Name: 力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた力の単一分子分光法のための蛋白質共有結合固定法。シランカップリング剤でシリコン酸化物表面にRrgAなどの蛋白質を固定し、フィブロネクチンとの相互作用を測定する。

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TB と HG 欧州研究評議会「Cellufuel、高度なグラント号 294438」を通じて支援を認めます。HCS は、Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt) を通じて教育研究のための中央政府大臣から財政支援を認めている SS が金融認めているバイエルン州省から科学と教育のためのサポートによって研究の焦点「Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe - キャンター」。テクニカル サポート、コニー Hasselberg クリストフとマルチナ Hörig に感謝します。

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SMF 原子間力顕微鏡の導入以来、直接プローブ内および個々 の蛋白質、核酸、その他生体分子3,4、5の分子間力に広く使われている手法に進化しました。SMF 実験に成功、適切なサーフェス結合戦略が必須です。天然および合成高分子の分子内力を調べるため、基板表面と AFM 先端36,38,39,40,41にポリマーを直接に結合可能性があります。分子の結合などの分子間相互作用の調査のために、しかし、それは AFM チップに相互作用パートナーを接続する適用範囲が広いリンカー分子ヘテロ二官能性 PEG リンカーまたはポリペプチド鎖などを使用することをお勧めし短距離の表面力を克服するために、変性や変性タンパク質21,22,23、ように結合パートナーの正しい向きを可能にするために、基板表面 24,25,26,27,42。我々 したがって、ヘテロ二官能性 PEG スペーサーを使用して自分のアクセスの第一級アミン蛋白質を介して共有結合固定化のためのシンプルでまっすぐ進むプロトコルを説明します。
適用性を示した我々 の相互作用の調査の双球菌肺炎球菌感染から RrgA と細胞外マトリックス蛋白 Fn の力として最近で詳しく説明他13。
表面の化学がよく確立され、分析と同様のアプローチは、複数の SMF 実験19,42,43,44,45で正常に使用されています。表面にシラン高分子を結合の使用 silylether は、加水分解が適用されます。加水分解の程度は、シリル化プロセス中に制御することができます形成されたシロキサン結合の量に依存します。高い相互作用力 (≥ 1000 pN) は、SMF の測定中に期待されて、シリル化は実行を介して気相蒸着30シロキサンの連続的な層の形成の結果をする必要があります。多くの実験 (例えば、多くのタンパク質-タンパク質相互作用) の相互作用力は数百の pN と記述されていたプロシージャ、するシロキサンの形成を液相からの蒸着法による実施し、非連結の範囲で有機シランは思慮深く熱 (ステップ 1.1.8) と硬化後のエタノール (ステップ 1.1.7) で洗い落とし、充分です。
もう一つの重要なステップです残りの EDC を洗うし、NHS 分子表面 (ステップ 1.2.3) をオフは、残り物は、蛋白質のカルボキシル基の活性化につながるよう。これは、その機能を変えることができる同一の表面タンパク質の架橋結合のどちらかの結果を可能性があります。 またはカップルが反対側の面の他の蛋白質に蛋白質を活性化しました。これは表面とドメイン展開を伴う可能性が高い破断力による AFM の先端の間の蛋白質のクランプにつながる可能性があります (図 3 b1、4、5 のトレースを参照してください Fn ドメインの展開)46。PEG スペーサーのアクティブな NHS エステル不飽和に残っている場合、同じ問題が発生することができます。したがって、トリス緩衝生理食塩水で孵化は推奨 (ステップ 1.2.6)、トリスの第一級アミンを消光残りアミノ反応性として。
シラン処理ガラスの Fn の均一な分布につながる段階のプロトコルに従う (図 2を参照)、表面蛋白質の二量体の形を残してします。これは溶液中の Fn´s の構造のような他サンプル表面37前の原子間力顕微鏡データと一致します。さらに、AFM の先端に RrgA の適切な濃度は、SMF の測定 (図 3および図 4) 中の明確な相互作用イベント 〜 20% のターゲット値を生成するに取得されます。タンパク質濃度および/またはインキュベーション時間を変化させる以外にもサンプル基板、カンチレバーの先端に結合分子の量を制御する別のエレガントな方法は、異なるセカンダリ官能基をもつシラン剤の組み合わせです。PEG ・ ポリマーから伸びる蛋白質反応基の割合を変更すると、固定された蛋白質の数は制御15,16,17,18をすることができます。
ここで説明されているプロトコルは、他 -NH2含む分子を固定化したり、ガラスとシリコン窒化以外にも他のシリコン酸化膜の表面にいくつか蛋白質を調整するも使用できます。タンパク質の設計によってアミン反応性のカルボキシル基に変更できますスルフヒ反応グループ (例えば、マレイミドまたはオルソ ピリジル二硫化)を介してタンパク質カップルにその無料-SH グループ。Fn、この定義済みの方向の13,17,20になります。
