Name: CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学ぶNHEJ-CRISPR/Cas9とCre-Loxシステムを統合した組換え鳥ヘルペスウイルス（HVT）ベクターワクチンの作製法。GFP可視化と細胞選別により効率的な多価ワクチン開発を実現します。

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著者は、共焦点レーザー顕微鏡を助けるため Pippa ホーズをありがとうございます。このプロジェクトは、バイオ テクノロジーによって支えられた・生物科学研究会議 (BBSRC) 掲示板/E/私/00007034 BB/L014262/1。

1. Cas9/gRNA 式とドナーを構築の準備
<ol><li>
Cas9/gRNA 発現プラスミドの建設
	<ol>
<li>HVT、22を前述の UL45 と UL46 遺伝子のコード領域をターゲット gRNA シーケンスを設計します。HVT のゲノムの任意の潜在的なオフのターゲット シーケンスを排除する HVT ゲノムに対してガイド RNA ターゲット シーケンスに合わせます。合成し、UL45/46 地域と pX459 V222を前述のように公開されているデータ23から sg のシーケンスをターゲット gRNA シーケンスを複製します。サンガー U6 Fwd プライマー24を使用してシーケンス処理によってクローンとして作られた gRNA シーケンスを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ドナー プラスミドの建設
	<ol>
<li>取り外し可能な GFP レポーター カセットが付いた VP2 式カセットを含むドナー プラスミドを生成する設計 oligos ドナー F とドナー-R (図 1A 図 3A)、次の要素を含む: sg Aターゲット シーケンス終了、GFP レポーター カセット クローニングおよび切除のための 2 つの LoxP シーケンスの両脇にパーチ サイトと VP2 式カセットのクローニングのための 2 つの SfiI サイトの両方で。</li>
		<li>PGEM T 簡単なベクトルにシーケンスを複製し、GFP と VP2 遺伝子カセットの pGEM sgA-GFP VP222として指定されたドナー プラスミドを生成する結果のベクトルにクローンを作成します。 注: 任意のクローニング ベクトルは、ドナーのプラスミドを構築する使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プラスミッド DNA の準備
	<ol>
<li>ドナー プラスミドと Cas9/gRNA 発現プラスミド Dna の製造元の指示に従って商業 DNA 抽出キットを使用して準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CRISPR/Cas9 を介したノックイン: トランスフェクションと感染症
<ol><li>トランスフェクション、前日は 5% ウシ胎児血清 (FBS)、10 %tryptose リン酸塩スープ、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、M199 培で 10 日間の古い胚を使用してのトランスフェクション/感染症、ニワトリ胚線維芽細胞 (Cef) を準備し、0.25 μ G/ml fungizone。媒体の 2.5 ml 6 ウェル プレートの各ウェルによくあたり種子 1.3 x 106セルです。 注: CEF 細胞保持する 3 d 4 ° C で</li>
	<li>UL45/46-gRNA の 0.5 μ g、0.5 μ g、sg の pGEM sgA GFP vp2 製造元の指示に従って適切なトランスフェクション試薬を用いた 1 μ g と CEF 細胞 (の準備手順 2.1) を transfect します。(5% CO2と 38.5 ° C) でインキュベーターで 12 h のセルを孵化させなさい。</li>
	<li>Cas9/gRNA とドナーのプラスミドの 12 h posttransfection 希釈 HVT ウイルス ストック M199 培地に 1 x 105 pfu/mL にします。Transfected セルの各ウェルに希薄ウイルスの 130 μ L を追加し、ウイルスの同じ量のネガティブ コントロールとして融合細胞の 1 つの井戸を設定します。5% CO2の 38.5 ° C で 3 d を導入した感染細胞を孵化させなさい。共同綱領 (JCoPR) 資金提供者によって承認されたを使用してすべての手順を実行します。</li>
</ol>3. 収穫および HVT 組換えウイルスの純化
<ol><li>
蛍光活性化細胞ソーティング
	<ol>
<li>よく並べ替えする前に 1 日あたり 2 × 104 CEF 細胞を用いず 2 つの 96 ウェル プレートを準備します。</li>
		<li>トランスフェクション感染 Cef 3 d 感染後を trypsinize します。各ウェルから培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞シートをすすいでください。Trypsinize 約 5 分 38.5 ° C の定温器で細胞をトリプシン-EDTA 0.05% (0.48 mM) の 1 つの mL を追加します。</li>
		<li>再懸濁し、FBS の 50 μ L で 1.5 mL 遠心チューブにセルを転送します。200 x gで 5 分間遠心します。</li>
		<li>1 %1 mL の PBS で細胞を再懸濁します FBS。診断を使用してセル数をカウントし、1 x 106セル/mL にセルの数を調整します。 注: セルは 1-2 時間の氷の上保管できます。</li>
		<li>そのストレーナー キャップを通してチューブを並べ替えポリスチレンにセルを転送します。製造元の指示に従ってセルソーターを用いた Cef とシード 96 ウェル プレートに gfp 単一セルを並べ替えます。5% CO2の 38.5 ° C で 5 d の並べ替えセルを孵化させなさい。 注: 組換えウイルスの 1 つの通路は、あまりにも多くの単一 GFP 発現細胞と独創性でいくつかの GFP 陽性斑がある場合、並べ替えの前に必要かもしれない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組換えウイルスの継
	<ol>
<li>よく、通路の前に 1 日あたりの 10 の6 CEF 細胞 x 1.3 でシード 6 ウェル プレートを準備します。postsorting、5 d は、蛍光顕微鏡下で 96 ウェルのプレートを確認します。単一 GFP 陽性のプラクを含んでいる井戸をマークします。 注:図 2代表的な GFP 陽性プラークのAを参照してください。</li>
		<li>Trypsinize 3 分トリプシン-EDTA の 50 μ L でもそれぞれの GFP 陽性、培養液を 50 μ l 添加、再懸濁します、Cef を 6 ウェル プレートの 1 つのウェルにセルを転送します。これは組換え HVT の第一世代であります。</li>
		<li>組換えウイルス 3 d 後の第一世代を収穫、それぞれ凍結媒体含む 10% ウシ胎仔血清 (FCS)、10% ジメチルスルホキシド (DMSO) と 80% 培養培地 1 mL のバイアルを凍結し、液体窒素でウイルスを格納します。 メモ: 収穫時期はウイルスの量と拡散容量によって 2-4 d から異なります。</li>
		<li>各ウイルスの最初の世代の 1 x 10 の5セルを収集、それらを遠心し、上澄みを廃棄します。DNA の抽出のための-20 ° C でセルを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ポリメラーゼ連鎖反応によるゲノム挿入の検出
	<ol>
<li>DNA の抽出の霜取りし、バッファーをつぶしの 50 μ L でステップ 3.2.4 から細胞ペレットを再懸濁します (トリス-HCl 【 ペーハー 8、10 mM 1 mM EDTA、25 mM の NaCl と 200 μ g/ミリリットル プロティナーゼ K) 30 分の 65 ° C でサンプルを溶解し、、プロテイナーゼ K を不活化する 2 分 95 ° C で、</li>
