Name: 一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ Nicotiana benthamiana を用いた一過性発現によるトリテルペン類の分取スケール生産法。Agrobacterium 共浸潤で複数酵素を組み合わせ、迅速かつスケーラブルに高付加価値天然化合物を合成する革新的な植物バイオテクノロジー手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ノリッジ研究公園就労 (JR) によってサポートされていた、共同工学と物理科学研究協議会/バイオ生物科学研究評議会 BBSRC 資金要約合成生物学研究センター (BB を付与します。/L014130/1) (M.J.S.、A.O.)。ジョン Innes の中心部知識の交換と商品化許可 (BB/KEC1740/1) (B.B.)。BBSRC 研究所戦略的プログラム グラント「自然から分子」(BB/P012523/1) とジョン ・ イネス財団 (A.O.)。PEAQ ベクトルを提供するためのジョージ ・ Lomonossoff とアンドリュー ・ デイビス写真撮影のために感謝したいと思います。

<ol><li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triterpene+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li>
<li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P450s+and+UGTs%3A+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li>
<li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limonoids%3A+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li>
<li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/ra/c4ra02784a">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li>
<li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+oleanane+triterpenoids%3A+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li>
<li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li>
<li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginsenosides+chemistry%2C+biosynthesis%2C+analysis%2C+and+potential+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Food+and+Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li>
<li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li>
<li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pEAQ+vector+series%3A+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li>
<li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pEAQ%3A+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li>
<li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li>
<li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li>
<li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li>
<li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li>
<li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+extraction+techniques+for+natural+products%3A+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li>
<li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li>
<li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li>
<li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li>
<li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li>
<li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li>
<li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