要約すると、このプロトコルはさまざまな要件を提供するために調整することができます、単一分子力分光実験以外にも他の生物物理アプリケーションに適しています。

光と磁気ピンセットの横に原子間力顕微鏡 (AFM)1,2分析および分子を操作する便利なツールとして浮上しているし、プローブのプロパティおよび関数、外部力3 への対応を含む ,4。対照的に酵素結合抗体法 (elisa 法) のような方法は、表面プラズモン共鳴 (SPR) または水晶発振子マイクロ バランス (QCM) セットアップは、原子間力顕微鏡により分子 (SMF)5単一セルのレベル (SCFS)6 上の相互作用を測定するには.これらの技術をもたらした Fn黄色ブドウ球菌結合タンパク質で形成されたエシェリヒア属大腸菌線毛の蛋白がマンノース7、またはタンデム β ジッパーと FimH を繰り返すの相互作用の発見キャッチ債のようなバインド メカニズムに貴重な洞察力Fn8へのバインド時に。最近毛 1 付着性 RrgA9,10グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae)11からはフィブロネクチン12にバインドすることを示すことができましたその二つのターミナル ドメイン。これはタンデム β ジッパーとは異なりますし、毛肺炎球菌を形成し、一時的なフィブロネクチン含有の問い合わせ先ホスト面13を維持するを有効にする可能性があります新しい 2 ドメイン バインド メカニズムを明らかにしました。
SMF の実験の成功は、批判的に固体表面と原子間力顕微鏡のチップで生体分子の機能とネイティブの固定化に依存します。高い力に SMF 測定中に起こりうる、蛋白質は、できればにおいて、表面に共有に結合する必要があります。たくさんの異なる結合蛋白質と他の生体分子だけ (無機) 固体表面、ナノ粒子と文学14,15 に記載されているその他のデバイス上の全体のセルでの固定化法 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24、 25,26,27。これらのプロトコルは、多くの場合、有害物質の使用、実行および/または特別な装置 (例えば、プラズマ クリーナー) を必要とすることは困難です。カップル分子のガラスにする簡単な方法は、片側シラン反応グループと彼らの他の側にアミン反応性グループ ポリマー層が厚く heterobifunctional 塗料の硬化剤を添付することです。アプリケーションによっては、カップリング剤は例えば可変長の柔軟なハイドロ カーボン鎖を含めることができます。、ヒドロキソアルミニウム ポリエチレング リコール系 (PEG)。彼らは表面修飾した (例えば、疎水性、静電気とファン ・ デル ・ ワールス相互作用) の非特異的相互作用を抑制し、結合分子の回転自由度を提供することがあります。
ここでは、1 つまたは複数の自由なアミノ グループを含んでいる蛋白質の結合の結合のための一般的なプロトコルについて述べる (-NH2) ガラス表面し、窒化ケイ素原子間力顕微鏡のヒントを介してheterobifunctional エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基 (-COOH)。SMF の実験で、例示されている RrgA と Fn の細胞外マトリックス蛋白の相互作用に基づくこのプロトコルを使用することができます (概要については図 1を参照)。
最初のステップは、表面28,29,30,31のシリル化です。それは反応性の高い SiOH グループを形成するためにカップリング剤のエトキシ グループの加水分解を含みます。これらは、基板上 SiOH グループと反応できます。主凝縮でのステップは、これらの silanols の水素結合を形成し基板の上に広げ。(これは通常熱または水を削除する真空が必要) 二次縮合反応のシロキサン結合が形成されます。これは、結果、共有添付有機シラン。
2 番目の手順は、機能する蛋白質の結合 (-COOH) ポリマー32から拡張するグループ。まず、酸は確立された NHS/EDC を通して得られた反応性 N hydroxysuccinimid (NHS) エステル中間に変換されます (1-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 化学33求核置換反応を受けると最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成します。
