat細胞を500倍gの遠心分離により5分間ペレット化します。次に、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。Jurkat細胞が遠心分離機にある間に、10マイクロリットルのDMSOを新しい微量遠心チューブに分注します。
次に、最小限の量のNHS-ビオチンをDMSOに溶解します。この後、500マイクロリットルのアポトーシス細胞とPBS懸濁液をDMSOおよびNHS-ビオチンを含むチューブに移します。次に、製造元の指示に従って適切な細胞追跡色素を希釈します。
細胞懸濁液を室温で暗所で20分間インキュベートします。次に、同量のRPMI 1640を10%FBSと添加し、懸濁液を室温の暗所でさらに5分間インキュベートします。この後、500 g の遠心分離により細胞を 5 分間ペレット
化します。次に、上清を廃棄し、染色した細胞を100マイクロリットルのRPMI 1640に10%FBSで再懸濁します。100マイクロリットルの染色細胞懸濁液をマクロファージの各ウェルに滴下します。その後、プレートを200倍gで1分間遠心分離します。
プレートを摂氏37度で5%CO2と組織培養インキュベーターでインキュベートします。適切なインキュベーション期間の後、インキュベーターから細胞を取り出します。次に、1ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄します。
この後、希釈したFITC標識ストレプトアビジンを各ウェルに加えます。そして、プレートを暗闇で20分間インキュベートします。細胞を1ミリリットルのPBSで3回洗浄し、各すすぎ後5分間サンプルを静かに振とうします。
次に、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで室温で20分間固定します。細胞をPBSで一度すすぎ、余分なPFAを取り除きます。イメージングスライドにカバースリップを取り付け、スライドを蛍光顕微鏡に移します。
定量化に十分な数の細胞のZスタックを捕捉します。包み込まれたすべてのアポトーシス物質が検出されるように、前記セクション間の距離を設定することが重要です。上記のセクション間の最大距離は、対物レンズの焦点深度(通常は0.5〜1マイクロメートル)を超えてはなりません。
インポート機能を使用して、Z スタックの 1 つをソフトウェアにロードします。次に、「Set Measurements」パネルで測定オプションとして「Integrated density」を選択します。分析は、ストレプトアビジンと細胞追跡色素の両方のチャネルがオーバーレイとして表示されている場合に最も簡単に実行できます。
円周のどこかにストレプトアビジンが染色されている物体は、ストレプトアビジン陽性と見なすべきであり、したがって、ストレプトアビジン陰性として定量化すべきではありません。画像が読み込まれたら、ストレプトアビジンとフリーハンド、またはポリゴン選択ツールを使用して、Zスタックの1つの平面にあるすべての細胞追跡色素陽性ストレプトアビジン陰性材料を丸で囲みます。次に、その領域における細胞追跡色素の積分強度を測定します。
同じZセクションで、ストレプトアビジン染色を使用し、フリーハンドまたはポリゴン選択ツールを使用して、細胞追跡色素陽性ストレプトアビジン陽性材料のすべてを丸で囲みます。最後に、この領域の積分強度を測定します。この手順を使用して、スタウロスポリンで処理されたJurkat細胞の95%以上がアポトーシスを経験しました。
ほとんどの実験では、エフェロサイト化されるアポトーシス細胞の割合は、時間依存的に増加しました。このプロトコールを異なるエフェロサイト細胞タイプ、または異なるアポトーシス細胞ターゲットに最適化する場合、アポトーシス細胞とエフェローサイト細胞の比率の範囲をテストすることが重要です。通常、10対1または30対1の比率が最適です。
この手順は、シグナル伝達分子の活性化、またはエフェロサイトーシス細胞内で蛍光レポーター遺伝子を発現させることによる細胞内輸送を追跡するために簡単に変更できるため、エフェロサイトーシス中にこれらのプロセスをイメージングすることができます。
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概要
本記事では、アポトーシス細胞を食細胞が除去するプロセスであるエフェロサイトーシスを定量化するための蛍光顕微鏡プロトコルを紹介します。この手法により、エフェロサイトーシスのシグナル伝達経路の評価が可能となり、アポトーシス細胞の取り込みを明確に定量化できます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- エフェロサイトーシスは、細胞の恒常性を維持するために不可欠です。
- これは、食細胞によるアポトーシス細胞の認識および内部取り込みを伴います。
- エフェロサイトーシスのメカニズムを解明することで、さまざまな疾患に関する知見を得ることができます。
- 本手法は、免疫細胞やがん細胞を含む、異なる細胞種に適用可能です。
研究目的
- 免疫細胞によるアポトーシス細胞の取り込み量を定量化する。
- エフェロサイトーシスにおけるシグナル伝達分子の役割を調査する。
- さまざまな細胞型におけるエフェロサイトーシスを研究するための信頼性の高い手法を提供する。