高を入れて真空浸潤では、様々 な下位アプリケーションにとってのトリテルペン化合物の分取用研究室で日常的に使用するこのプロトコルをことができます。ここで説明した真空浸潤装置は簡単に複製されます。真空リザーバーの追加ですが、浸潤室としてそのまま真空オーブンを単に再利用することは、必要な真空をプルする必要時間を短縮することをお勧め。適当なコンデンサーの追加を通して真空ポンプを保護することは理論的には理にかなっているが、私たちの研究室で私たちは必要がないとこれが見つけた。
場合は、葉が完全に浸潤の懸濁液に浸漬されていません、浸潤範囲が損なわれます。プラント ホルダーの上面を懸濁液のレベルに達するし、植物ホルダーが浸透浴のタイトなフィットを確保することによってこの問題を最小化します。図 2から植物ホルダー上面が際浸透浴で凹んでいる注意してください。これは浸潤お風呂の上部にアンカー ポイントを形作る者の中央の端にパネルで実現されます。浸潤懸濁液懸濁液レベルを維持するために定期的な追加が必要になります。これは最も大きなバッチ浸潤のコースで OD600の漸次の縮小を防ぐために余分な浸透を懸濁液の添加により達成されます。しかし、私たちの手で水の代替思えない分取スケールの期待利回りに顕著な効果を持っているこれは曲率の調査をしていませんが。浸潤の懸濁液の 1 つのバッチから潜入することができますどのように多くの植物はまだ未解決の問題であります。我々 は日常的に浸潤懸濁液の 1 つのバッチで 100 と 200 の植物の間に潜入します。さらに、いくつかの土壌浸透過程にわたって浸透サスペンションに濾すこと正常です。これは見つかっていない浸透効果に顕著な効果を持っています。
お勧め (しかし重要ではない) だが収穫時期に潜入していた葉だけを収穫する (いくつかの葉が成長している後浸透)。選択的な収穫は、関心の化合物に対する内因性不純物の割合が増加すると非生産的な組織で希釈を防止します。これは下流側の浄化のしやすさは、公称の影響とこれらのプロセスの規模が大きくなります。前駆体の供給を高めるに tHMGR を使用している場合、後浸透成長期間を開発するされた壊死の表現型がよく見られます。これは正常であり、実際にエイズ選択的収穫と乾燥工程。乾燥葉粉末は、涼しく乾燥した、暗い場所に、理想的には真空下で乾燥器で密封された容器で通常格納できます。これは興味の化合物の安定性に依存します。-80 ° C のフリーザーで保存するを選択する場合は注意が必要です。乾燥したことを確認ようにするこのコンテナーを開く前に常温の葉が防水コンテナーで、記憶域から削除します。そう失敗は、ダウン ストリームの処理を妨げ、葉のリウェッティングになります。
このプロトコルでは収穫後の手順は、説明のために提供され、実用的な化学が限られていることがありますこれらの者が経験を支援します。他の多くの天然物の抽出・精製技術に置き換えることができます。導入の詳細として PSE には多くの利点、禁則であるかもしれないしかし首都は市販の PSE 器具の費用、それは必須ではありません。塩基性イオン交換樹脂加工は伝統的な鹸化液液分配続いてを交換する非常に便利な方法です。しかし、カルボン酸基やエステルなどの基本的な条件の下で加水分解、官能基を含む製品に適したはありません。これらの製品は、塩基性イオン交換樹脂上に保持されるように期待されます。ただし、キャプチャのためにこれを悪用 (ここでは説明しません) の手順を解放する可能性があります。伝統的な鹸化が適切な場合、塩基性イオン交換樹脂加工は、便利な代替手段として提供しています。手順 9、クロマト グラフ法は、図 3に記載の化合物のため一般化する発見されています。しかし、増加の極性の化合物は、拡張 100% 酢酸エチルの溶出期間を必要があります。9.2 の手順を参照して下流側の細かい浄化完全化合物の特定し、規模にもよります。小規模な最適化されたグラデーション フラッシュ クロマトグラフィーの繰り返しラウンドで通常 NMR 解析の適切な純度を達成するために十分です。大きなスケールの結晶化はしばしば便利な代替手段です。困難な場合は、単離した化合物の所望の量によって分取やセミ分取高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いることができます。代表的な化合物の範囲の下流側の浄化プロセスの例としては、他の場所で8で見つけることができます。
現在のプロトコルでは、ここに示された我々 の研究室で日常的に使用し、ユーティリティを証明しました。ただし、式プラットフォームのさらなる最適化のためのまだ重要な範囲があります。継続的な作業は、どのようにさらに経路工学を調査する研究室および差動制御タンパク質発現レベルの宿主細胞への毒性を仲介しながらさらに、トリテルペンの生産を改善できます。細胞内輸送システム20,21の操作と異なる細胞コンパートメント22,23, 酵素を改善できる道の方向を検討する可能性もあります。複数の酸化イベントの効率。主要器官の基になる形態を変更する潜在的な利点を検討も可能性があります。たとえば、過剰発現シロイヌナズナにおける HMGR のドメインの膜は植物24; 小胞体の肥大を誘導するために観察されています。CYP450 活動の重要なサイト。このプロトコルはトリテルペン類、グラム スケール量ミリグラムの生産に最適で、下流の研究 (例えば、構造活性の組織的な探検の化合物へ研究の場で用いることができます。リレーションシップ、および事前調査の薬力学及び薬物動態学的特性に導く臨床的に興味深い化合物)。しかし、プラットフォームは直線的、使用される、植物の数と agroinfiltration を介して一過性発現の実用性を増やすことによって単に信頼性の高いスケーラブルな製薬蛋白質の生産のための産業規模で実証されています。14、従ってある高価値トリテルペンの商業生産の拡張にこのプラットフォームの潜在的です。また、それはまた安定した形質転換体確定欲求発現の生合成経路を運ぶ、大量培養の生産を想像することと '農業' トランスジェニック(名) 栽培の継続的な系統商業的価値の異なる化合物を生産しています。

トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。彼らの広大な多様性にもかかわらずすべてトリテルペン天然物は同じ線形前駆体 2, 3-オキシドスクアレン、植物におけるメバロン酸経路の製品に由来すると考えられています。2, 3 オキシドスクアレンの環化反応を開始し、オキシドスクアレン閉環酵素 (受動) と呼ばれる酵素の家族によって制御されます。この環化反応ステップは、何百もの異なるトリテルペン足場性質1から報告されている、多様化の最初のレベルを表します。これらの足場はチトクローム p450 に限定されない、(CYP450s)1,2を含む酵素を調整することによってさらに多様化します。このような生合成経路は、巨大な複雑さ、時々 親トリテルペンからほとんど認識である最終製品の結果につながります。たとえば、tirucallane タイプ3の四環系トリテルペンから派生する強力な殺虫剤は、摂食のリモノイド アザジラクチンの複雑な構造が考えられています。
多くトリテルペンから派生した自然な製品であっても比較的そのまま親足場では、医薬関連生物活性4,5,6,7を所有する示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。
(名) ベンサミアーナ葉に他の植物種のトリテルペンの生合成酵素の一過性の発現は、新しい高付加価値トリテルペン製品 (図 1) の製作に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。このプロセスは、候補酵素の機能的特徴し、重要な自然発生する代謝産物の生合成経路を再構築する使用することができます。同様に、この新規トリテルペン製品、構造活性相関の体系的な検証ができるように構造的に関連の類似のライブラリにつながる戦略を生成する生合成アプローチの組合せでも悪用することができます。生物学的活性の鉛の化合物の8,9。
Agroinfiltration は(名) ベンサミアーナ葉に一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の二項式 construct(s) を運ぶA. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液で葉の浸潤が含まれます。これは、気孔、細胞間隙に空気を追い出し、 A. 根頭がんしゅ病菌のサスペンションの交換を介して液体を強制する圧力のアプリケーションを介して達成されます。細菌は、浸透した葉のティッシュのローカライズと一時的な蛋白質の表現の結果として、植物細胞の内部にそれぞれ T Dna を転送します。
適切な任意のバイナリ ベクトル中利用可能な一過性発現に使用されるかもしれない遺伝子組換え植物を生成するササゲ モザイク ウイルス CPMV から派生したHypertranslational (HT) タンパク質発現システム10, 11. このシステムでは目的の遺伝子が隣接している非翻訳領域 (UTR) CPMV RNA 2 から。5' UTR ウイルス複製12への依存なしで非常に高いレベルのタンパク質翻訳結果の変更が含まれています。この手法は、プロトコルと互換性のある構成要素 (pEAQ -HT- DEST)10,11をクローニング部位特異的組換えを含む (pEAQ) 簡単および簡単な二進ベクトル シリーズに開発されています。ほとんど pEAQ ベクトルもトマトふさふさしたスタント ウイルス由来 P19 サイレンシング抑制遺伝子13 coinfiltrate 別 P19 運ぶひずみする必要性を回避して非常に支払う式カセットの T-DNA 部分内に含むホストの高度な蛋白質の表現は植物細胞10,11です。
(名) 植物の使用発現用宿主植物の生合成経路を操作するとき特定の利点があります。セル アーキテクチャは、本質的に適切な mRNA やタンパク質の処理と必要な共同酵素、還元酵素 (CYP450s) の代謝前駆体を有するほか、適切な区分をサポートします。炭素源は光合成です。したがって、植物は、単に入力として水 CO2 (空気) から、日光を必要とする良質の堆肥で栽培できます。プラットフォームはまた、共発現蛋白質のさまざまな組み合わせのため非常に便利なA. 根頭がんしゅ病菌、大規模な発現式を構築する必要性を否定することの異なった緊張の共同含浸による facilely これ達成することができます。カセット。さらに、プロセス直線的かつ確実にスケールできます実験で使用される植物の数を増やすことによって単に。
私たちの研究室の前の仕事は、分取スケール実験は、このプラットフォームの有用性を実証しています。これは隔離された製品のグラム量を達成するためを新規トリテルペンの活性アッセイおよびスケールで使用するための準備を含まれています。さらに、異種トリテルペン製品の蓄積を増やすことができますいくつかはレート制限還元酵素 (tHMGR)、3-ヒドロキシ 3-methyglutary-コエンザイムの N ターミナル切り捨て、フィードバックを区別しないフォームの共発現によるフォールド上流メバロン酸経路8酵素。