このように RrgA はシリコン窒化 AFM チップとランダムな方向にガラス基板を人間の Fn を連結した、単一分子レベルでの相互作用力を行った。ガラス表面に Fn の均一な分布と先端、SMF の測定時に発生する相互作用の最大 20% のターゲット値で明らかに RrgA の濃度を適切に説明した表面化学をリードすることが分かった。この化学非特異の相互作用を低減、データ集録中に少し変更する場合は、したがって見事正確な SMF 実験に適しています。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %; 分析純度</td></tr><tr><td>二重蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&ge; 99.8 %; 分析純度</td></tr><tr><td>エトキシ シラン ポリエチレン グリコール酸</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa;COOH-PEG-Si(OC2H5)3</sub</td></tr><tr><td>>塩酸</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS; 合成用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 - Dulbecco</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>プローブ分子 e.g. フィブロネクチン、ヒト血漿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>プローブ分子 例えば RrgA</td><td></td><td></td><td>実験室で生産</td></tr><tr>ナトリウム<td>塩素酸</td><td>カール・ロス</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン</td><td>カール・ロス</td><td>AE15</td><td>&ge; 99,3 %;トリス;緩衝材 グレード</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス カッター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス スライド</td><td>カール ロス</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>不活性ガスデシケーター</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard SPM and DP software</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory oven</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Starrer</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロヘラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムM</td><td>ブランド</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>ニック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>スターラボ</td><td></td><td>10-100 & マイクロ;L、50-200 &micro;l, 100-1000&nbsp;&マイクロ;l</td></tr><tr><td>精密天びん</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>窒化ケイ素カンチレバー - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>ばね定数 &le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>超音波処理槽</td><td>バンデリン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色ジャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡 - ツァイス ステミ</td><td>ツァイス</td> 攪拌<td></td><td></td></tr><tr><td>バー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtechの科学精密は、</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twezzers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>水星スペクトルを254&nbsp;nm</td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ミキサーVWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>計量紙</td><td>カールロス</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