		<li>3' 接合プライマー (表 1) を 1 μ L の DNA のサンプルを使用して、ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) を実行します。各サンプルは、氷の上次の 20 μ L 反応混合物の準備: PCR マスター ミックス × 2 (10 μ L)、10 μ M 上流プライマー (0.5 μ L)、10 μ M 下流プライマー (0.5 μ L)、DNA テンプレート (1 μ L)、ヌクレアーゼ フリー水 (8 μ L)。増幅プログラムは: 95 ° C、2 分;95 ° C、30 s、55 ° C、30 s および 40 のための 72 ° C s 35 サイクル1% アガロースゲル電気泳動のための 1 つの井戸に増幅製品の 7 分負荷 2 μ L の 72 ° C。 注:、図 2A 3' ジャンクション PCR の代表的な結果を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 蛍光レポーター遺伝子を介してCre lox システムの切除
<ol><li>組換えウイルスから、GFP 遺伝子を削除するには、CEF 細胞, 製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いた用いず 6 ウェル プレートに Cre リコンビナーゼ発現プラスミドの 2 μ g を transfect します。</li>
	<li>12 h posttransfection、液体窒素から組換えウイルスの 1 つのバイアルを霜取り、優しく再懸濁します、transfected セルの各ウェルに 50 μ L をシード、同じウイルス量と負の制御として 1 つの井戸を設定します。5% CO2の 38.5 ° c で 3 d 間インキュベートします。</li>
</ol>5. プラーク精製
<ol><li>
蛍光活性化細胞ソーティング
	<ol>
<li>種子も並べ替える前に 1 日あたり 2 × 104 CEF 細胞 2 つの 96 ウェル プレート。</li>
		<li>並べ替えに感染した細胞を準備する (ステップ 4) からステップ 3.1 72 h 感染後で説明する手順に従ってください。Cef とシード 96 ウェル プレートに単一の nonfluorescence セルを並べ替えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組換えウイルスの PCR 確認継
	<ol>
<li>5-10 単一 nonfluorescence 斑 postsorting、5 d 3 分 38.5 ° C でトリプシン-EDTA の 50 μ L でそれらを trypsinize し、培地に細胞を再懸濁しますの 50 μ L を追加を選択します。 注:図 2代表的な GFP 負プラークのBを参照してください。</li>
		<li>第二世代として Cef を用いず 6 ウェル プレートの各ウェルに、細胞の半分を渡します。</li>
		<li>200 x gで 5 分で各クローンの残りの細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、50 μ L の DNA の抽出のためのバッファーをつぶしで細胞を再懸濁します。</li>
		<li>3.3.2 の手順で説明されているように同じ PCR 反応条件で 1 μ L の DNA のテンプレートを使用して PCR 5' 接合プライマー (表 1) を実行します。 注: 5' ジャンクション PCR の代表的な結果を図 2Bを参照してください。</li>
		<li>PCR の結果に基づいて、さらに通路及び検証のための組換え HVT の 3 ~ 5 肯定的なクローンを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 遺伝子組換え HVT の検証
<ol><li>
間接蛍光抗体法
	<ol>
<li>HVT はシードで 2.5 x 10 の5 Cef 感染前日 24 ウェル プレートにステップ 5.2 から得られた組換えの第二世代の Cef に感染します。細胞培養培地 48 h 感染後を削除し、セルを修正する PBS で 4% のパラホルムアルデヒドの 500 μ L を追加します。30 分間室温でプレートを孵化させなさい、定着剤を削除し、細胞層 3 を洗って PBS で x。 注: セルは数週間のこのステップで 4 ° C で保存されるかもしれない。</li>
		<li>PBS を削除し、500 μ L を追加 0.1 %15 分洗浄セル セルを permeabilize トリトン X-100 層 PBS の 3 倍。</li>
		<li>1 h のブロック バッファー (PBS で 5% ウシ血清) を追加して非特異的結合をブロック。</li>
		<li>一次抗体抗 VP2 モノクローナル抗体ブロッキング バッファーに 1: 200 で HH7 または HVT 感染鶏血清を希釈 200 μ L/ウェルを追加して、1 h. 洗浄セル層 PBS で 3 倍の室温で孵化させなさい。</li>
		<li>希釈、二次抗体ヤギ抗マウス IgG Alexa 568 またはヤギ抗にわとり IgG アレクサ 488 ブロック バッファーに 1: 200 で、200 μ L/ウェルを追加、1 時間室温で孵化させなさい、3 セルを洗浄して PBS の x。蛍光顕微鏡下でタンパク質の発現を確認してください。 注: は、染色結果代表 VP2 の図 4を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VP2 遺伝子の塩基配列決定
	<ol>
<li>忠実度の高い DNA ポリメラーゼと UL45 F1、UL46 R1 (表 1) 全体の挿入を検出するプライマー UL45 と UL46 遺伝子間領域にわたる DNA シーケンスを増幅します。</li>
		<li>次の 50 μ L 反応混合物の準備: 10 の 5 μ L x Pfx 反応混合物、1.5 μ 10 μ M 上流と下流のプライマー ミックス、10 mM dNTP ミックスの 1 μ L、50 mM MgSO4の 1 μ L、1 μ L の DNA のテンプレート、Pfx DNA ポリメラーゼの 0.5 μ L、し、ヌクレアーゼ フリー水を 50 μ L に追加。増幅プログラムは: 95 ° C、2 分;95 ° C、15 s、55 ° C、30 s、および 35 サイクル 3 分の 68 の ° C。1% アガロースゲル電気泳動のために PCR の製品のすべてをロードします。</li>
		<li>DNA ゲル精製キットの指示に従って PCR の製品を浄化します。VP2 遺伝子のノックアウトの確認にシーケンス処理会社に 10 μ L の PCR の製品 (30 ng/μ L) を送信します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 組換えウイルスの安定性
<ol><li>シード 2.6 x 106 CEF 細胞各 T25 フラスコ ウイルス拡大前に、の日に。</li>
	<li>5.2; から少なくとも 3 つの肯定的なクローンを解凍します。各 T25 フラスコ細胞/ウイルスの 1 つのバイアルを追加します。50% の細胞変性効果が観察されるまで 5% CO2の 38.5 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>培地; 2 mL のセルを収穫します。次世代の CEF 細胞を用いず新しい T25 フラスコに 50 μ L に感染します。少なくとも 15 世代の組換えウイルスを継を維持します。各世代のウイルス VP2 シーケンスの存在のための PCR、VP2 遺伝子組換えウイルスの安定性を評価するために式の間接蛍光抗体法 (IFA) を分析します。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

