Name: サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶ リアルタイムPCRとガイド培養を組み合わせた高スループットスクリーニング法で、SalmonellaとShigellaの迅速かつ特異的な検出を実現します。視覚的なコロニー選択で精度を向上させ、公衆衛生分野の病原菌検出に応用可能です。

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この作品は、科学と技術プログラムの珠海、中国 (許可番号 20171009E030064)、科学と技術プログラムの広東省、中国 (許可番号 2015A020211004) と科学と技術プログラムの一般的な管理によって支えられました。品質監督、検査および中国 (許可番号 2016IK302、2017IK224) の共和国の検疫。

プロトコル珠海国際旅行健康管理センターの人間研究倫理委員会の定めたガイドラインに従います。実験中に標準的な滅菌操作を使用してください。
1 培地の組成と調製
<ol><li>栄養流体培養基の準備: 1% ペプトン、牛肉エキス 0.3%、0.5% 塩化ナトリウム、H2O で 0.1% ブドウ糖を溶解、7.5 とオートクレーブに pH 調整 121 ° C、15 分で。</li>
	<li>亜セレン酸シスチン メディアの準備: ディゾルブ 0.5% ペプトン乳糖 0.4%、1% Na2HCO30.4% 水素亜セレン酸ナトリウム、0.001% H2O、L シスチン 7.0 に pH を調整し、5 分間沸騰します。</li>
	<li>準備キシロース、リジン、デオキシ コール酸寒天 (XLD): ディゾルブ 0.3% 酵母エキス、0.5 %l-リジン、0.375% キシロース、0.75% の乳糖、0.75% スクロース、塩化ナトリウム 0.5%、0.008% フェノール レッド、0.68% チオ硫酸ナトリウム、0.08% ● クエン酸鉄アンモニウム、ナトリウム 0.25%H2O、1.5% 寒天デオキシ コール酸と pH 7.4 に調整。5 分間沸騰し、90 mm の板にそれを注ぐ。</li>
	<li>サルモネラ酵素基質寒天プレートを準備: 1.5% 寒天、0.7% ペプトン、酵母エキス、H2o. 1.29% 選択試薬を溶解5 分間沸騰し、90 mm の板にそれを注ぐ。</li>
	<li>寒天プレートを準備: 1% ペプトン、牛肉エキス 0.3%、0.5% 塩化ナトリウム、H2O、1.5% 寒天を溶解し、7.3 に pH を調整します。その後、オートクレーブ 121 ° C、15 分で 90 mm の板にそれを注ぐと。</li>
	<li>マッコンキー寒天培地 (MAC) 板を準備する: 溶解 2% ペプトン、1% の乳糖、塩化ナトリウム 0.5% 0.5% 牛胆汁酸塩、0.0025% 中立赤、1.5% 寒天、0.0001% H2O、クリスタル バイオレット 7.2 pH 調整と。オートクレーブ、115 ° C、20 分で、90 mm の板に注ぐ。</li>
</ol>2. リアルタイム PCR
<ol><li>サンプル コレクション<ol>
<li>患者の肛門にアナル綿棒を挿入 3-5 cm、周囲 360 ° に回転させます。</li>
		<li>アナル綿棒を滅菌採取管に入れます。マーク サンプルの ID</li>
		<li>できるだけ早く研究室にサンプルを送る。 注: サンプルは 4 ° C、24 h 以上で格納できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前濃縮<ol>
<li>コレクションの管で各サンプルに栄養流体培養基の 3 mL を加えます。</li>
		<li>インキュベーターで 6 h 36 ° C で孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>混合 (オプション) サンプル<ol>
<li>各事前集積培養の 100 μ L を収集し、以上 10 個のサンプルがある場合、1.5 mL チューブに 1 試料の 8-10 サンプルをミックスします。</li>
		<li>正しくマークします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA の抽出<ol>
<li>落ち着くのか、大きな粒子を許可するように 2 分間 800 x g で前培養を遠心し、新しい管、12,000 × g で 5 分間遠心する転送清吸引により上澄みを廃棄します。</li>
		<li>DNA 抽出液を 100 μ l 添加 (0.01 M pH 8.0 トリス-EDTA、0.01% ノニデット P 40 (NP40)) ペレットにします。1 分は積極的に渦。</li>
		<li>乾燥浴上で 5 分間 100 ° C で沸騰します。</li>
		<li>12,000 × g で 5 分間遠心する後続のリアルタイム pcr のテンプレートとなる新しいチューブを使用して上清を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>リアルタイム PCR<ol>
<li>反応混合物をセットアップに従ってください: 各サンプルの反応混合物各プライマーの 0.4 μ M、0.2 μ M の各プローブ (表 1のシーケンス)272.4.4、準備したテンプレートの 5 μ L x 2 の 12.5 μ l 添加し ddH2O 合計最大 25 μ L を追加するを使用して、 ボリューム。</li>
		<li>セットアップ以下の通りサイクリング プログラム: 95 ° C、3 分に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 秒、6-カルボキシ-フルオレセイン (FAM) と Hexachlorofluorescein (HEX) 伸長段階 (72 ° C) でチャンネルから 34 s. 収集蛍光信号のための 72 ° C自動的にによって蛍光リアルタイム PCR マシン。</li>
		<li>リアルタイム PCR 蛍光リアルタイム PCR マシン、器械の指示に従って実行します。</li>
