Name: 感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 学ぶ高スループットカルシウム変化分析によるNMDA受容体の薬理学的研究法。HEK293細胞を用いてグリシンやグルタミン酸の結合サイトに対する拮抗薬効果を評価し、神経疾患治療薬開発への応用可能性を探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者は、郵便局バカロレア学者プログラムそしてノバルティス バイオメディカル研究本研究を資金調達のための全体として感謝したいと思います。

1. 細胞の調製
注: このプロトコルは、データの生成を含むエンコーディング NR1 と NR2A 細胞バキュロ ウイルスで導入した HEK293 細胞を使用します。
<ol><li>HEK293 細胞の適切な数をシードし、適切な最終濃度 (各 1.00 μ L) で NR1 および NR2A のウイルスを追加します。384 ウェル プレート 10,000 30 μ L の最終巻で細胞/ウェルを使用します。</li>
	<li>また、適切な細胞数と (384 ウェル プレート使用 10,000 細胞/ウェル 30 μ L の最終巻で) のためのボリュームで HEK293 NR1 NR2A 細胞をシードします。NR2A 式を誘導する化合物の保護を追加する 2 μ G/ml の濃度でテトラサイクリンを追加 (100 μ M MDL105、519 または 5 μ M CGP07066724)。</li>
	<li>注: エンコード NR1 と NR2 バキュロ ウイルス 5 x 109 - 10 x 109感染単位ミリリットル24間概算価が必要です。</li>
</ol>2. NMDA 受容体活性の測定
<ol><li>いずれかの保護化合物存在下での NR1/NR2 HEK293 NR1 NR2A セル増殖型 HEK293 細胞で 384 ウェル プレートを準備します。透明な底、黒フレーム、ポリ-D-リジン コーティング プレートを使用します。 注: 保護 100 μ m MDL105, 519 5 μ M 中のグリシンに感度を与えるため CGP070667 グルタミン酸感受性を付与するために使用します。</li>
	<li>16 時間 (夜間) 37 ° C および 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを削除し、優しくプレートをひっくり返す互換性存在コンテナーを遅くことによって携帯メディアを破棄します。プレートの端から媒体をきれいにし、残りのメディアをドレイン紙タオルの上にプレートを軽くたたきます。</li>
	<li>Calcium6 色素 (1 プレート サイズ) の 1 つのバイアルを可でインキュベーション バッファー (HBSS pH 7.5、20 mM HEPES、1 mM MgCl2、1 mM プロベネシド) 10 mL に calcium6 染料を準備します。プレートを 37 ° C、5% CO2で 2 時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーターからプレートを削除し、10 分間部屋の温度に調整する細胞。</li>
	<li>優しく 2.3 の手順で説明されているように calcium6 染料を注ぐ、アッセイバッファー (HBSS pH 7.5、20 mM HEPES、CaCl2、1.8 mM 1 mM プロベネシド) の 30 μ L を追加します。</li>
	<li>3 洗浄の合計のために二度 2.6 手順を繰り返します。最後の洗浄後、セルにアッセイバッファーの 30 μ L を残します。</li>
	<li>室温で 5 分間、残りの細胞ができます。</li>
	<li>400 μ M のグリシンと 400 μ M グルタミン酸 (最終濃度 100 μ m; 下記のとおり決定する配位子の最適濃度) の 4 倍在庫することによって配位子板を準備します。V 底 384 ウェル プレートにリガンド株式の 25 μ L の最小値を転送します。</li>