CRISPR/Cas9 システム遺伝子編集で貴重なツールとなっています。組換え相同組換え13や BAC 変異技術25など、HVT ベクター開発の伝統的な技術は通常、ベクトルのクローンを作成、選択、大規模なスクリーニングのいくつかのラウンドを含むこれは数ヶ月をかかることがあります。ここで Cre Lox システムと単一セルの並べ替えと組み合わせる NHEJ CRISPR/Cas9 ベースの戦略を使用して記述されているプロトコルは、組換えワクチン生成をより便利に、効率的かつ高速なアプローチです。このパイプラインを使用すると、わずか 1 〜 2 週間24、内組換えウイルスを得ることができるし、17蛍光活性化細胞を用いた単一ラウンド分離するプラーク精製工程を削減できます。精製組換え HVT ウイルスを取得する gRNA デザインとドナーの建設から、全体のプロセスは、1 ヶ月以内に実現できます。組換え HVT 発生の成功のための重要なステップに外来遺伝子の挿入、Cas9 のチャンスを最大化する高いトランスフェクション効率の効率的な胸の谷間を確実にウイルスのゲノムの対象高効率 gRNA 選択が含まれて/gRNAs と同じセルを編集するためのドナーと gRNA プラスミドのトランスフェクションと Cas9 と gRNA、ウイルス、細胞になる前に合理的なレベルで表現することを許可するウイルス感染の間 12 時間間隔を満たすためにウイルス。
HVT 組換え世代の制限は、GFP 陽性の同一証明の複雑さのジャンクション PCR によってクローンを作成です。GFP VP2 カセットは、どちらかの向きで挿入でした。PCR はここで説明されているジャンクションは意味向きで挿入の識別のためだけです。アンチセンス向きで挿入の場合記載されているプライマー対を用いた PCR は働かないでしょうとこの目的のために内部のプライマーを交換できます。もう一つの潜在的な問題、ドナー構築のみ使えるです GFP 除去後残りの LoxP シーケンスの同じウイルスが存在するために 1 つの遺伝子の挿入のため Cre 処理による。バリアント LoxP シーケンスで新しいドナー コンストラクトは、複数挿入目的の代わりに使用できます。
NHEJ と HDR (ホモロジー監督修理) Cas926,27によって作成された二本鎖切断 (Dsb) を修復する 2 つの経路であります。NHEJ は細胞周期28日全体にわたって HDR は非効率かつ S と G2 段階6,29,30中にのみ発生したに対しより効率的です。対象となる場所に外来遺伝子を導入するより効率的な NHEJ の修復経路を悪用しました。劈開ドナー シーケンスと、オクターリピート ゲノム DNA の相同性に依存しない柔軟な機械論的プロセス31,32を通じて非対応または破損した DNA 端を結合することによってオクターリピートを導入可能性があります、NHEJ 修復がsgA の胸の谷間のサイトでのみ発生することができます、外国の遺伝子発現カセットを受けません。このアプローチの別の利点は、NHEJ は、クローニングの非常に簡単なステップを作るホモロジー アーム構造の制限から自由では。NHEJ の外国の遺伝子を挿入するためのアプリケーションのための大きな可能性が要求されます。両方で普遍的な gRNA ターゲット サイトの紹介は、外国の遺伝子カセット作るのドナー テンプレートは特定の gRNA 選択のための必要性無しですぐに組み立てることができるより迅速なプロセスを終了します。異なるレポーター遺伝子、外国の遺伝子発現カセット、別のウイルスのベクトルは、この新しいアプローチの優位性を与えると sgA ターゲット サイト、LoxP サイト、およびパーチと SfiI サイトを含むドナー プラスミドのバックボーンが広く共有もできます。カスタマイズ。
本稿でのプロトコルを記述する使用された HVT かくまって VP2 挿入ただし、多価の組換えベクター HVT ワクチンの開発のため必要な対応するシーケンスをターゲット gRNA を使用して HVT ゲノムの異なるゲノム位置よりウイルス遺伝子に挿入する同じ方法を使用できます。SB 1、CVI988、また他鳥 DNA ウイルス、痘ウイルスやアデノ ウイルスなどと鴨腸炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスを含む他の鳥ヘルペスなど、他の MDV ワクチン株は、同じを使用して設計することができます。多価の組換えワクチン開発へのアプローチ。ここで説明した CRISPR/Cas9 システムのプラットフォームを使用して新しい多価ベクター ワクチンの開発は複数の家禽の病気から守るために養鶏産業にとって非常に有益になります。