このような分取スケール実験の鍵は、浸透過程のアップ スケールを便利にする機能です。典型的な実験で何百もの植物の数十は、分離製品の目標量を達成するために必要があります。運用要求、および多くの場合たいへん時間がかかりますが (言うまでもなく注射器を使用して) 個々 の葉を手で浸潤レンダリングこの手法を日常のスケール アップのため実用的ではないです。真空浸潤は演算子のスキルレベルには依存しないにより、葉の表面のより大きい区域の浸透と手浸潤上の利点を提供しています。この手順は、製薬タンパク質14の大規模な生産のため商業的に使用されます。このプロトコルは、市販部品から構築することができます簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。これにより、迅速かつ実用的なバッチ浸透植物の何百もの時間の短い期間で主事まで 4 つの植物の同時浸透 (図 2 a -2b)。浸潤の商工会議所 (図 2 f) を形作る真空オーブン真空浸潤装置で構成されます。オーブンは、真空リザーバーを介してポンプに接続されます。これは、浸潤室で必要な真空を達成するために必要な時間を大幅に削減します。植物は特注のホルダーで保護、 A. 根頭がんしゅ病菌の懸濁液でいっぱい 10 L のステンレス製水槽に反転 (図 2 a -2 c)。植物の地上部の完全な浸漬は、効率的な浸透のため重要です。浸潤チャンバ内で風呂の水を入れます (図 2 d -2e)、および空気を引き出す葉間質性スペースに適用される真空。880 mbar (約 1 分かかりますプロセス) によって圧力が減った後浸透室に戻されるすぐに大気圧の浸透が完了するとすぐにオーブン入口弁を開くことによって 20-30 秒。
5 日後植物材料は収穫とその後の抽出とご希望のプロダクトの分離の準備ができて。この点から、プロセスは単に天然物抽出・精製葉材の天然物化学者になじみのあるワークフローの 1 つです。初期抽出とそれに続く浄化のための多くの異った方法には、15が存在しています。正確な条件・方法の最も適切な選択はスキルや機器の可用性に加えて、興味の化合物の特定の化学的性質に大きく依存。完全に一般化、ステップバイ ステップ、関心のトリテルペン製品の盲目的に続くことができる分離製品に収穫された植物葉材料の下流の処理法はこのプロトコル、不可能はないだろうそれこれを行うにしようとする適切です。ただし、このプロトコルは、当研究室と私たちの経験で最も酸素アグリコン トリテルペン製品の汎化可能な証明しているプロセスの初期の段階のいくつかのメソッドで使用される基本的なワークフローの概要を提供します。これは、2 つの比較的稀な技術、すなわち、高圧溶媒抽出 (PSE)、強塩基性のイオン交換樹脂を用いたクロロフィル除去のための便利な異種相法を含まれます。
PSE は、固体マトリックスからの小さな有機分子の抽出の非常に効率的な手法です。圧力 (約100-200 bar) の下での抽出が実行されます、沸騰を超える緩和の温度を使用する能力をされている主な利点は、抽出溶媒のポイントします。時間と単純な還流またはソックスレー抽出16など他のホット溶剤技術と比較されたとき完全な抽出を達成するために必要な溶媒の量が大幅に削減することができます。商業ベンチ上 PSE 器具があります、交換可能な抽出セル、および自動溶剤処理、加熱、および監視を利用しました。これはこのテクニックを非常に便利になります。また、間違いなく少ない危険、特に限られた実用的な化学の経験を持つ演算子です。
還流液液分配が続く原油葉抽出物の鹸化はそれに続く浄化や分析の前にクロロフィルの一括除去のための一般的な手法です。しかし、この厳しいことがしばしばする運用より大きいスケールで。さらに、インターフェイス、またはエマルジョンの形成による製品の損失の検出が問題となります。異種相加水分解を実行する強塩基性イオン交換樹脂の使用は、便利な代替手段として使用できます。加水分解のクロロフィルの色素部分は樹脂に付着のまま、単に濾過により除去することができます。このプロトコルは、市販の塩基性イオン交換樹脂を採用しています以前に報告された分析手順17の分取スケール適応を利用しています。
以下この植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの分取スケールの生産のための詳細なプロトコルについて述べる。このプロトコルを使って定期的に当研究室で核磁気共鳴 (NMR) 分光法によるそのような構造解析用十分離トリテルペン製品のミリグラムの何百もの準備および/または機能でさらに研究を試金。