	<li>フリーダイヤル (機能薬物スクリーニング システム) にリガンド板とセル板を読み込みます。</li>
	<li>30 秒間セル板のベースライン蛍光 (Fo) を測定します。5 分間 calcium6 色素蛍光を記録することによってフリーダイヤル調剤機能と測定カルシウム フラックスを使用して細胞板にリガンド株式の 10 μ L を転送します。</li>
	<li>最大蛍光比を計算する、ベースラインの蛍光 (F最大/Fo) によって得られる最大の蛍光を割る。</li>
</ol>3. NMDAR 発現レベルの最適化
<ol><li>使用するバキュロ ウイルスの量を調べるには、滴定、NR1 および NR2A のウイルスを実行します。HEK293 細胞 (10,000 細胞/ウェルの推薦、メディアの 30 μ L) で 384 ウェル プレートを準備し、手順 2.1 保護化合物が含まれます。</li>
	<li>プレートの異なる行の NR1 ウイルスの様々 な量を追加 (例: 行 A E 0 μ L、2 μ、1 μ L、0.5 μ L、0.25 μ L をそれぞれ追加)。データの正確性の重複を追加します。</li>
	<li>プレートの別の列に NR2A ウイルスの様々 な量を追加 (例: 行 A E 0 μ L、2 μ、1 μ L、0.5 μ L、0.25 μ L をそれぞれ追加)。データの正確性の重複を追加します。</li>
	<li>16 時間 (夜間) 37 ° C および 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>フリーダイヤル (上記参照) にカルシウム フラックス測定を実行することによって、最適な比率と NR1 および NR2A のウイルスの量を決定します。</li>
</ol>4. 配位子の滴定
<ol><li>2.3 の手順で説明するように、セルを準備します。</li>
	<li>4 倍原液として他の配位子の飽和濃度 (100 μ M) の存在下でそれぞれの ligand の希釈液を準備します。たとえば: グリシン最終試験濃度 10 μ M、40 μ M の原液 400 μ M グルタミン酸を含むグリシンの準備します。</li>
	<li>フリーダイヤル測定 2.11 の手順で説明するように進みます。</li>
</ol>5. 複合試験
<ol><li>手順 1 で説明したように、セルを準備します。</li>
	<li>アッセイ バッファーに最終的なリガンド濃度の 5-fold 株式を持つリガンド プレートを準備します。</li>
	<li>アッセイ バッファーにおける化合物の所望の最終濃度の 4 倍の株式を持つ化合物のプレートを準備します。最終的な化合物の濃度、アッセイバッファーで 10 μ m、40 μ M の原液を準備します。<ol>
<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) の濃度を一定に保つすべてのサンプル測定バッファーにさらに希薄化前に、の DMSO の化合物の前希釈を準備することによって。</li>
		<li>3 と 30 μ M の間で及ぶ最終試金の化合物の線量応答を 1 から 10 の mM まで及ぶ DMSO の化合物の前希釈を準備します。4 倍のストック濃度にアッセイバッファーで希釈します。DMSO の最終濃度 0.5% を超えてはなりません。 注: トリプリケートで各サンプルをテストすることをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フリーダイヤルにリガンド、化合物、及び細胞板を読み込みます。</li>
	<li>30 秒のベースライン蛍光を測定します。</li>
	<li>化合物の在庫の 10 μ L を追加し、5 分の蛍光を測定します。</li>
	<li>リガンド株式の 10 μ L を追加し、5 分の蛍光を測定します。</li>
	<li>蛍光比の積分を測定の最後の 5 分間蛍光比の曲線下面積を計算することによって決定します。 注: また、蛍光リガンド添加後の最大比使用できます分析のため。</li>
</ol>