		<li>ステップ 4 に進んで、ファム/六角チャンネルは、サンプルがサルモネラ属菌が陰性であることを意味で否定的な結果が発生した場合の負のレポートを発行/赤痢菌属</li>
		<li>肯定的な結果がサンプルはそれぞれサルモネラや赤痢菌属、肯定的な可能性があることを意味する HEX および/または家族のチャンネルで発生する場合は、3.1 および 3.2 の手順に進みます。 注: サンプルの混合を 2.3 の手順で実行されて場合、肯定的なものを作られた個々 のサンプルにリアルタイム PCR 行わなければならない現実肯定的なサンプルを選別します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ガイド文化
<ol><li>
サルモネラ属菌 PCR 陽性サンプル<ol>
<li>媒体の選択的な文化<ol>
<li>5 mL の試験管における亜セレン酸シスチン媒体に事前集積培養の 100 μ L を追加します。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>プレートの文化を分離すること<ol>
<li>マイクロ ループと文化の 1 つのループを収集し、XLD プレートまたはサルモネラ酵素基質寒天培地に広げます。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>生化学的同定<ol>
<li>XLD プレート (ピンク コロニー/暗い心なし; 暗いコロニー; 黄色コロニー/暗い心なし) またはサルモネラ酵素基質寒天培地の選択疑わしいコロニー (紫または prunosus のコロニー、丸く) (図 2)。</li>
			<li>対象楽器の指示に従っての自動微生物同定システムに関する生化学的同定の不審なコロニー。</li>
		</ol>
</li>
		<li>血清学的キャラクタリゼーション<ol>
<li>O 抗原の解析<ol>
<li>きれいなスライドに O 抗原多価血清 1 滴を加えます。</li>
				<li>マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。</li>
				<li>砂、流れるような場合 3.1.4.1.4 をステップに進む植民地は血清 (図 3) に反応。それ以外の場合、3.1.4.1.5 のステップに移動します。</li>
				<li>O 抗原一価血清を使用して、O 抗原の特徴まで 3.1.4.1.1 に 3.1.4.1.3 の手順を繰り返します。</li>
				<li>Vi の血清を使用して、3.1.4.1.1 に 3.1.4.1.3 の手順を繰り返します。管内それらの Vi の血清の反応性コロニーを収集し、乾燥風呂に 5 分間 100 ° C で沸騰します。12,000 × g で 5 分間遠心するは、O 抗原の特徴まで、ペレットと手順 3.1.4.1.4 に 3.1.4.1.1 を収集します。</li>
			</ol>
</li>
			<li>H 抗原解析<ol>
<li>きれいなスライドに H 抗原多価血清 1 滴を加えます。</li>
				<li>マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。</li>
				<li>砂、流れるような場合 3.1.4.2.4 をステップに進む植民地は血清に反応。</li>
				<li>H 一価血清を使用して、特定の H 抗原の特徴まで 3.1.4.2.1 に 3.1.4.2.3 の手順を繰り返します。 注: 時々 血清誘導は 2 番目のフェーズ H 抗原を特徴付ける必要かもしれない。もしそうなら、次のオプションの手順を実行必要があります。</li>
				<li>(省略可能)寒天プレート上に特定の H 抗原血清 1 滴を加えます。すべての血清が吸収されるまで待機します。</li>
				<li>(省略可能)特定の H 抗原の血清が吸収されるマイクロ ループとプレート上に広がりのあるコロニーの 1 つのループを収集します。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。</li>
				<li>(省略可能)H 一価血清を使用して、第 2 の H 抗原の特徴まで 3.1.4.2.1 に 3.1.4.2.3 の手順を繰り返します。</li>
				<li>手順 4 に進みます。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
赤痢菌属 PCR 検体が陽性<ol>
<li>プレートの文化を分離すること<ol>
<li>マイクロ ループと前濃縮文化の 1 つのループを収集し、XLD プレートまたは MAC 板の上に 。36 ° C、インキュベーターで 18-24 時間で孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>生化学的同定<ol>
<li>XLD プレート (滑らかな、円形の赤と透明のコロニー) または MAC 板 (滑らかな、円形、直径 2-3 mm の透明で無色のコロニーに疑わしいコロニーを収集します。赤痢菌体が大きくなり、インキュベーション時間の伸長とピンク光に回して) (図 4)。</li>
			<li>対象楽器の指示に従っての自動微生物同定システムに関する生化学的同定の不審なコロニー。</li>
		</ol>
</li>
		<li>血清学的キャラクタリゼーション<ol>
<li>きれいなスライドに赤痢菌属多価血清 1 滴を加えます。</li>
			<li>マイクロ ループと血清中に挽くコロニーの 1 つのループを収集します。</li>
			<li>砂、流れるような場合、3.2.3.4 をステップに進む植民地は血清に反応。</li>
			<li>赤痢菌属一価血清を使用して、特定の赤痢菌属の特徴まで 3.2.3.1: に 3.2.3.3 の手順を繰り返します。</li>
			<li>手順 4 に進みます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. レポート
<ol><li>上記の結果によると、正または負のレポートを発行します。</li>
</ol>

