力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

この方法は、タンパク質相互作用における単一のタンパク質の強度など、生物物理学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、さまざまな生体分子を固定化するために使用できることです。一般に、この方法に不慣れな人は、原子間力顕微鏡のカンチレバープローブの取り扱いと原子間力顕微鏡自体の操作が難しいため、苦労する可能性があります。

まず、耐酸性手袋、安全ゴーグル、白衣を着用します。ドラフトの下では、糸くずの出ない精密ワイプにイソプロパノールを使用してください。いくつかのスライドガラスから粗いほこりや汚れを取り除きます。

きれいなスライドを、二重蒸留水で希釈した塩酸で満たされたスタンディングジャーに移します。適切な蓋で瓶を密封し、室温で90分間超音波浴に入れます。次に、窒化ケイ素AFMカンチレバープローブを、先端が上を向くようにきれいなスライドガラスに移します。

スライドを紫外線を通さないチャンバーに移し、上から紫外線を少なくとも90分間照射します。この後、染色ジャー内の塩酸を二重蒸留水と交換し、ガラス表面が乾かないように注意してください。瓶を蓋で密封し、さらに10分間超音波浴に戻します。

その間、エトキシシランポリエチレングリコール酸をエタノールと二重蒸留水の混合物に溶解し、最終濃度0.1ミリグラム/ミリリットルにします。エタノールの蒸発を防ぐために、この溶液を密閉します。準備ができたら、シラン溶液を2つの別々のシャーレに注ぎます。

きれいなスライドガラスを一方のシャーレに、カンチレバーをもう一方のシャーレに入れます。パラフィルムを使用して、エタノールが蒸発するのを防ぐために、両方のプレートを密閉します。固定プレートを室温で90分間インキュベートします。

この後、純粋なエタノールを含む3つの連続したビーカーを使用して、カンチレバーとスライドガラスの両方を洗浄します。洗ったカンチレバーをきれいなスライドガラスの上に置きます。官能基化したスライドガラスを染色ジャーに移します。

両方を摂氏110度のオーブンで30分間硬化させます。その後、シラン処理されたガラスサンプルとカンチレバーを真空デシケーターで最大1週間保管します。タンパク質の無作為な固定化を開始する準備ができたら、テキストプロトコルに概説されているように、標準的なリン酸緩衝生理食塩水にEDCとNHSを含む溶液を調製します。

シランコーティングされたスライドガラスをこの溶液で覆います。シラン化カンチレバープローブをECD/NHS溶液の滴下に入れます。両方を室温で10分間インキュベートします。

次に、カンチレバーとスライドの両方を3つの連続したビーカーで洗い流し、余分なEDC/NHSを完全に洗い流します。活性化したスライドガラスを、ウェットティッシュを備えたシャーレに移します。スライドガラスのEDC/NHS活性化領域に目的のタンパク質溶液の液滴を添加し、パラフィルムを使用してペトリ皿を密封し、プローブを室温でインキュベートします。

湿ったティッシュを備えたカンチレバーボックスに目的のタンパク質溶液の液滴を追加します。次に、カンチレバープローブをPBSで完全に洗浄します。プローブをボックス内の液滴に入れ、ボックスを閉じます。

プローブを室温でインキュベートします。この後、スライドガラスの裏側にあるタンパク質液滴の領域に印を付けます。スライドガラスとカンチレバープローブの両方を、PBSを充填した3つの連続したビーカーを使用して完全に洗浄します。

洗浄したプローブをトリス緩衝生理食塩水の入った容器に室温で20分間入れます。次に、スライドガラスとカンチレバープローブをPBSで完全に洗浄します。使用する準備ができるまで、PBSで覆われた別々のペトリ皿に保管してください。

洗浄したばかりのスライドガラスをAFMサンプルホルダーに固定し、PBSバッファーで覆います。次に、準備したカンチレバープローブをカンチレバーホルダーに固定し、AFMヘッドにセットします。カンチレバーをPBSバッファーの滴で慎重に濡らします。

カンチレバーがPBSバッファーに完全に浸るまで、カンチレバーをキャリブレーション面に向かってゆっくりと動かしますが、それでもキャリブレーション面から離れます。トップビュー光学顕微鏡またはAFMの倒立顕微鏡を使用して、レーザーをカンチレバーの裏側に配置します。カンチレバーの端付近にレーザースポットを先端が位置する場所の近くに置き、反射レーザービームがフォトダイオードの中心に配置されるようにAFMの4象限検出器フォトダイオードの位置を調整します。