近年, 原子間力顕微鏡 (AFM) と単一分子力分光法 (SMF) の分子特性と機能の私達の理解を拡張しました。それは私たちに詳しくホストの表面の受容器にどのように細菌アドヘシン バインドなど、生物物理学的メカニズムの多様性を探索する機会を与えた。その他の要因の間で SMF 実験の成功は、固体表面と原子間力顕微鏡のチップで興味の分子の機能とネイティブの固定化に依存します。ここでは、順序でシラン ペグ carboxyls と定評の N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) 化学を用いたシリコン表面に蛋白質の共有カップリングの簡単なプロトコルについて述べる細胞外マトリックス蛋白質フィブロネクチン (Fn) グラム陽性菌の肺炎球菌(S. pneumoniae) から線毛 1 付着性 RrgA の相互作用を探索できます。ガラス表面に Fn の均一な分布と AFM カンチレバー先端、SMF の中に相互作用イベントの最大 20% のターゲット値によって明白に RrgA の適切な濃度に表面の機能化をリードすることが分かった測定 RrgA Fn に 52 pN の平均力と結合することを明らかにしました。プロトコルは、カップルのサイト経由で特定の無料チオール グループに調整できます。これは定義済みの蛋白質または分子配向の結果し、SMF のほか他の生物物理アプリケーションに適しています。

プロトコル説明ここで共有結合固定化によるタンパク質の結果ランダムな方向 (図 1) とアクセスの第一級アミンの類。図 2 (左) とシラン処理ガラス表面の AFM 像を示しています、窒素の穏やかな流れの下でサンプルの脱水後 (右) Fn が固定化せずに記録。約 10 nm 高 Fn 分子が明らか (図 2左)、高分子シラン表面修飾と Fn の約 2-5 nm (図 2右) 中の高さとだけ小さな表面よりを示しています。クローズ アップ、Fn の二量体の構造を確認できます。Fn 分子にペグの表面コーティングの上 4-5 nm の高さの長さとコンパクトに見える 〜 120 nm (の挿入を参照してください)。
Fn は、最近私たちのグループ13で詳細に説明したと RrgA の相互作用力を調査するには、RrgA シリコン窒化 AFM 探針とガラス基板 (図 3 a) に人間の Fn に結合されていました。図 3は、代表的な先端に 1 μ m s-1の引き抜き速度で記録された Fn をもつ RrgA との相互作用の分離曲線のサンプルを示します。使用される表面化低バック グラウンド操作とチェーン (eWLC) モデル (赤いカーブ) のような拡張性のあるワームを使用して装着された (図 3 a)、形の良い単一 (または二重) 相互作用イベントにつながった。まで AFM 探針と基板、ペグ リンカー (&gt; 70 nm) をストレッチと非特異的表面相互作用を克服した後は、フィット (破断力と - 長さ、図 4を参照) の結果をプロット力曲線の ~ 19% 示した破裂RrgA - Fn との相互作用の力の平均破裂イベント 〜 約 100 の tip サンプル距離で 52 pN nm。対照的に、適切でない表面化 (ここでは、生理食塩水図 3bをバッファリング トリスと省略された焼入) (トレース 2 と 3) をバインド複数タンパク質非特異的相互作用による単一の操作イベントの明確な評価の妨げになるおよび/またはタンパク質試料表面と原子間力顕微鏡のカンチレバー探針との間の共有カップリング。これは蛋白質 (Fn) の領域 (トレース 4 および 5) の展開を伴う可能性が高い破断力 (トレース 1) につながる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg"> 図 1: 表面の化学上の概要。エトキシ シラン-ペグ-カルボキシル基の加水分解は、シロキサン架橋の形成と水和からす表面の結露が続きます。EDC のカルボキシル基との反応は水溶液 (加水分解) の半減期が非常に短いとアミン反応性中間反応o- acylisourea の結果します。中間は最終的に蛋白質の第一級アミンとアミド結合を形成する求核置換反応を受ける NHS エステルの形成による安定化します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg"> 図 2: 固定ガラス基板を介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグにフィブロネクチンのカルボキシル基剤。機能性ガラスの AFM 像 (左) と表面し、(右) なし Fn. 数字は個々 の Fn 分子を基板の表面 (挿入) で均一に配られます。分子がペグの上 4-5 nm の高さの二量体でコンパクトな構造を採用するコーティングとの長さ &gt; 100 nm。これは、他のサーフェスは、雲母などの前の原子間力顕微鏡データを一貫性のあるソリューションで Fn の構造が似ている (インレイのスケール バー = 500 nm)37。AFM 下画像、AFM 画像に示されている線に沿って高さプロファイルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg"> 図 3: SMF 実験と代表のイラスト力 RrgA - Fn 相互作用の距離曲線。(a) RrgA と Fn された共有リンクを介してheterobifunctional エトキシ シラン ペグ AFM の窒化ケイ素にカルボキシル基カップリング剤カンチレバー探針とガラス表面、それぞれ。代表の SMF は、RrgA - RrgA と Fn の記述への固定化と 1 μ m s-1の収縮速度で Fn 相互作用の得られた曲線が表示される距離を強制します。