<ol><li>Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+acute+gastrointestinal+illness+in+developed+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries.</a> Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).</li>
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<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+12+Gastrointestinal+Pathogens+Spectrum+of+Acute+Infectious+Diarrhea+in+a+Sentinel+Hospital%2C+Shenzhen%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1926(2016).</li>
<li>Tariq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+antimicrobial+resistance+and+integron+association+of+multidrug-resistant+clinical+isolates+of+Shigella+species+from+Faisalabad%2C+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).</li>
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<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).</li>
<li>Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+multiplex+real-time+PCR+kit+Amplidiag%28R%29+Bacterial+GE+in+the+detection+of+bacterial+pathogens+from+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).</li>
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<li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States%2C+2003-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li>
<li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li>
<li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li>
<li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter%2C+Salmonella%2C+Yersinia%2C+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li>
<li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle%2C+pig+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li>
</ol>

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サルモネラ属菌以来/赤痢、食中毒や急性胃腸炎28,29の糞便口頭伝達に関連付けられてと定期的な方法は手間や時間がかかる7、サルモネラ属の高スループット プラットフォームについて述べる/赤痢菌属のスクリーニング、リアルタイム PCR を用いたガイド文化と組み合わせます。
このプラットフォームの機能を最大化への配慮を必要とするいくつかの手順があります。最初の 1 つは、(手順 2.2) の栄養流体培養基のサンプルの前濃縮ステップです。事前の雇用の間に収集されたとき一般的な 6 時間前濃縮のステップでアナル綿棒サンプルが必要とされるまだ明らかな症状は、下痢など、それらの患者から採取した糞便の前濃縮のステップは必要ありませんがそれらの人々 が主に健康や少なくとも無症候性の成人にも食料や水を扱うだろう人々 の身体検査。サルモネラ</...