マレック病 (MD) は、アルファヘルペスウイルス亜科のMardivirus属の血清型 1 (鶏伝染性喉頭ヘルペス ウイルス 2 [GAHV-2]) による鶏のリンパ増殖性疾患です。Mardivirusには 2 つの非病原性の血清型も含まれています: 2 (GaHV 3) 血清型し、血清型 3 (MeHV-1、HVT として歴史的に知られている) メリーランド州に対するワクチンとして使用されています。HVT ワクチン (FC 126 株) は、1970 年代初めに使用されるワクチンの最初の世代はまだ広く使用されている 2価および多価ワクチン製剤メリーランド州に対する強化された保護を提供するためにHVT はその汎用性と両方で ovo皮下孵化場管理と終生の免除を提供する機能のための安全のための家禽疾病の数に対する保護を誘導するワクチンのベクトルとしても広く使用されます。遺伝子組換えの HVT ワクチンを生成するための戦略は、ウイルス感染細胞、重なり合うコスミド Dna、または BAC 変異2いずれかの従来の相同組換えに基づいています。ただし、これらのメソッドは、一般的に時間のかかり、労働集約的で転送ベクトルの建設、大腸菌、プラーク精製ウイルスのゲノムの維持と BAC 順序と選択の除去を必要とします。編集済みウイルス3,4からのマーカー。
編集ツール、その多様性と特異性は近年最も人気のある遺伝子は、CRISPR/関連付けられている (Cas9)。CRISPR/Cas9 システムとして遺伝子組み換え細胞と動物モデル5,6,7,8,9,10の効率的な生成で正常に使用されていますいくつか大きな DNA ウイルスのゲノム11,12,13,14,15,16,17、操作と同様 18,19,20。HVT ゲノム21を編集する CRISPR/Cas9 システムを使用してシンプルかつ効率的な方法を報告した後組換え HVT22の迅速かつ効率的な世代のパイプラインを開発しました。
このメソッドの潜在的なアプリケーションを拡張するために世代組換え HVT ワクチン UL45/46 座本報告では, IBDV の VP2 遺伝子の詳細な方法論について述べる。アプローチを組み合わせた NHEJ CRISPR/Cas9 GFP レポーター遺伝子と GFP 発現カセットを後で削除する Cre LoxP システムが付いた VP2 遺伝子を挿入します。BAC ジーン テクニックと伝統的な組み替えに比べると、NHEJ CRISPR/Cas9 一緒に Cre Lox システムが組換え HVT ワクチンを生成するための迅速かつ効率的なアプローチであることを示します。