<table><tbody><tr><td>GC-MS装置</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラーPCR反応を行うのに適した</td><td></td>任意の<td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ゲル電気泳動装置</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>調整可能な空気変位マイクロピペット(サイズ:1000&マイクロ;L、200 &micro;L、100 &micro;L、20 &micro;L、10 &micro;L、および2 &micro;L )</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ワイドトップ液体窒素キャリア (サイズ: 2 L)</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>卓上型微量遠心分離機 (容量: 24 x 1.5/2mL、最大速度: =/> 15000 rpm)</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>卓上型遠心分離機 (容量: 20 x 50 mL、最大速度: =/> 4000 rpm)</td><td>いずれか</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>大型床置き型遠心分離機 (容量: 4 x 1L、最大速度: =/> 4000 rpm)</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>スタンディングインキュベーター</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベーター (フラスコ クランプサイズ: 10 mL、50 mL、2 L)</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離ボトル (1 L)</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>真空浸潤装置</td>は<td>別注</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm 植木鉢</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥装置 (=/> 8リットルのコンデンサー容量)</td> <td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>120 mL 抽出細胞 (PSE 機器)</td> <td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>ロータリー蒸発器装置</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>蒸発フラスコ (サイズ: 100 mL、500 mL、1 L、2 L)</td> <td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>デュランボトル (サイズ: 1 L、10 L)</td> <td>任意の</td><td>n/円</td><td></td></tr><tr><td>錐形フラスコ(サイズ100 mL、2 L)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ(各種サイズ)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr>分析<tr><td>天びん(5数字)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>天びん(2数字)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>測定シリンダー(10 mL、100 mL、1 L)</td><td>any</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>A -80冷凍庫</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera 装置、250 mL 収集ラック、ボトル付き (自動フラッシュクロマトグラフィー装置、</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr>、<tr><td>安全メガネ、</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ラボコート</td>、<td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td>、<td>任意の</td><td>n/</td>a<td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットチップ(サイズ:1000&マイクロ;L、200 &micro;L、100 &micro;L、20 &micro;L、10 &micro;L、および2 &micro;L )</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ(サイズ:2 mL)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ(サイズ:15 mL、50 mL)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット(サイズ2 mL)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(サイズ:100 mL)</td><td>任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&reg;SNAP KP-SIL 100 g フラッシュカートリッジ</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC バイアル (1 mL)、バイアル インサートとキャップ</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>使い捨ての紫色のニトリル手袋</td><td>任意の</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E-914 用トップ フィルター、セルロース</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>E-916/914 用ボトム フィルター、ガラス繊維</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>試薬</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英砂、0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (珪藻土)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>シリカゲル 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>メルク</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)-エタンスルホン酸</td><td>メルフォード</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ></td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>株式会社</td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3'5'-ジメトキシ-4'-アセトフェノン(アセトシリンゴン)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>メルフォード</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス ミラー</td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シムガ-アルリッチ</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>シグマ-アルリッチ</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ-アルリッチ</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>アンバーセップ&reg;&nbsp;900水酸化物(塩基性イオン交換樹脂)</td><td>シグマ・アルリッチ</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>・フィッシャー</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>フィッシャー</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>・フィッシャー</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>・フィッシャー</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>シグマ・アルリッチ</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>、VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr>、<tr><td>Milli-Q水</td><td>、任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>、レビントンF1堆肥</td><td>、任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr>、<tr><td>レビントンF2堆肥</td><td>、任意の</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>、QIAprepスピンミニプレップキット(プラスミド精製キット)。</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-α 有能な大腸菌</td><td>サプライヤー ニューイングランドバイオラボ株式会社</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 ベクトル</td><td>ロモノソフ研究所 ジョン・イネス・センター</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>サーモフィッシャー</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>サーモフィッシャー</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (部位特異的組換えクローニングプロトコル)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotianaベンタミアナは</td><td>評判の良いサプライヤーN</td><td>/A</td><td></td>をシードします</tr></tbody></table>