下痢はまだ発生率が高いと一般的な健康問題レート1,2は、グローバルです。何人かの患者が週間 (ゆったりと水様便、バスルームに行き緊急) などの様々 な症状を示す死亡率が比較的低いが、経済効果の非常に高い3,4になります。もっと真剣に、一部の患者は過敏性腸症候群を開発可能性がありますも場合未処理5を左します。細菌、ウイルス、下痢6を引き起こす可能性が寄生虫の様々 な種類があります。サルモネラ属菌/赤痢、急性胃腸炎7,8,9,10,11の伝達のための最も一般的な細菌の中で。したがって、多くの郡が定期的サルモネラの法令を発行している/赤痢菌属は、食料や水の処理と人々 の間でスクリーニングします。たとえば、中国の政府は義務のサルモネラのための法律を発行している/赤痢菌属は、年に一度をスクリーニングします。
サルモネラ属菌の金本位法/赤痢菌属検出細菌文化。細菌文化と連続の生化学的同定と血清学的性状、を介して疾患アウトブレイク管理と抗菌薬の患者の治療を支援するためにプロファイリングを容易にすることができる細菌の種を識別できます。12.サルモネラ属中の感染のソースをトレースにも役立つかもしれない/赤痢菌属の発生13。ただし、このメソッドは、(手動操作を必要とする) 手間と時間のかかる (数日かけて)、特に多数のサンプル7のテストします。さらに、(VBNC)サルモネラ属菌培養が可能な/赤痢菌属がいくつかの糞便に存在する14。これらの欠点の観点から多くの実験室はサルモネラ属菌の検出のための新しい手法の開発を試してみました/赤痢菌属15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25します。 これらすべてのメソッドは、その中でポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は最も一般的な核酸増幅テスト (NAAT) を使用します。これらの NAAT ベースのメソッドの 1 つの主要な制限は死菌、細菌も破片含んでいる不完全なゲノム DNA が肯定的な結果26、主病の正確な診断に影響を与える可能性がありますを示すことができます。ブランコらは、その分子アッセイが可能なサルモネラの文化でも部分的なゲノムと過去の感染または汚染26から死んだまたは実行不可能な細菌だけではなく、機密性の高いを示しました。したがって、新しい技術を開発する必要があります。
ここでは、コンバイン、NAAT ベースの法と培養法について述べる。図 1に示すように、この新しいメソッドに適用されるリアルタイム PCR の最初のスクリーニング、細菌培養と同定のための肯定的なサンプルの送信されます。

<table><tbody><tr><td>トリス</td><td>シグマ</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td> シ<td>グマ</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>シグ</td><td>マ 11332473001</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>タカラ</td><td>9012</td><td></td></tr><tr><td>プライムスター HS (プレミックス)</td><td>タカラ</td><td>R040Q</td><td></td></tr><tr><td>ニュートリエントブロス</td><td>ランドブリッジ</td><td>CM106</td><td></td></tr><tr><td>栄養寒天</td><td>LandBridge</td><td>CM107</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸塩 シスチン 中</td><td>LandBridge</td><td>CM225</td><td></td></tr><tr><td>XLD</td><td>LandBridge</td><td>CM219</td><td></td></tr><tr><td>MAC&nbsp;</td><td>LandBridge</td><td>CM908</td><td></td></tr><tr><td>サルモネラ菌発色寒天</td><td>CHROMagar</td><td>SA130</td><td></td></tr><tr><td>サルモネラ診断血清</td><td>Tianrun</td><td>SAL60</td><td></td></tr><tr><td>赤痢菌診断血清</td><td>Tianrun</td><td>SHI54</td><td></td></tr><tr><td>肛門スワブ(採取チューブプラス)</td><td>Huachenyang</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>Mingsheng</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>マイクロループ</td><td>Weierkang</td><td>W511</td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ーJinghong</td><td>DNP-9082</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>AUL</td><td>SS-325</td><td></td></tr><tr><td>ドライバス</td><td>Jinghong</td><td>KB-20</td><td></td></tr><tr><td>自動微生物識別システム</td><td>bioM&eacute;rieux</td><td>VITEK2</td><td>他の同等のシステムが使用できる</td></tr><tr><td>蛍光リアルタイムPCRマシン</td><td>ThermoFisher</td><td>ABI7500</td><td>他の同等のマシンが使用可能</td></tr></tbody></table>