<table><tbody><tr><td>M199培地、アールズソルト</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>11150059</td><td>細胞培養培地</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>シグマ</td><td>F0926</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>ライフサイエンス</td><td></td><td>15140148抗生物質</td></tr><tr><td>ファンジゾン</td><td>シグマ</td><td>1397-89-3</td><td>抗真菌</td></tr>性<tr><td>トリプトースリン酸ブロス</td><td>シグマ</td><td>T8782</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>HVT Fc126 株</td><td>鳥類疾患および腫瘍学研究所</td><td></td><td>野生型 HVT ウイルス</td></tr><tr><td>pX459-v2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #62988</td><td>Cas9 および gRNA 発現ベクター</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector Systems</td><td>promega</td><td>A1360</td><td>ドナーベクタークローニング</td></tr><tr><td>サブクローニング効率 DH5&alpha;コンピテントセル</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td>形質転換</td></tr><tr><td>PacI</td><td>NEB</td><td>rR0547S</td><td>ドナーベクタークローニング</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>NEB</td><td>R0123S</td><td>ドナーベクタークローニング</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>クローニング</td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>プラスミド抽出</td></tr><tr><td>TransIT-X2</td><td>Mirus</td><td>MIR6004</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>細胞培養 6ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>140675</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>GoTaq Master Mixes</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>ジャンクション PCR 増幅</td></tr><tr><td>プラチナ Pfx DNA ポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11708021</td><td>フルインサート</td></tr><tr><td>ヤギ抗チキン IgY (H+L) 抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td> <td>の PCR 増幅免疫蛍光</td></tr>染色 <tr><td>ヤギ 抗マウス IgG 抗体, Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>免疫蛍光</td></tr>染色 <tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカ TCS SP5 LASAF</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>FACS セルソーター</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>BD FACSAria</td><td>シングルセルソーティング</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PBS中4%)</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>SC-281692</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>GeneTex</td><td>GTX30960</td><td>透過化</td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