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

トリテルペン、最大の 1 つ、植物天然物のほとんどの構造的に多様な家族。多くのトリテルペン誘導体医薬関連の生物学的活性を有することが示されています。しかし、これまでこの可能性に翻訳はないクリニックでトリテルペンから派生した薬の茄多。これは間違いなく (少なくとも部分的に) 化合物のこのクラスに実用的な合成アクセスが制限の結果、問題の構造活性相関の探鉱・開発を抑えることができる伝統的な医薬品候補をリード化学のワークフロー。彼らの広大な多様性にもかかわらずトリテルペン、すべてから派生した単一の線形の前駆体 2, 3 オキシドスクアレン閉。(名) 植物の生合成酵素の過渡の異種発現は、自然このホストによって生成されるしない新しいトリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。農業-浸潤はある(名) ベンサミアーナに一過性発現を達成するための効率的な手段です。プロセスには、関心の式 construct(s) を運ぶアグロバクテリウムの懸濁液と植物葉の浸潤が含まれます。追加A. 根頭がんしゅ病菌の共同浸潤ひずみ運ぶ前駆体供給を大幅向上する酵素は増加するエンコード式構造が得られます。5 日間の期間の後浸透した葉の材料を収穫し、抽出し、結果として得られるトリテルペン製品を分離処理できます。これは、実験で使用される植物の数を増やすことによって単に直線的かつ確実にスケーラブルなプロセスです。ここにはこの植物ベースのプラットフォームを活用したトリテルペンの迅速分取スケール用プロトコルを記述しました。プロトコルは、植物の何百もの時間の短い期間での浸潤バッチを有効にする 4 つまでの植物の同時浸透を可能にする、簡単に複製可能な真空浸潤装置を利用しています。

典型的な分離収穫調査、ターゲット化合物の化学的安定性および浄化プロセスに挑戦はいかがでしたの下で酵素/酵素の組み合わせに依存しています。我々 は以前 β-アミリンの分離の利回りを報告しているに至る 0.12 グラムあたり 3.87 mg コンビナトリアル生合成実験から誘導体乾燥(名) ベンサミアーナリーフ パウダー。これらの化合物は酸化のレベルで広くあったし、酵素 (図 3)8の不自然な組み合わせが含まれています。このプロトコルは日常的に使用当研究室で数十または精製した製品構造特性のミリグラムの数百を生成する NMR 分光学および下流の機能アッセイによって。98% 以上の純度でトリテルペン足場 β-アミリンの 0.8 g を生産することによってこのプラットフォームの分取の有用性も実証しました。この実験 459 植物を使用し、ドライのグラムあたり 3.3 mg の単離収率を表します(名) ベンサミアーナ葉粉末8。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> 図 1: 概要。新トリテルペン高付加価値製品の分取の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給を転換する(名) ベンサミアーナ葉の生合成酵素の一過性の発現を悪用するプロセスの模式図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> 図 2: 侵入者の建設やプロセスの真空、)オーダーメイドの一戸建て植物ホルダー 1 つの翼。b) Bespoke 植物ホルダー翼を接続します。c) 反転と植物の水没。d) 浸透浴の挿入。e) 浸潤浸潤チャンバー内でお風呂。f) 完全な真空の侵入者: (1) 真空ポンプ真空ポンプ真空リザーバー (3) 真空タンク分離バルブ (4) 真空リザーバーと浸潤商工会議所圧力計 (5) (6) の吸気バルブ (7) 間の接続から接続 (2)浸潤商工会議所 (8) 真空貯水池があります。g) 代表の葉緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現コンストラクトを浸透させた 1 つの工場から 5 日後の浸潤成長後。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> 図 3: 以前このプロトコル8を使用して β-アミリン誘導体の分取用の代表的な結果を報告します。このテーブルは分離の利回り順に。列は、相対値の色の表示を条件付きで書式設定されます。赤 = 高、緑 = 低 (しかし中間黄色)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ベンサミアーナ タバコ葉の生合成酵素の過渡の異種発現は新トリテルペン高付加価値製品の生産に向けてオキシドスクアレン閉の 2, 3 の内因性供給をそらすことができます。ここは、トリテルペン、この強力な植物ベースのプラットフォームを活用した類縁体の急速 (5 日間) 分取スケールの生産のための詳しいプロトコルを記述しました。