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

急性胃腸炎の糞口頭伝達発生時間の時間から、食料と水を処理する人がサルモネラ属/Shigella属菌に感染している場合は特にサルモネラ属/Shigella属菌の検出法のゴールド スタンダードは直接文化ですが手間と時間がかかる。ここでは、サルモネラ属/Shigella属菌スクリーニング、リアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 導かれた文化と組み合わせるを使用しての高スループット プラットフォームについて述べる。2 つの主要な段階があります: リアルタイム PCR とガイド付きの文化。最初のステージ (リアルタイム PCR)、我々 はメソッドの各ステップを説明する: コレクション、前濃縮、DNA の抽出、PCR のサンプルします。リアルタイム PCR の結果が肯定的な場合 (ガイド文化) の 2 番目の段階を実行: 選択的文化、生化学的同定と血清学的解析。我々 はまたそれから生成された代表的な結果を示しています。ここで説明されているプロトコルは、サルモネラ属菌の迅速な特定、機密、高スループット スクリーニングのための貴重なプラットフォームになる/赤痢菌属

サルモネラ属菌のスクリーニングに応用プロトコル/アナル便で赤痢が食料や水を扱うだろう人たちからサンプルします。
リアルタイム PCR のステップ図 5Aに示すようにあった混合サンプルは、サルモネラ属菌の陽性を意味する HEX チャネルに正常な拡大肯定的な 1 つをした個々 のサンプルにさらにリアルタイム PCR を行った。図 5Bのように、サンプル 2 は肯定的だった。したがって、サンプル 2 はサルモネラ属菌のガイド付きの文化に選ばれました図 5C、FAM チャンネルは、赤痢の混合サン...

サルモネラ赤痢は下痢に起因する一般的な病原体。ここでは、サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォームについて述べる/リアルタイム PCR を用いた赤痢ガイド文化と組み合わせます。

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

この方法は、サルモネラ菌およびシゲラのスクリーニングのためのハイスループットプラットフォームを提供する。この手法の主な利点は、繰り返し、特定、感度、および高スループットです。この技術は、リアルタイムPCRスクリーニングが最初に適用されたNAAT高速法と培養を組み合わせ、次いで細菌培養および同定のために陽性のものを送った。この方法はサルモネラ菌とシゲラスクリーニングに焦点を当てていますが、ビブリオ、ブドウ球菌、大腸菌、エトセトラなどの他の病原体にも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、サンプル中の背景の植物相のために正しいコロニーの選択が困難であるため、重要である。まず、各サンプルに3ミリリットルの栄養スープを加えます。その後、サンプルを摂氏36度で6時間インキュベートします。この後、800gsで2分間前濃縮培養を遠心分離する。その後、上清を新しいチューブに移し、12,000gsで5分間再び遠心分離します。上清を捨て、100マイクロリットルのDNA抽出液をペレットに加えます。その後、チューブを1分間渦を出します。次に、乾燥浴で1,000°Cでサンプルを加熱します。遠心分離を繰り返した後、上清を新しいチューブに集めます。まず、反応混合物を作成し、テキストプロトコルに従ってサイクリングプログラムを設定します。次に、蛍光リアルタイムPCR機でリアルタイムPCRを実行します。まず、プレエンリッチメント培養液の100マイクロリットルを5ミリリットルのセレン化結晶培地に添加する。その後、18〜24時間摂氏36度で培養します。次に、培養物のループを1つ集めて、皿に広げます。その後、18〜24時間摂氏36度でプレートをインキュベートします。インキュベーション後、疑わしいコロニーを選択し、プレートに移します。18~24時間、36°Cでプレートをインキュベートします。次に、自動化された微生物識別システムを使用して不審なコロニーを識別する。O抗原の特徴付けを開始するには、O抗原多価セラの1滴をきれいなスライドに加えます。コロニーの1つのループをスライドに移し、セラで粉砕します。細菌が流れる砂のように見える場合は、抗原が特徴になるまでO-抗原一価セラで前処理を繰り返します。H抗原の特徴付けを開始するには、クリーンスライドにH抗原多価セラを1滴加えます。その後、コロニーの1ループを収集し、セラでそれをグリッドします。特定のH-抗原が特徴になるまで処理を繰り返すためにH-抗原一価セラを使用します。培養を分離するには、濃縮前培養のループを1つ集めてプレートに広げる。その後、18〜24時間摂氏36度で場所をインキュベートします。インキュベーション後、不審なコロニーをプレートに集めます。17〜24時間摂氏36度でプレートをインキュベートします。次いで、コロニーを、自動化された

