Name: 低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ低密度好中球由来の細胞外トラップ（NETs）を用いた腫瘍細胞捕獲と接着の可視化手法。腹腔洗浄液から好中球を回収し、がん転移メカニズムの解明に貢献する。

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技術と事務作業、さん j. 篠原と I. Nieda に感謝します。また、松本史朗夫妻、秀典春田、倉科健太郎、高橋一也は、手術室でのサンプルの収集への協力を感謝いたします。この仕事は、学術振興 (17 K 10606) 教育省、科学、スポーツ、日本文化と日本社会科学研究費補助金によって支えられました。

LDN は本研究で登録された患者から得られたし、制度的レビュー ボードの自治医科大学によって承認されました。
1. 腹腔内洗浄と純の検出から LDN の分離
<ol><li>サンプルの収集<ol>
<li>消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。 注: サンプルは、年齢や性別に基づくバイアスのない胃切除術、結腸切除術、または食道切除術を受けた患者から得られました。生理食塩水は、コンテナーに転送され、注がれる腹部全体 1 分以内。これは日常的に患者に重大な影響なし術後腹腔洗浄として実行されます。</li>
		<li>少なくとも 1 分間広く腹腔洗浄液。 注: サンプルが均一なので、外科医の手でゆっくりと、注入液攪拌はそれをお勧めします。</li>
		<li>4 50 mL 注射器洗浄液 200 mL を回復します。 注: 時々 ゴム コネクタが流体を取るされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>顆粒球特定 mAb、CD66b16を使用して腹膜の LDN の浄化を実行します。 注: 密度勾配遠心後の中間層には、多くの単核細胞が含まれています、CD66b モノクローナル抗体を用いた多形体好中球の正の選択を行った。<ol>
<li>腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。 注: この手順では、不純物を除去する 100 μ m ナイロン フィルターを通して流体を渡します。</li>
		<li>室温 7 分 270 x g で腹水を遠心分離します。</li>
		<li>5 mL の 0.02 %edta で PBS でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>慎重に 3 mL 密度勾配ソリューションに細胞懸濁液 5 mL をオーバーレイします。</li>
		<li>休憩なしの常温 15 分 1,700 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>2 〜 3 mL のピペットを使用して中間層 (図 1 a) を含む溶液を収穫し、10 ml の PBS の 0.02 %edta のミックスします。</li>
		<li>RT で 7 分の 400 x g で腹水を遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>破棄した上清で 7 分間 270 x g で 0.02 %edta と遠心分離機の PBS の別の 10 mL を追加します。</li>
		<li>磁気細胞分離キット用のバッファーの 60 μ L 細胞ペレット (1 x 10 の7) を溶かしてください。</li>
		<li>ペレットに Fc ブロックの 20 μ L を加え、4 ° C で 10 分間インキュベート</li>
		<li>反 CD66b の 20 μ L マイクロ ビーズと共役し、4 ° C でさらに 10 分間インキュベートを追加します。</li>
		<li>洗浄し、再 MAC バッファーを 500 μ l 添加の餌を中断します。</li>
		<li>磁気セパレーターの磁場中磁気列に細胞懸濁液を適用し、15 mL のバッファーとカラムを洗浄することにより、流れを含んでいる CD66b(-) 細胞を収集します。</li>
		<li>磁選機から列を削除して、しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識 CD66b(+) 細胞をすぐに洗い流します。 注: CD66b(+) セル人口を示す FACS 解析によって決定される好中球のほとんどで構成されています > CD66(+) 分画の 95% は CD11b、CD15、CD16 に肯定的な CD14 の負。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ネットの世代<ol>