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

このプロトコールは、構造特性評価や薬学的に関連性のある生物学的活性の有効期限など、ダウンストリーム研究で使用するためのトリテルペン化合物への便利な分取スケールのアクセスを提供します。このプロトコルは迅速でスケーラブルで、Agrobacteriumの異なる株の共浸潤によって酵素の組み合わせを簡単に利用できるため、大規模な多遺伝子ベクターを構築する必要がなくなります。まず、選択的LB寒天プレートに、グリセロールストック培養物から目的のAgrobacterium tumefaciens株の縞を接種します。プレートを28°Cで一晩、スタンディングインキュベーターでインキュベートします。翌日、50ミリリットルの選択的LB培地に各Agrobacterium tumefaciens株のサンプルを個別に接種します。培養物を28°Cで一晩、200rpmの振とうインキュベーターでインキュベートします。50ミリリットルの培養物を1, 000ミリリットルの選択的LB培地に個別に移し、200rpmの振とうインキュベーターで摂氏28度で一晩インキュベートします。翌日、液体培養物からAgrobacterium tumefaciensを4, 000 gの遠心分離により個別にペレット化する。上清を廃棄した後、ペレットを新たに調製したMMA緩衝液50ミリリットルに個別に再懸濁します。再懸濁したペレットを室温で暗所で1時間インキュベートします。次に、各Agrobacterium tumefaciens MMA懸濁液の適切な容量を決定して、10リットルの総最終容量で少なくとも0.2の最終OD600を生成します。各懸濁液の決定された量を組み合わせます。次に、結合された懸濁液にMMAバッファーを1リットルの最終容量に追加し、真空浸透にすぐに使用できるようにします。浸透懸濁液の1リットルおよび1リットルの10x強さMMA緩衝液の1リットルを浸透浴に移し、続いて水の追加の8リットルを移しなさい。特注の植物ホルダーの取り外し可能な翼を取り外します。テキストプロトコルに記載されているように育てられた生後5週間の植物を4つ挿入し、翼を再度取り付けます。葉が浸透懸濁液に完全に浸されていないと、浸透範囲が損なわれます。この問題は、真空処理の前に懸濁液のレベルがプラントホルダーの上面に到達するようにすることで最小限に抑えられます。ホルダーを反転させ、浸透槽の上に置き、葉を浸透懸濁液に沈めます。水没した植物が入った浸潤槽を浸潤室に移し、ドアを閉めます。インフィルトレーターの吸気バルブが閉じていることを確認します。真空ポンプをオンにした後、浸透チャンバーの真空吸気バルブを開きます。浸透チャンバー内の圧力が880ミリバール低下したら、真空吸気バルブを閉じ、吸気バルブを開きます。大気圧に戻ったら、ドアを開けて浸潤槽を取り出します。次に、植物が浸潤懸濁液に沈まなくなるまで、プラントホルダーを持ち上げます。次に、ホルダーを静かに振って、余分な懸濁液が葉から流れ落ち、浸潤浴に戻るようにします。最後に、ホルダーを直立位置に戻し、取り外し可能な翼を取り外し、植物を取り除きます。浸透した植物を摂氏25度で5日間、1日16時間の光で育て、毎日水をやります。5日間の成長後、葉を収穫し、テキストプロトコルに記載されているように乾燥させます。乾燥させた葉を、家庭用のフードプロセッサーを使用したり、袋に入れたまま手動で葉を粉砕したりするなどの便利な方法で粗い粉末に粉砕します。葉の粉末を石英砂と適切な容器で混ぜます。これは分散剤として機能し、抽出プロセスの効率を向上させます。次に、最初にそれらを反転させて、充填するための4つの抽出セルを準備します。次に、グラスファイバーフィルターを挿入し、続いて金属フリットと保持プラグを挿入します。抽出セルを直立位置に戻し、深さ1cmの石英砂の層を追加します。抽出セルに調製した葉粉末を充填ラインまで充填します。必要に応じて、このプロセス中に粉末を穏やかに圧縮して、各抽出セルにより多くの量を添加するのを促進します。次に、パックされた粉末の上部に石英砂の小さな層を追加し、上部のセルロースフィルターを挿入します。充填した抽出セルを加圧溶媒抽出装置に挿入し、目的のメソッドを実行します。メソッドが完了したら、テキストプロトコルに詳述されているように、真空下での回転蒸発により、結合抽出液を乾燥まで濃縮します。濃い緑色のスラリーの予想される出力を確認します。クロロフィルを除去するには、塩基性イオン交換樹脂を使用して、まず粗抽出物を最小限のエタノールに溶解します。得られた溶液に50ミリリットルの塩基性イオン交換樹脂ビーズを加えます。その後、室温で30分間撹拌します。反応が完了するまで、30分ごとに50ミリリットルの塩基性イオン交換樹脂ビーズを追加します。最初は、基本的なイオン交換樹脂ビーズの色はピンク色で、液相は緑色です。反応が進むと、樹脂ビーズは緑色に変化し、液相はスケールに応じてオレンジ色または濁った茶色に変化します。反応混合物をガラスフラッシュクロマトグラフィーカラムを介して珪藻土の短いカラムでろ過し、ハンドベローズを使用して圧力を加えます。収集した樹脂ビーズをエタノールですすぎ、続いて1対1のエタノールをヘキサンに、最後にヘキサンですすいでください。珪藻土柱の上にビーズを再懸濁するのに十分なすすぎ量を使用してください。最後に、濾液、すすぎ液、濃縮物を真空下での回転蒸発により乾燥させます。ここに示されているのは、浸潤後5日後に蛍光タンパク質GFPの発現コンストラクトが浸潤した1つの植物の葉の画像です。これは、予想される浸透範囲の範囲を示しています。葉は、植物の元の高さに対して、画像の左上から右下に降順で配置されています。この画像は、このプロトコルを使用して製造された0.8グラムのベータアミリンを表しており、純度は98%を超えています。この実験は459植物スケールで行われ、乾燥葉材料1グラムあたり3.3ミリグラムの孤立した収量を表しています。このプロトコルを試行する際には、浸潤した葉のみが目的の化合物を生成することを覚えておくことが重要です。したがって、可能であればこれらの葉を選択的に収穫して、サンプルが非生産的な組織で希釈されるのを防ぐことが有利です。このプロトコールの収穫後のステップは、例示を目的として提供されています。これらは、お客様の施設の専門知識や施設の利用可能性に応じて、他の天然物抽出精製技術の代わりに使用できます。このプロトコルで提示された基本的なイオン交換樹脂処理は、より伝統的な鹸化とそれに続く、より大きなスケールでのクロロフィルの除去のための液体/液体分配の便利な代替手段であることがわかりました。このプロトコルに従う前に、使用するすべての物質の製品安全データをよく理解し、適切な安全対策を講じる必要があります。トランスジェニック材料の取り扱いに関する現地の法律は、適切な収容手順に従うことを含め、確認し、遵守する必要があります。