次に、AFMソフトウェアでキャリブレーションマネージャーを開きます。カンチレバーの感度とスプリング定数のキャリブレーションを開始するには、基板表面に慎重に近づき、力距離曲線を記録します。先端が基板表面に接触している収縮力曲線の最も急な部分に直線をはめ込み、光学レバーの感度を決定します。

カンチレバーをサンプル表面から引っ込め、表面から少なくとも100ミクロンのカンチレバーでいくつかの熱雑音スペクトルを記録し、AFMソフトウェアが提供する高調波発振器を熱雑音スペクトルに適合させて、カンチレバーのばね定数を決定します。この後、カンチレバーをゆっくりと引っ込めて、溶液から引き出します。カンチレバーのキャリブレーションに使用したガラス表面を取り外し、固定化されたタンパク質を含むサンプル表面と交換します。

湿ったカンチレバーをゆっくりとサンプル表面に向かって動かし、カンチレバーがPBSバッファーで完全に覆われるまで、まだ基板表面から離れています。表面に近づき、250ピコニュートンの接触力、1秒の接触時間、2マイクロメートルの収縮長、1秒あたり1マイクロメートルの収縮速度で、サンプル表面上のさまざまな位置で複数の力距離曲線を記録します。データ処理ソフトウェアで、[フォーススキャンのバッチを開く]アイコンを選択して、測定されたフォースカーブファイルを開きます。

「スプリング定数で感度を調整してVディフレクションを再校正する」アイコンを選択して、カンチレバーディフレクションを正比例の力に変換します。次に、[ベースライン減算]アイコンを選択して、サーフェスから遠いフォースカーブの領域にあるリトラクションチャネルのベースラインを減算し、フォースレベルをゼロに設定します。[Contact Point Determination]アイコンを選択して、チップがサンプルと接触するポイントを定義します。

Tip Sample Separation(Tip Sample Separation)アイコンを選択して、高さ信号をTip Sample Separation(チップサンプル分離)に変換します。これにより、接触点の位置を差し引くだけでなく、カンチレバーの曲げを差し引いて、基板表面とAFMチップの間の距離を計算します。[Fit a Polymer Chain Model]アイコンを選択し、[Extensible Worm-like Chain]モデルを選択して、70ナノメートルを超える破断長で発生する力のピークの力距離トレースをスクリーニングします。

非特異的な相互作用を選別し、選択したピークに拡張可能なワーム様連鎖モデルを適用します。この研究では、タンパク質は、アクセス可能な第一級アミンを介してランダムな配向で共有結合的に固定化されます。シラン化ポリマー層のAFMイメージは、約2ナノメートルから5ナノメートルの範囲の高さの小さな表面波形のみを示しています。

しかし、フィブロネクチンで修飾された表面には、約10ナノメートルの高さのフィブロネクチン分子が存在することが確認されています。詳しく調べると、分子の二量体構造を認識できることが明らかになります。これらの分子は、PEG表面コーティングからの高さが4〜5ナノメートル、長さが約120ナノメートルと、コンパクトに見えます。

次に、RRGAとフィブロネクチンとの相互作用力を調査します。1 秒あたり 1 ミクロンの極速度で記録された代表的なチップサンプル分離曲線では、バックグラウンド相互作用が低く、良好な形状の相互作用イベントが示され、拡張可能なワーム様チェーンモデルを使用してフィッティングされます。この適合の結果をプロットすると、PEGリンカーの伸張における非特異的な表面相互作用を克服した後、力曲線の最大19%で、RRGAフィブロネクチン相互作用の平均破裂力が52ピコネクトンで、先端サンプル距離が約100ナノメートルであることがわかります。

この手順を試行する際には、接触時間や収縮速度などの設定によっては、単一分子力分光法データには複数の情報が含まれており、このプロトコルは完全なデータ解析への第一歩に過ぎないことを覚えておくことが重要です。この方法は、単一分子の相互作用に関する洞察を提供するだけでなく、単一細胞レベルでの相互作用の研究にも使用できます。この手順に続いて、シングルセルフォース分光法などの他の方法を実行して、全細胞がタンパク質被覆表面とどのように相互作用するかなどの追加の質問に答えることができます。

酸や紫外線を扱う作業は非常に危険であり、この手順を実行するときは、耐酸性手袋やUV光不透過性チャンバーなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。