赤いカーブは、破断荷重、長さを得るために適用する拡張可能なワームのようなチェーン フィットを表します。図は Becke、ら、ACSnano 201813から変更されています。(b) 代表の SMF は、生理食塩水 RrgA - tris バッファー焼入れなし Fn 相互作用の距離曲線を強制します。この場合、トリスの第一級アミンは欠席した NHS エステル不飽和実験中に残っていたので、残りのアクティブな。これはマルチ蛋白質 (トレース 2 と 3) をバインディングにつながったし、表面と高破断につながった AFM 先端間の蛋白質のクランプ力 (Fn-) を伴うドメイン展開 (トレース 1、4 および 5; 異なるスケールを注意してください)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg"> 図 4: 単一 RrgA - Fn 相互作用の力・長さ分布。破壊力と RrgA - Fn SMF の相互作用の測定から得られた対応する破断長ヒストグラム (n = 1400) 1 μ の-1の収縮速度で。ヒストグラムは、51.6 pN (ガウス適合、黒い線) の最もありそうな破壊力fMP破断長約 100 の蓄積を明らかにする nm。図は、らACSnano、2018年13Becke から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S. pneumoniae)フィブロネクチンと。

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

この方法は、タンパク質相互作用における単一のタンパク質の強度など、生物物理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまな生体分子を固定化するために使用できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、原子間力顕微鏡のカンチレバープローブの取り扱いと原子間力顕微鏡自体の操作が難しいため、苦労する可能性があります。まず、耐酸性手袋、安全ゴーグル、白衣を着用します。ドラフトの下では、糸くずの出ない精密ワイプにイソプロパノールを使用してください。いくつかのスライドガラスから粗いほこりや汚れを取り除きます。きれいなスライドを、二重蒸留水で希釈した塩酸で満たされたスタンディングジャーに移します。適切な蓋で瓶を密封し、室温で90分間超音波浴に入れます。次に、窒化ケイ素AFMカンチレバープローブを、先端が上を向くようにきれいなスライドガラスに移します。スライドを紫外線を通さないチャンバーに移し、上から紫外線を少なくとも90分間照射します。この後、染色ジャー内の塩酸を二重蒸留水と交換し、ガラス表面が乾かないように注意してください。瓶を蓋で密封し、さらに10分間超音波浴に戻します。その間、エトキシシランポリエチレングリコール酸をエタノールと二重蒸留水の混合物に溶解し、最終濃度0.1ミリグラム/ミリリットルにします。エタノールの蒸発を防ぐために、この溶液を密閉します。準備ができたら、シラン溶液を2つの別々のシャーレに注ぎます。きれいなスライドガラスを一方のシャーレに、カンチレバーをもう一方のシャーレに入れます。パラフィルムを使用して、エタノールが蒸発するのを防ぐために、両方のプレートを密閉します。固定プレートを室温で90分間インキュベートします。この後、純粋なエタノールを含む3つの連続したビーカーを使用して、カンチレバーとスライドガラスの両方を洗浄します。洗ったカンチレバーをきれいなスライドガラスの上に置きます。官能基化したスライドガラスを染色ジャーに移します。両方を摂氏110度のオーブンで30分間硬化させます。その後、シラン処理されたガラスサンプルとカンチレバーを真空デシケーターで最大1週間保管します。タンパク質の無作為な固定化を開始する準備ができたら、テキストプロトコルに概説されているように、標準的なリン酸緩衝生理食塩水にEDCとNHSを含む溶液を調製します。シランコーティングされたスライドガラスをこの溶液で覆います。シラン化カンチレバープローブをECD/NHS溶液の滴下に入れます。両方を室温で10分間インキュベートします。次に、カンチレバーとスライドの両方を3つの連続したビーカーで洗い流し、余分なEDC/NHSを完全に洗い流します。活性化したスライドガラスを、ウェットティッシュを備えたシャーレに移します。スライドガラスのEDC/NHS活性化領域に目的のタンパク質溶液の液滴を添加し、パラフィルムを使用してペトリ皿を密封し、プローブを室温でインキュベートします。湿ったティッシュを備えたカンチレバーボックスに目的のタンパク質溶液の液滴を追加します。次に、カンチレバープローブをPBSで完全に洗浄します。プローブをボックス内の液滴に入れ、ボックスを閉じます。プローブを室温でインキュベートします。この後、スライドガラスの裏側にあるタンパク質液滴の領域に印を付けます。スライドガラスとカンチレバープローブの両方を、PBSを充填した3つの連続したビーカーを使用して完全に洗浄します。洗浄したプローブをトリス緩衝生理食塩水の入った容器に室温で20分間入れます。次に、スライドガラスとカンチレバープローブをPBSで完全に洗浄します。使用する準備ができるまで、PBSで覆われた別々のペトリ皿に保管してください。洗浄したばかりのスライドガラスをAFMサンプルホルダーに固定し、PBSバッファーで覆います。