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。...

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

我々は、植物におけるモノクローナル抗体およびレポータータンパク質の一過性発現に対する導入遺伝子の調節エレメント、植物の成長および発達パラメータ、およびインキュベーション条件の影響を決定し、モデル化するのに使用することができる実験アプローチの設計を記載している。...

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

この作品は、選択的にバイオラッド遺伝子銃を用いてアッセイ、植物では細胞内小器官を標的化するための新しい方法を説明します。...

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。...

組換えセルラーゼCEL5Aの式から<em&gt;トリコデルマ·</em&gt;タバコ植物における

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

ここでは、食用植物の 1 型糖尿病に対する経口ワクチン候補を生成するためのプロトコルを提案する.

1 型糖尿病のバイオ医薬品候補ワクチンの赤カブの一過性発現

ここでは、エシェリヒア大腸菌またはニコチアナ・ベンタミアナにおける生合成酵素の組み合わせ発現を通じて、ジテルペノイド代謝物を製造および精製するためのプロトコルを簡単に提示し、クロマトグラフィー製品を提供します。浄化。得られた代謝産物は、分子構造特性解析、酵素機能研究、生理活性アッセイを含む様々な研究に適しています。...

ジテルペノイド天然物の酵素生産と精製のためのカスタマイズ可能なアプローチ

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

学ぶ Nicotiana benthamiana を用いた一過性発現によるトリテルペン類の分取スケール生産法。Agrobacterium 共浸潤で複数酵素を組み合わせ、迅速かつスケーラブルに高付加価値天然化合物を合成する革新的な植物バイオテクノロジー手法です。

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

さらに動画を探す