ヘルペス ウイルス (HVT) の七面鳥は、理想的なウイルスのベクトル (AI) 鳥インフルエンザ、ニューカッスル病 (ND)、伝染性ファブリキウス嚢病 (IBD) などの家禽疾病の数に対する遺伝子組換えワクチンの生成のため細菌人工染色体 (を使用してBAC) 突然変異または従来の組換え方法。クラスター化された定期的に空間回文繰り返し (CRISPR)/Cas9 システムが正常に使用されて多くの設定で遺伝子編集のためいくつかの大規模な DNA ウイルスのゲノムの操作を含みます。迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集を生成するパイプライン組換え HVT を開発しました。このメソッドの潜在的な使用を最大にするには、提案はここで IBDV の VP2 蛋白を発現する組換え HVT の生成の方法論に関する詳細情報VP2 式カセットが挿入されます、HVT ゲノム経由(非相同性末端結合)、NHEJ に-依存修復経路。緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現カセットを簡単に視覚化挿入はまず接続を介してCre LoxP システムを削除し、.このアプローチでは、HVT ゲノム遺伝子組換えワクチンの急速な発展のために他のウイルス抗原を導入する効率的な方法を提供しています。

図 1、どのようにドナー プラスミドは組換え HVT (図 1Bを生成する構築された (図 1A) およびプロシージャを含む組換え HVT ワクチンの生成に使用される戦略を概説します。).蛍光顕微鏡 3 d posttransfection と感染症の下で井戸ノックで遺伝子の野生型プラークに囲まれた 5 ~ 30 GFP 陽性斑を観察できます。3' ジャンクション予想されるサイズ (図 2A、下部パネル) の PCR の製品を表わす PCR によって解析した単一セルの並べ替え (図 2A) 後に得られる精製ウイルス。Cre リコンビナーゼによって GFP レポーターの切除後、以上プラクの 50% は、GFP 発現を失った。単一セルの並べ替えによって GFP 切除 (図 2B) 後精製プラークさらに 5' ジャンクション適切サイズ PCR の製品 (図 2B、下部パネル) を表わす PCR 確認されました。図 3は、両方の接合の結果を配列に PCR の製品を別の色要素を示します。図 4蛋白質の表現は VP2 特異的モノクローナル抗体と抗 HVT 鶏血清 IFA によって確認されました。予想通り、親の HVT 感染細胞汚すことがのみできる HVT 抗血清による (緑)、遺伝子組換え HVT 感染細胞明らかに VP2 遺伝子の発現 (赤) 中。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg"> 図 1:組換え HVT ベクター ワクチンの生成のための戦略.(A) このパネル プラスミド構築ドナーのクローニング法の概略を示しています。キー要素挿入、GFP の切除に LoxP 配列で挟まれた記者 GFP カセット、VP2 式カセットを解放する 2 つの Cas9 ターゲット サイト (sgA) があります。(B) このパネルは、2 段階遺伝子ノックアウトの戦略の概要を示します。GFP と VP2 式カセットの挿入断片が Cas9/sgA 開裂によって解放され、UL45/46 座にを介してNHEJ CRISPR/Cas9 HVT ゲノムに挿入されました。GFP 陽性組換えウイルスはソートし、単一細胞蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えによって浄化します。その後、Cre リコンビナーゼによって GFP レポーター遺伝子を摘出、組換えウイルスの精製および特徴します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg"> 図 2: 組換え HVT の検証します。(A) このパネルは蛍光顕微鏡 (上部パネル) と 3' 接合用プライマー VP2 F と UL46 R1 HVT GFP VP2 の PCR 検証の下で GFP 陽性プラーク (HVT-GFP-VP2) を示しています。(B) このパネルは、5' 接合用プライマー UL45 F1 と VP2 R1 と Cre リコンビナーゼと HVT VP2 の PCR 検証を使用してプラーク (HVT VP2) HVT-GFP-VP2 の GFP 切除後の可視化を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg"> 図 3: 組換え HVT ウイルスの塩基配列解析します。(A) このパネル内の異なる色の主な要素のシーケンスが下線付き gRNA ターゲット シーケンスと UL45/46 間 HVT 遺伝子間領域、Cas9 胸の谷間サイトを示す矢印でシーケンスの最後で VP2 式カセット斜体の小文字、青 Cas9 胸の谷間サイト、緑、LoxP サイト シーケンスおよび 2 つの SfiI サイト シーケンスを示す矢印と赤で sg のターゲット シーケンス。(B) このパネルは、シーケンスで対応する色の 5' と 3' の接合、キー要素を持つ HVT VP2 の図式のシーケンスの結果を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg"> 図 4: 組換え HVT VP2 のキャラクタリゼーション。このパネルは、感染させた Cef で VP2 の成功の式の確認間接蛍光抗体法 (IFA) によって反 VP2 モノクローナル抗体 HH7 (赤) です。HVT 感染は、HVT 感染鶏血清 (緑) IFA によって確認されます。スケール バー = 20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

