低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル
2018年8月3日
ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。
この方法は、腫瘍免疫学における好中球亜集団の役割、特に腫瘍転移における好中球細胞外トラップ(NET)の機械的関与に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、腫瘍細胞と無傷のNETへの接着相互作用を視覚化できることです。この技術の意味は、がんの治療にまで及びます。
特定のニュートロフィルサブセットに由来するNETは腫瘍転移を促進する可能性があるためです。その手順を実演していただくのは、当研究室の翔尾原淳子さんです。好中球を取得するには、まず、胃腸悪性腫瘍のために腹部手術を受けたばかりの患者の腹腔内に直接、創傷閉鎖直前に1リットルの正常な滅菌生理食塩水を注入し、少なくとも1分間腹腔内を広範囲に洗浄します。
次に、キャビティ内の生理食塩水を攪拌し、4つの50ミリリットルの注射器で200ミリリットルの洗浄液を回収します。ラボでは、腹膜洗浄液を100マイクロメートルのナイロンフィルターを介して個々の50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。0.02%EDTAを添加した5ミリリットルのPBSにペレットを再懸濁し、各細胞懸濁液を3ミリリットルの密度勾配溶液に慎重に重ねます。
密度勾配分離後、各チューブから2〜3ミリリットルの中間層を採取し、チューブあたり10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAで腹膜液サンプルを洗浄します。ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAでプールして追加の洗浄を行い、細胞を磁気活性化細胞選別(MACS)緩衝濃度60マイクロリットルあたり10〜7番目の細胞の1倍に希釈します。20マイクロリットルのFcブロックで4°Cで10分間ブロックし、その後20マイクロリットルの抗CD66b磁気ビーズを添加して、非特異的結合をブロックします。
摂氏4度で10分後、細胞を500マイクロリットルのMACSバッファーに洗浄して再懸濁し、適切な磁気セパレーターの磁場内で適切なサイズの磁気カラムに細胞を添加します。すべてのCD66bネガティブセルがカラムを通過したら、15ミリリットルの新鮮なMACSバッファーをカラムリザーバーに加え、マグネティックセパレーターから新しい円錐管にカラムを移します。その後、すぐにカラムを突っ込んで、磁気標識されたCD66b陽性をチューブにフラッシュします。
遠心分離後、単離された低密度好中球を、FBS濃度を補充した培地の1ミリリットルあたり10〜6細胞分の5倍で再懸濁しRPMI1640 6ウェルポリ-L-リジンコーティングプレート上にウェルあたり1ミリリットルの好中球をシードします。摂氏37度および5%二酸化炭素で2時間後、各ウェル内の細胞を適切な蛍光膜不透過性の核および染色体色素でメーカーの指示に従って染色し、直ちに蛍光顕微鏡でNETの形態を観察します。NETへの腫瘍細胞の接着を評価するには、対照的な蛍光色素で染色した胃腫瘍細胞を、0.1%ウシ血清アルブミン濃度を添加したRPMI1640 1ミリリットルあたり10〜6回で再懸濁し、低密度好中球培養の各ウェルに1ミリリットルの腫瘍細胞を添加します。
摂氏37度で5分後、各ウェルから上清を取り除き、BSAを添加した2ミリリットルの温めたRPMI1640培地で細胞を2回穏やかに洗浄します。5分間のインキュベーションは、NET固有のバインディングを検出するのに十分な長さです。温めた培地を各ウェルの側面に加え、プレートをゆっくりとゆっくりと渦巻き、吸引器で上清を取り除きます。
その後、NETと付着した腫瘍細胞を蛍光顕微鏡で観察することができます。トラップされた腫瘍細胞のタイムラプスビデオ分析のために、35ミリメートルの皿で腹膜低密度好中球を培養し、染色します、ポリ-L-リジンコーティングされた皿、実証されたように、0.1%BSAとRPMI1640の2ミリリットルで短時間洗浄します。培地を、BSAを添加した2ミリリットルのRPMIに懸濁した10〜6番目の未染色胃腫瘍細胞を1回交換し、室温で5分間インキュベーションします。
インキュベーションの最後に、BSAを添加した2ミリリットルの新鮮なRPMIで室温で5分間細胞をすすぎ、続いて穏やかに渦巻いて付着していない腫瘍細胞を取り除きます。その後、上清をFBSと抗生物質を添加したDMEMに交換し、NETsによる腫瘍細胞トラップのタイムラプス解析のために、全景細胞観察システムにディッシュを取り付けます。2時間の培養後、腹膜洗浄液由来のCD66b陽性低密度好中球は、緑色蛍光核および染色体染色によりストリング構造を示しますが、CD66b陰性単核細胞は示しません。
しかし、低密度好中球培養物を1ミリリットルあたり100単位のDNAse Iで前処理すると、好中球から排出された細胞外DNAによって構造が構成されていることを示す特性構造が破壊されます。低密度好中球をコーティングされていないプラスチックプレートで培養すると、皿の底に付着したNETがほとんどなく、培地内に多くのNETクラスターが浮遊していることが観察できます。蛍光標識された胃腫瘍細胞株とのインキュベーションを5分間行った後、多くの腫瘍細胞がNET内の好中球に付着しますが、これはDNAse I.での前処理後には観察されない現象です。
OKUM-1およびNUGC-4。興味深いことに、NETは長時間の腫瘍細胞共培養から数時間以内に徐々に消失しますが、NETに捕捉された腫瘍細胞はNETの放出後に活発に増殖し始めます。この手順では、NETがプレートに弱く付着するため、洗浄と皿の移し替えプロセスは特に慎重に行う必要があることを覚えておくことが重要です。
この技術の開発後、生物医学のさまざまな分野の研究者が、血栓症、全身性炎症反応症候群、自己免疫疾患などのさまざまな疾患とNETsの因果関係を探求する道を開きます。
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概要
この記事では、術後の腹腔洗浄液から人間の低密度好中球（LDN）を回収する手法を提示します。LDNは遊離腫瘍細胞を捕捉する好中球細胞外トラップ（NETs）を産生します。この技術は、腫瘍免疫学と転移における好中球サブ集団の役割を理解するのに役立ちます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- がん生物学
背景
- 好中球は免疫反応において重要な役割を果たします。
- 低密度好中球（LDN）は、独特の機能を持つ特定のサブ集団です。
- 好中球細胞外トラップ（NETs）は腫瘍の進行に影響を与える可能性があります。
- これらの相互作用を理解することで、がん治療に情報を提供することができます。
研究の目的
- 腫瘍免疫学におけるLDNの役割を調査すること。
- 腫瘍転移におけるNETsの機械的関与を探ること。
- NETsと腫瘍細胞の相互作用を可視化すること。
使用した方法
- 術後の腹腔への無菌生理食塩水の注入。
- 好中球を回収するための腹腔の広範囲な洗浄。
- 腫瘍細胞との好中球の相互作用の分析。
- NET形成を観察するための可視化技術。
主な結果
- LDNは多量のNETsを産生します。
- NETsは遊離腫瘍細胞を効果的に捕捉します。
- この方法により、NETsへの腫瘍細胞の接着を可視化することができます。
- 得られた知見は、がん治療戦略に影響を与える可能性があります。
結論