a-high-throughput-platform-for-screening-salmonella-sppshigella

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免疫学と感染症

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

私達は中の真菌エンドグルカナーゼ活性をスクリーニングするために、低コスト、高スループットの方法を説明します...

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

出典:Yang, Z., 他サルモネラ属/シゲラ属のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム。J. Vis. Exp.(2018年)この動画では、キシロースリシンデオキシコール酸(XLD)と染色性寒天を用いた サルモネラ の選択的濃縮と同定を示しています。セレナイトブロスは サルモネラ...

キシロースリジンデオキシコールレートおよびクロモジェニック寒天を用いたサルモネラ属の選択的濃縮と同定

インビトロ表現型サルモネラまたは他の細菌関連性、浸潤、および高スループット能力を有する食細胞での複製にハイスループットアッセイを開発した。方法は、宿主-病原体相互作用におけるそれらの関与がためにサルモネラ遺伝子ノックアウト変異株を評価するために使用した。...

表現型のハイスループットアッセイサルモネラ菌ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール...

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

血清中の抗体のShigellacidal活性を測定するためのプロトコルをご紹介します。血清は細菌培養、外因性の補足物と混合され、寒天版で反応混合物をメッキします。細菌はカウント、自動コロニー列挙子を使用して、殺菌力価を決定するために使用のコロニーを形成します。...

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。...

動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

腸内微生物は、特定のまたは保存されたメカニズム を介して 宿主の健康にプラスまたはマイナスの影響を与える可能性があります。 カエノラブディティスエレガンスは 、そのような微生物をスクリーニングするための便利なプラットフォームです。本プロトコルは、線虫の健康状態の代理として使用される、線虫ストレス耐性への影響についての48の細菌分離株のハイスループットスクリーニングを記載している。...

カエノラブディティス・エレガンスの健康に影響を与える微生物分離物のハイスループットスクリーニング

ここでは、インテリジェントなハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの原理、構造、および指示を紹介します。その応用例は、中国山東省の家禽から分離された サルモネラ菌...

インテリジェントハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの適用と薬剤耐性指数

このプロトコルは、産業用微生物向けの標準的な高スループットスクリーニングワークフローを提供します。これはARTP変異誘発による変異体ライブラリの構築、自動マイクロ流体解析による陽性液滴スクリーニングを行い、その後結果を検証する過程を含みます。ワークフローの信頼性は、高収量の B. coagulans...

自動液滴マイクロ流体プラットフォームを用いたL-乳酸高産生 バチルス凝固変 異体の高スループットスクリーニング

学ぶ リアルタイムPCRとガイド培養を組み合わせた高スループットスクリーニング法で、SalmonellaとShigellaの迅速かつ特異的な検出を実現します。視覚的なコロニー選択で精度を向上させ、公衆衛生分野の病原菌検出に応用可能です。

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループットプラットフォーム/赤痢菌属

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