(HVT) および七面鳥ヘルペス ウイルスは家禽疾病の数に対する遺伝子組換えワクチンの生成のためベクトル プラットフォームとして広く使用されます。統合 NHEJ CRISPR/Cas9 と Cre Lox システムを用いた組換え HVT ベクター ワクチンの生成のシンプルかつ迅速な方法を説明します。

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

このアプローチは、組換えワクチンの迅速な開発のために、他のウイルス抗原をHVTゲノムに導入する効率的な方法を提供する。この技術の利点は、GFP発現カセットが最初に挿入物に取り付けられ、簡単に視覚化され、次にCre-LoxPシステムによって除去される点です。同じアプローチは、HVTゲノムの異なる場所に、または多価組換えワクチンの開発のための他の鳥類ヘルペスウイルスにより多くのウイルス遺伝子を挿入するために使用することができる。この手順のデモンストレーションは、セルソートの専門家であるケイティ・モファットです。ナ・タン、ヤオヤオ・ザン、広剛、私の研究室の科学者。トランスフェクションの前日は、テキストプロトコルに概説されているように、ひよこ胚線維芽細胞を準備します。6つのウェルプレートの各ウェルに2.5ミリリットルの培地で130万個の細胞をシードします。CEF細胞を2つのCas9ガイドRNAプラスミドのそれぞれ0.5マイクログラムでトランスフェクトし、メーカーの指示に従って適切なトランスフェクション試薬を使用してドナープラスミドのマイクログラムを1マイクログラム入れ替えます。5%の二酸化炭素で38.5度の細胞を12時間インキュベートします。トランスフェクション後12時間でM199培地でHVTウイルスストックを1ミリリットル当たり100,000プラーク形成単位の濃度まで希釈した。130マイクロリットルの希釈ウイルスをトランスフェクトされた細胞の各ウェルに加えます。非感染細胞の井戸を陰性コントロールとして設定し、同じ量のウイルスを追加します。3日間の5%の二酸化炭素で38.5度の細胞をインキュベートします。ソートの前日には、各ウェルに20,000個の細胞を播種して2つの96ウェルプレートを準備します。感染後3日は、感染および感染したCefsを含む6つのウェルプレートを取り出す。各ウェルから培地を吸引し、PBSで細胞シートをすすいだ。各ウェルに0.05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを加え、約5分間5%の二酸化炭素で摂氏38.5度で細胞をインキュベートします。その後、FBSの50マイクロリットルで細胞を再懸濁し、この懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。5分間の重力の200倍の遠心分離機。1%FBSを含むPBSの1ミリリットルの細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、細胞密度を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整します。次に、ストレーナーキャップを通してポリスチレン選別チューブに細胞を移します。細胞ソーターを使用して、GFPを発現する単一細胞を、前播した96ウェルプレートに並べ替える。5日間5%の二酸化炭素で摂氏38.5度で選別された細胞でプレートをインキュベートします。5日後、蛍光顕微鏡を使用して96のウェルプレートをチェックし、単一のGFP陽性プラークを含む井戸をマークします。トリプシン-EDTAの50マイクロリットルを3分間、各GFP陽性を十分にトリプシン化します。その後、50マイクロリットルの培養培地を加えて細胞を再懸濁し、この懸濁液をCefsを備えた6つのウェルプレートの1つのウェルに移します。3日後、凍結培地中の組換えウイルスの第1世代の各バイアルを1つのバイアルを凍結した。これらの収穫されたウイルスを液体窒素に保管してください。ウイルスの第一世代のそれぞれから100,000細胞を収集します。2,000rpmで細胞を5分間遠心し、上清を捨てる。DNA抽出を行う準備ができるまで、細胞を20°Cの負の20度で保存します。DNA抽出を行う準備ができたら、50マイクロリットルのスクシッシングバッファーを使用して細胞ペレットを解凍し、再懸濁します。サンプルを摂氏65度で30分間、摂氏95度で2分間lyseしてプロテアーゼK.を不活性化し、テキストプロトコルに概説されているように、各DNAサンプルの1マイクロリットルを使用して3つの素因性接合プライマーでPCR反応を行います。2マイクロリットルの増幅産物をゲル電気泳動用の1%アガロースゲルの1ウェルにロードします。組換えウイルスからGFP遺伝子を除去するために、トランスフェクション試薬を用いて、CEF細胞を前もって6つのウェルプレートに2マイクロリットルのクレリコンビナーゼ発現プラスミドをトランスフェクトする。トランスフェクション後12時間、液体窒素から組換えウイルスのバイアルを1バイアを解凍する。ウイルスを穏やかに再懸濁し、50マイクロリットルをトランスフェクションされた細胞の各ウェルに再懸濁し、同じ量のウイルスで1つの陰性対照を設定する。3日間摂氏38.5度でインキュベートします。感染後72時間は、先に述べたように細胞を選別する準備をする。単一の非蛍光細胞を、CEFsを前にした96のウェルプレートに分類します。次に、選択したプラークをトリプシン化し、テキストプロトコルで概説されているように、対応するセルを再中断します。