- この技術は、がんにおける好中球の役割の理解を深めます。
- 腫瘍転移に関する将来の研究の枠組みを提供します。
- がん治療におけるNETs標的の潜在的な治療効果の可能性。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization of neutrophil extracellular trap (NET)-mediated tumor cell adhesion, providing mechanistic insight into a pro-metastatic pathway. By isolating low-density neutrophils from postoperative peritoneal lavage, the approach models a clinically relevant neutrophil subpopulation implicated in cancer progression. The technique supports target validation by demonstrating how NETs facilitate tumor cell trapping and subsequent growth, informing de-risking strategies in immuno-oncology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the hypothesis that NETs promote tumor cell attachment and growth, enabling functional validation of NETs as therapeutic targets.
- Operational Value: Uses patient-derived low-density neutrophils to enhance physiological relevance in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a quantitative, imaging-based assay to measure tumor cell adhesion to NETs under controlled conditions.
- Operational Value: Enables standardization of NET formation and tumor cell co-culture for reproducible screening of modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models a disease-relevant system using human peritoneal lavage-derived neutrophils to study NET-tumor interactions in gastrointestinal cancer.
- Operational Value: Supports longitudinal observation of tumor cell proliferation post-NET release, linking early adhesion events to downstream growth.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by providing mechanistic readouts that inform target validation and assay development for metastasis-modulating therapies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of NETs in tumor cell trapping and growth, clarifying pro-metastatic mechanisms.
- Screening: Generates quantitative adhesion and proliferation readouts to assess compound effects on NET-tumor interactions.
- Analytics: Produces fluorescence-based measurements of tumor cell attachment and NET degradation, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Uses primary human neutrophils from cancer patients to enhance relevance for preclinical continuity in immuno-oncology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating NET-targeting agents across tumor types and neutrophil subsets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking by validating NETs as drivers of tumor cell adhesion and growth.
- Operational Value: Delivers a standardized, visualization-based assay with defined readouts for NET formation and tumor cell engagement.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying NET-dependent metastasis mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of NET-inhibiting therapeutics based on functional validation in human-derived systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neutrophil isolation, density gradient separation, and magnetic activated cell sorting.
- Dependent on access to postoperative peritoneal lavage fluid and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of NET induction and tumor cell co-culture timing across laboratories.
- Requires optimization for different tumor cell lines and neutrophil activation states.
- Limited by the transient nature of NETs and potential donor variability in low-density neutrophil yield.