<ol><li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%3A+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li>
<li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional%2C+lifespan+and+systems+vulnerability+view%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li>
<li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li>
<li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li>
<li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li>
<li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+subunit+diversity%3A+impact+on+receptor+properties%2C+synaptic+plasticity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383(2013).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+receptor+composition%3A+many+regulators%2C+many+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition%3A+limitations+of+the+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li>
<li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors%3A+mechanisms+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li>
<li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPARs+and+synaptic+plasticity%3A+the+last+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li>
<li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li>
<li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+block+by+Mg2%2B+of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li>
<li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li>
<li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li>
<li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases%3A+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li>
<li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li>
<li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li>
<li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A%2C+R1-2B%2C+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li>
<li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+and+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine%2FD-serine%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608(2017).</li>
<li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li>
<li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A%2F2A%2C+rather+than+1A%2F2B+receptor+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li>
<li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors%3A+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li>
<li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li>
</ol>

著者があるない利益相反とは何を開示します。

この試金の成功は、使用される HEK 細胞の状態によって大きく異なります。細胞の急激な増加を受けて、低通過数を使用する必要があります。このアッセイ多く転送と警告を使用して、ソリューションの追加はその結果で高い精度を確保します。化合物およびその他のすべての試薬の濃度は、エラーを最小限に抑えるためにクロス チェックもする必要があります。アッセイバッファー カルシウム フラックスの試金のための携帯メディアを交換する際、セルを切断しないでください、プレートが優しく傾斜する必要があります。最後に、このプロトコルではポリ-D-リジン コーティング プレートの使用セルのプレートに添付ファイルが増加します。
NMDAR の表現の違い、ウイルスの伝達の時に通路番号と HEK293 細胞の適性に応じてサブユニット式に必要な量の可能性があります。また、バキュロは 6 ヶ月から 1 年まで短い貯蔵寿命を持ちます。したがって、ウイルスの品質は、この試金のための重要なパラメーターです。標準蛍光抗体法は、検出および表現のレベルとさらに実験24前に NMDAR のユ...

医学の現在の進歩、平均寿命が大幅に増加します。しかし、加齢に伴う疾患の有病率がのであります。中枢神経系 (CNS)、他の中で、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 統合失調症などの疾患は例外ではありません、次の十年1,で増加する予測されています。2,3N メチル D アスパラギン酸塩の受容器 (NMDAR) として知られているイオン型グルタミン酸受容体の機能不全は、アルツハイマー病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中、糖尿病、緑内障等保証のにリンクされている、。効果的な疾患修飾療法4,5,6、7の開発のための生物を勉強する必要があります。
NMDARs は、4 つのモノマーまたはサブユニット4,8,9で構成されます。NMDAR の構造は、脳7,10内の発達と地域の変動を示しています。NMDARs は、シナプス可塑性と認知及び呼吸と歩行11,12,13のリズムの生成に関与しています。電位依存性チャネルとしてそれは、安静時の膜電位伝導非主 (-70 mV) し、さらにイオンの透過を防ぐためにマグネシウムによってブロックします。2 配位子、グルタミン酸およびグリシン/D-セリン、バインドによってチャネルがアクティブになるし、シナプス膜に同時脱分極は AMPA 受容体、イオン型グルタミン酸受容体の別のサブクラスによって仲介されます。分極防止作用は、特にカルシウム14,,1516陽イオンの流入を有効にする、NMDAR のマグネシウム閉塞を削除します。にもかかわらず NMDAR の活性化は細胞の生存に不可欠な過剰な活性化は細胞死17,18,19応需型につながります。これは、受容体の複雑な性質に加えて難しく研究を実施する効果的な治療法を開発するために必要です。
別の方法は、NMDAR の研究に開発されています。ただし、それぞれの注意事項が付属しています。たとえば、1 つの広く使われている技術は安定したセルライン テトラサイクリン誘導性プロモーター (テトの)20の制御の下での細胞内カルシウム NMDAR 依存性の変化を測定する蛍光ベースの試金であります。ただし、このシステムに必要な配位子の激濃度と NMDAR の阻害剤が測定中に存在している要件不可能になります競争力の拮抗筋の活動を検出します。他の同様のシステムは、機能的受容体の発現は、ケタミン21,22細胞培養を維持するなどの拮抗を必要とする毒性を引き起こします。これらのチャネルのブロッカーは、受容体のコアに座るし、受容体の機能解析と干渉すること特にプレート ベースの形式で、洗いにくい。最後に、パッチなどの電気生理学的計測、スループットの制限があるし、大規模な研究は、非常に高価な23。にもかかわらず、上記のシステムはグリシンの刺激に敏感したがって、課題となる、NMDAR のグリシン依存性活性を勉強します。
ここでは、議論の制限を克服 NMDAR の勉強への新しいアプローチについて述べる。バキュロ ウイルス発現系としてはほとんど 16 時間で受容体のサブユニットの最適比の機能レベルを表現する技術を使用します。さらに、バキュロ ウイルスの使用によりシンプルかつコンビナトリアル アプローチは、異なる組換え NMDAR のサブタイプの広範な評価を提供します。他のアッセイとは異なり、このプロトコルには弱いアンタゴニストの使用のためチャネル遮断薬は必要ありません。メソッドの最も強い利点は弱い拮抗薬の後のウォッシュ アウトはグリシン/D-セリン、グルタミン酸の両方のデュアルの変調に加えて個々 グリシンとグルタミン酸結合部位の変調に敏感で受容体リガンド結合サイト。試金は NMDAR 受容体の既知の薬理学とその既知の正と負の変調器の効果を繰り返します。最後に、この生体外細胞アッセイの生成過剰なカルシウムの流入によって引き起こされる細胞毒性を克服でき、NMDAR の変調器の発見を加速することができます高スループット方法で受容体の機能解析病にある州。