使用した手法
- ヒトマクロファージおよびアポトーシスJurkat細胞の調製。
- 血球計数器を用いたアポトーシス細胞の計数。
- 可視化および定量のための蛍光顕微鏡観察。
- 正確な結果を得るための顕微鏡撮影条件の最適化。
主な結果
- 本手法により、アポトーシス細胞の取り込み量を明確に定量化することが可能です。
- アポトーシス細胞の部分的な取り込みや断片的な取り込みを評価できます。
- このアプローチを通じて、エフェロサイトーシスのメカニズムに関する知見を得ることができます。
- 本技術は、免疫細胞以外のさまざまな細胞型にも適用可能です。
結論
- この蛍光顕微鏡プロトコルは、エフェロサイトーシスの理解を深めるものです。
- 細胞死およびその除去を研究する研究者にとって、有用なツールとなります。
- 今後の応用として、細胞間相互作用に関わる他の研究分野への展開が期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
単一細胞蛍光顕微鏡法によるエフェロサイトーシスの定量評価は、創薬段階の免疫学および腫瘍学研究において、アポトーシス細胞の取り込みの精密な測定とシグナル伝達経路の解析という重要なニーズに応えるものです。この二重標識アプローチにより、細胞内に取り込まれたアポトーシス物質と細胞表面に結合した物質を正確に識別することが可能となり、メカニズムのリスク低減とターゲットの検証を支援します。本手法は、初期探索および前臨床モデル開発における重要な転換点において、予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- エフェロサイトーシス経路に関わる治療仮説の厳密な検証が可能になります。
- アポトーシス細胞の除去を制御するターゲットの機能的バリデーションをサポートします。
- 部分的および完全なエフェロサイトーシスイベントを定量化することで、メカニズム的なリスク低減を促進します。
- 免疫細胞およびがん細胞のコンテキストにおけるポートフォリオ選別への予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- エフェロサイトーシス調節因子の後続スクリーニングに向けた、検証済み細胞システムを調製します。
- 内部に取り込まれたターゲットと取り込まれていないターゲットを区別し、再現性のある定量的な出力を提供します。
- 化合物評価のためのアッセイの標準化とスケーラビリティを可能にします。
- 多様なエフェロサイトーシス細胞種およびターゲットにおけるプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 免疫細胞、上皮細胞、およびがん細胞におけるエフェロサイトーシスの定量化を可能にすることで、疾患関連モデルとの整合性を確保します。
- エフェロサイトーシス調節剤の発見から前臨床検証までの継続的な評価を提供します。
- 細胞レベルのリードアウトをトランスレーショナルなエンドポイントに結びつけることで、リスクを調整した進展判断をサポートします。
- アポトーシス細胞の除去を標的とする治療戦略に対し、予測的なリスク低減を実現します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このデュアルラベル蛍光顕微鏡法は、発見から前臨床に至る連続的なプロセスに組み込まれ、エフェロサイトーシスの仮説検証、アッセイ開発、およびトランスレーショナルリサーチを支援します。
- 基盤生物学研究： エフェロサイトーシスの活性とシグナリングを定量化し、パスウェイの役割と生物学的メカニズムを解明します。
- スクリーニング： アッセイの適格性と再現性について、堅牢で定量的なリードアウトを提供します。
- 分析： 結合したアポトーシス物質と内部に取り込まれた物質の測定を可能にし、比較分析を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ： 多様な細胞種での研究をサポートすることで、基礎研究の知見を前臨床モデルへと繋げます。
- 企業における再利用： R&Dプログラム全体でエフェロサイトーシスの定量化に利用できる、柔軟で適応性の高いプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エフェロサイトーシス研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：定量を標準化し、再現性を向上させ、拡張可能なワークフローをサポートする。
- 戦略的価値：堅牢な生物学的データを提供することで、go/no-go判断の質と資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいた、エフェロサイトーシス標的アセットの優先順位付けと推進を可能にする。
実施上の検討事項
- 蛍光顕微鏡法および画像解析の専門知識が必要です。
- 高品質なイメージング装置および解析ソフトウェアへのアクセスが求められます。
- 取得および定量化パラメータのチーム間での標準化が必要です。
- プロトコルの最適化により、さまざまなエフェロサイトーシス細胞およびアポトーシス細胞種に適応可能です。
- 再現性を確保するためには、細胞比率およびイメージング設定の最適化が不可欠です。