細胞の半分を第2世代としてCefsで前播した96のウェルプレートの各ウェルに渡します。各クローンの残りの細胞を重力200倍で5分間遠心分離する。上清を捨て、DNA抽出のために50マイクロリットルのスクッシュングバッファーで細胞を再懸濁します。次に、テキストプロトコルで概説されているように、1マイクロリットルのDNAテンプレートを用いて5つの素接合プライマーを用いてPCRを行う。PCRの結果に基づいて、さらなる通過および検証のために組換えHVTの3〜5個の陽性クローンを選択する。第一に、第2世代の組換えHVTを前播した24ウェルプレートにCefsに感染させる。感染後48時間で培養培地を除去し、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドをPBSに添加して細胞を固定する。室温で30分間インキュベートします。次に、固定剤を取り除き、PBSで細胞層を3回洗浄する。PBSを取り除き、0.1%トリトンX-100の500マイクロリットルを加え、細胞を透過させます。15分後に細胞層をPBSで3回洗浄した。非特定のバインドをブロックするには、1 時間のブロッキング バッファーを追加します。次いで、一次抗体抗体の抗体を希釈して抗体抗体をモノクローナル抗体HH7またはHVT感染鶏血清1〜200でブロッキング緩衝液で。希釈した一次抗体を200マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。細胞層をPBSで3回洗浄する。二次抗体ヤギ抗マウスIgG Alexa 568またはヤギの抗鶏IgG Alexa 488をブロッキングバッファーで1~200で希釈します。希釈した二次抗体を200マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。次いで、細胞をPBSで3回洗浄する。蛍光顕微鏡を使用して、タンパク質の発現を確認します。ウイルス拡張の前日に、各T25フラスコに260万個のCEF細胞が播種される。少なくとも3つの陽性クローンを解凍し、各フラスコに細胞またはウイルスのバイアルを1つ加える。50%の細胞パシー効果が観察されるまで、5%の二酸化炭素で38.5度でフラスコをインキュベートする。次に、培養培地の2ミリリットルで細胞を収穫する。次世代のためにCEF細胞を前もって播種した新しいT25フラスコに50マイクロリットルを感染させる。組換えウイルスを少なくとも15世代通過し続ける。PCRを使用して、VP2シーケンスの存在に対するウイルスの各生成を分析します。間接免疫蛍光アッセイを用いて、VP2発現の各生成ウイルスを分析する。単一細胞選別後、得られた精製ウイルスを3つの素接合PCRにより分析し、予想されるサイズのPCR産物を示す。クレリコンビナーゼによるGFPレポーターの切除後、50%以上のプラークがGFP発現を失った。GFP切除後の精製プラークは、単一細胞選別により得られ、さらに、期待されるサイズの産物を示す5つの素因性接合PCRによって確認される。次いで、VP2特異的モノクローナル抗体および抗HVT鶏血清による間接免疫蛍光アッセイによりタンパク質発現が確認されます。予想通り、親のHVTに感染した細胞は抗HVT血清によってのみ染色することができる。組換えHVT感染細胞は、VP2遺伝子の発現を明確に示す一方で。組換えウイルスを生成するために高トランスフェクション率は、ウイルスと挿入物が同じセル内で会う可能性を最大限に高めるために行われる編集が行われる必要があります。この手順に従って動物実験を行い、組換えワクチンの免疫原性および有効性を評価することができる。ここで説明するCRISPR/Cas9システムプラットフォームを用いた新しい多価ベクターワクチンの開発は、家禽産業が複数の家禽疾患から保護するために非常に有益です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

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頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。...

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

ここでは、遺伝子ノックアウト(KO)およびノックイン(KI)のプライマリヒトB細胞のCRISPR/Cas9ベースのゲノム工学に関する詳細なステップバイステッププロトコルを提供し、B細胞における遺伝子の生物学的機能とB細胞治療薬の開発を研究します。...

CRISPR/Cas9を用いた初等ヒトB細胞のゲノム工学

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

学ぶNHEJ-CRISPR/Cas9とCre-Loxシステムを統合した組換え鳥ヘルペスウイルス（HVT）ベクターワクチンの作製法。GFP可視化と細胞選別により効率的な多価ワクチン開発を実現します。

CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペスウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

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CRISPR/Cas9 組換え鳥ヘルペス ウイルスのベクトルを生成する遺伝子の編集

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