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>ヒトNMDA(NR1/NR2A)受容体細胞株</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Dual Expression Vector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td><td>Molecularデバイス</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-セリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>ボストン バイオ プロダクト</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>プロベネシド・</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX 培地</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>・サイ</td>エンティフィック 10565018 <td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>社内合成</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>CGP070667</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIBR</td><td>ハウス</td><td></td>で合成</tr></tbody></table>

感受性グリシン/d-セリン、グルタミン酸と nmda 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N メチル D アスパラギン酸 (NMDA) 受容体 (NMDAR) はグルタミン酸に分類され、学習と記憶に重要な役割を持っています。表現としてどちらかに- または下-activity の突然変異、発現、人身売買、またはローカリゼーションによる NMDAR の故障は、中枢神経系を中心に、多数の病気に貢献できます。したがって、化合物と低分子化合物の探索を促進することと同様、受容体の生物学を理解することは、神経疾患と闘うための継続的な努力で重要です。現在の受容体の勉強方法低スループット、高コスト NMDAR 仲介された毒性を防ぐためにチャネル遮断薬の必要な存在のためにその機能能力を研究することができないなどの制限があります。また、既存のアッセイ系のみグルタミン酸による刺激に敏感である、グリシン、NMDAR の他の共同のリガンドによる刺激に対する感受性を欠いています。両方共配位子、グルタミン酸や D セリン ・ グリシンへの感受性と NMDA 受容体を研究する高スループット力と最初のプレート ベースのアッセイを紹介します。このアプローチ様々 な NMDAR サブユニット組成の研究でき、受容体の機能解析グリシンやグルタミン酸に敏感なモードで。また、メソッドでは、測定中の阻害剤の存在は必要がないです。正と負のアロステリック変調器の効果は、このアッセイで検出できるし、NMDAR の既知の薬理学は、私たちのシステムにレプリケートされています。この手法は既存の方法の限界を克服、経済的であります。この手法は NMDAR を介した病態の治療の発見を加速すると考えています。

小分子の効果をテストする前に、1 つは NMDARs として最適なリガンド濃度の最適な発現レベルを定めなければなりません。前述、HEK293 細胞/ウェルの 384 ウェル プレートで 10,000 細胞播種 5 μ M の存在下で CGP060667、その後導入 NR1 と NR2A の変化量とウイルス。孵化翌日、リガンド誘導性カルシウム後フラックスを測定した (図 1)。これらの実験の結果では、最高の量とそれぞれのサブユニット (図 1、黄色のボックス) を使用するウイルスの比を明らかにします。
最適量および NR2A の NR1 と伝達の比率が決定されると、配位子の滴定を行った NMDARs の活性化のための最適なリガンド濃度を決定します。これを達成するために共同配位子の 1 つ追加されましたでさまざまな濃度の固定、その他の共同...

このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR) の研究と、低分子化合物の変調作用の検討と治療への応用です。

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

この方法は、神経疾患を治療するためのNMDAモジュレーターの発見に役立ちます。この技術の主な利点は、化合物中の防御濃度またはリガンドの組み合わせに応答して、NMDA受容体活性のフィッサム研究を可能にすることです。したがって、この方法は、NMDA受容体の一般的な機能についての洞察を提供することができます。また、リガンドや化合物に応答した生物学やNMDA受容体の感度に特異的なサブタイプの研究にも適用できます。NMDA受容体の活性を測定するには、HEK 293細胞を添加した384ウェルプレートを調製し、保護化合物の存在下でNR1、NR2、またはHEK 293、NR1、NR2A細胞を形質導入します。次に、プレートを摂氏37度でインキュベートし、二酸化炭素5%で16時間インキュベートします。翌日、インキュベーターからプレートを取り出し、プレートを互換性のあるバイオ廃棄物容器の上にゆっくりとひっくり返して、細胞培地を静かに廃棄します。プレートをペーパータオルで軽くたたいて、プレートの端からメディアを取り除き、残っているメディアを排出します。続いて、カルシウム6色素の1バイアルを10ミリリットルのインキュベーションバッファーに可溶化することにより、カルシウム6色素を調製する。384ウェルプレートの細胞に30マイクロリットルの色素を加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で2時間インキュベートします。2時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を室温に10分間調整します。次に、カルシウム6色素を静かに注ぎ出し、30マイクロリットルのアッセイバッファーを加えます。洗浄を合計3回繰り返し、最後の洗浄後、細胞に30マイクロリットルのアッセイバッファーを残します。その後、細胞を室温で5分間休ませます。リガンドプレートを調製するには、400マイクロモルのグリシンと400マイクロモルのグルタミン酸の4倍ストックを作成します。最低25マイクロリットルのリガンドストックをVボトム384ウェルプレートに移します。次に、リガンドプレートとセルプレートをFDSSに移します。その後、細胞プレートのベースライン蛍光を30秒間測定します。FDSS分注機能を使用して、10マイクロリットルのリガンドストックを細胞プレートに移し、カルシウム6色素の蛍光を5分間記録してカルシウムフラックスを測定します。その後、得られた最大蛍光をベースライン蛍光で割ることにより、最大蛍光比を計算します。化合物を試験するには、細胞、リガンド、および化合物プレートを調製します。リガンド、化合物、および細胞プレートをFDSSにロードします。次に、ベースライン蛍光を30秒間測定します。10マイクロリットルのコンパウンドストックを加え、蛍光を5分間測定します。次に、10マイクロリットルのリガンドストックを添加し、蛍光を5

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、FlexStation 3を用いて、ヒトTRPA1チャネルの薬理学的特性を研究するための詳細なプロトコルを提供します。プロトコルは、細胞調製、染料ロードとマイクロプレートリーダー、FlexStation...

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。...

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。...

一チャネルセル付パッチクランプ法

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。...

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

神経細胞の興奮は、遠藤の動的過程と興奮性イオン型グルタミン酸受容体の開口放出を変調することができます。表面と内部の受容体人口プールを定量化するためのアクセス可能な高アッセイは、ここで説明しました。...

AMPA の監視用高コンテンツ受容体トラフィッ キング

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+...

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、...

組換えGタンパク質共役型受容体のハイスループットスクリーニングのための「二重付加」カルシウム蛍光アッセイ

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

学ぶ高スループットカルシウム変化分析によるNMDA受容体の薬理学的研究法。HEK293細胞を用いてグリシンやグルタミン酸の結合サイトに対する拮抗薬効果を評価し、神経疾患治療薬開発への応用可能性を探索する。

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析

さらに動画を探す

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

さらに動画を探す

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループットカルシウム変化分析