次に、準備したカンチレバープローブをカンチレバーホルダーに固定し、AFMヘッドにセットします。カンチレバーをPBSバッファーの滴で慎重に濡らします。カンチレバーがPBSバッファーに完全に浸るまで、カンチレバーをキャリブレーション面に向かってゆっくりと動かしますが、それでもキャリブレーション面から離れます。トップビュー光学顕微鏡またはAFMの倒立顕微鏡を使用して、レーザーをカンチレバーの裏側に配置します。カンチレバーの端付近にレーザースポットを先端が位置する場所の近くに置き、反射レーザービームがフォトダイオードの中心に配置されるようにAFMの4象限検出器フォトダイオードの位置を調整します。次に、AFMソフトウェアでキャリブレーションマネージャーを開きます。カンチレバーの感度とスプリング定数のキャリブレーションを開始するには、基板表面に慎重に近づき、力距離曲線を記録します。先端が基板表面に接触している収縮力曲線の最も急な部分に直線をはめ込み、光学レバーの感度を決定します。カンチレバーをサンプル表面から引っ込め、表面から少なくとも100ミクロンのカンチレバーでいくつかの熱雑音スペクトルを記録し、AFMソフトウェアが提供する高調波発振器を熱雑音スペクトルに適合させて、カンチレバーのばね定数を決定します。この後、カンチレバーをゆっくりと引っ込めて、溶液から引き出します。カンチレバーのキャリブレーションに使用したガラス表面を取り外し、固定化されたタンパク質を含むサンプル表面と交換します。湿ったカンチレバーをゆっくりとサンプル表面に向かって動かし、カンチレバーがPBSバッファーで完全に覆われるまで、まだ基板表面から離れています。表面に近づき、250ピコニュートンの接触力、1秒の接触時間、2マイクロメートルの収縮長、1秒あたり1マイクロメートルの収縮速度で、サンプル表面上のさまざまな位置で複数の力距離曲線を記録します。データ処理ソフトウェアで、[フォーススキャンのバッチを開く]アイコンを選択して、測定されたフォースカーブファイルを開きます。「スプリング定数で感度を調整してVディフレクションを再校正する」アイコンを選択して、カンチレバーディフレクションを正比例の力に変換します。次に、[ベースライン減算]アイコンを選択して、サーフェスから遠いフォースカーブの領域にあるリトラクションチャネルのベースラインを減算し、フォースレベルをゼロに設定します。[Contact Point Determination]アイコンを選択して、チップがサンプルと接触するポイントを定義します。Tip Sample Separation(Tip Sample Separation)アイコンを選択して、高さ信号をTip Sample Separation(チップサンプル分離)に変換します。これにより、接触点の位置を差し引くだけでなく、カンチレバーの曲げを差し引いて、基板表面とAFMチップの間の距離を計算します。[Fit a Polymer Chain Model]アイコンを選択し、[Extensible Worm-like Chain]モデルを選択して、70ナノメートルを超える破断長で発生する力のピークの力距離トレースをスクリーニングします。非特異的な相互作用を選別し、選択したピークに拡張可能なワーム様連鎖モデルを適用します。この研究では、タンパク質は、アクセス可能な第一級アミンを介してランダムな配向で共有結合的に固定化されます。シラン化ポリマー層のAFMイメージは、約2ナノメートルから5ナノメートルの範囲の高さの小さな表面波形のみを示しています。しかし、フィブロネクチンで修飾された表面には、約10ナノメートルの高さのフィブロネクチン分子が存在することが確認されています。詳しく調べると、分子の二量体構造を認識できることが明らかになります。これらの分子は、PEG表面コーティングからの高さが4〜5ナノメートル、長さが約120ナノメートルと、コンパクトに見えます。次に、RRGAとフィブロネクチンとの相互作用力を調査します。1 秒あたり 1 ミクロンの極速度で記録された代表的なチップサンプル分離曲線では、バックグラウンド相互作用が低く、良好な形状の相互作用イベントが示され、拡張可能なワーム様チェーンモデルを使用してフィッティングされます。この適合の結果をプロットすると、PEGリンカーの伸張における非特異的な表面相互作用を克服した後、力曲線の最大19%で、RRGAフィブロネクチン相互作用の平均破裂力が52ピコネクトンで、先端サンプル距離が約100ナノメートルであることがわかります。この手順を試行する際には、接触時間や収縮速度などの設定によっては、単一分子力分光法データには複数の情報が含まれており、このプロトコルは完全なデータ解析への第一歩に過ぎないことを覚えておくことが重要です。この方法は、単一分子の相互作用に関する洞察を提供するだけでなく、単一細胞レベルでの相互作用の研究にも使用できます。この手順に続いて、シングルセルフォース分光法などの他の方法を実行して、全細胞がタンパク質被覆表面とどのように相互作用するかなどの追加の質問に答えることができます。酸や紫外線を扱う作業は非常に危険であり、この手順を実行するときは、耐酸性手袋やUV光不透過性チャンバーなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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