<li>RT で 7 分間 270 × g で遠心分離後再分離の LDN を中断 (5 x 106) 1 ml の 10% の FCS で RPMI1640。</li>
		<li>6 ウェル ポリ-L-リジン コーティング プレート (直径 6 cm) 5% CO2の 37 ° C で 2 時間の LDN を文化します。</li>
		<li>5 μ M の最終的な集中に蛍光グリーンの対比染色 (核や染色体を染色する膜不透過性色素) を追加します。</li>
		<li>すぐにネット (蛍光顕微鏡下で LDN から追放するものと細胞外 DNA コンポーネント) の形態を観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 赤い蛍光細胞リンカー染付腫瘍細胞の染色
<ol><li>ひと癌細胞株 MKN45、NUGC、および OCUM 1 を準備します。</li>
	<li>1 x 10 の7セル PBS + 15 の mL の管、室温 7 分 270 × g で遠心分離で 0.02 %edta を洗う</li>
	<li>ペレット、染色色素の溶液 1 mL を追加し、そっとピペットします。</li>
	<li>赤蛍光細胞リンカー色素染色溶液 1 mL に 4 μ L を溶解し、2.2 の段階から細胞懸濁液と混ぜます。</li>
	<li>室温 4 分のペレットを孵化させなさい</li>
	<li>DMEM の 4 つの mL を追加 (10 %fbs) 染色反応を停止します。</li>
	<li>7 分 270 × g を遠心し、上清を捨てます。</li>
	<li>2.6 および 2.7 の手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡で確認 (励起 = 551 nm、出力 = 567 nm) 腫瘍細胞が赤を染色します。</li>
</ol>3. 癌細胞接着のネットの解析
<ol><li>1 ml 0.1 %bsa 添加 RPMI 1640 の赤蛍光染色腫瘍細胞 (1 x 106) を再停止します。</li>
	<li>手順 1.3 で説明したように網を作り出した LDN 文化に腫瘍細胞を追加します。</li>
	<li>回路網に接触する腫瘍細胞を可能にする、37 ° C で 5 分間インキュベートします。 注: 長い潜伏癌細胞接着の LDN またはプレートを誘導します。</li>
	<li>メディアを取り出して、皿を旋回を prewarmed メディア (0.1 %bsa + RPMI 1640) 2 mL を追加して優しく洗浄します。</li>
	<li>手順 3.4 では洗濯の手順を 2 回繰り返します。 注: ネットから弱アタッチ プレート、網自体の除去を避けるためにできるだけ優しく洗浄を行う必要があります。</li>
	<li>核と染色体 5 μ G/ml 網の可視化のための最終的な集中での汚損のため緑の蛍光染料を追加します。</li>
	<li>網を観察し、適切なフィルターを使用して腫瘍細胞を添付 (緑、励起 = 504 nm、発光 = 523 nm; 赤、励起 = 551 nm、出力 = 567 nm)。</li>
	<li>ネットで閉じ込められている腫瘍のセルを表示する数字をマージします。 注意: いくつかの実験で DNA 分解酵素追加されました LDN 文化 (最終濃度 100 U/mL) に 5 分 5 分の共同培養前に、。</li>
</ol>4 閉じ込められた腫瘍細胞の時間経過ビデオ解析
<ol><li>35 mm で腹膜の LDN の文化はラウンド被覆ポリ L リジン手順 1.3 で説明した料理です。</li>
	<li>核と 1.3 の手順で説明されているようにネットを可視化する染色体の汚損のため緑の蛍光染料を追加します。</li>
	<li>インキュベーションの 1 分後にメディアを取り出し、0.1 %bsa + RPMI 1640 2 mL を加えます。</li>
	<li>メディアを取り出し、無染色 1 × 106 MKN45 セル中断 0.1 %bsa + RPMI 1640 を追加します。右で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>手順 3.4 で優しく洗浄することにより任意の未接続の腫瘍細胞を除去し、100 u/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ添加 10 %fcs を DMEM を追加します。</li>
	<li>全体ビューのセルの観測システムで培養皿をマウントし、腫瘍細胞が網によって閉じ込められている適切なフィールドを選択します。</li>
	<li>2 日間をさらに共培養し、フィールドの連続撮影通常の光と MKN45 細胞と網をそれぞれ検出する蛍光の下 6 分毎に進みます。</li>
	<li>各 timepoint でイメージを重ね合わせ、画像ビューアーのソフトウェアを使用して、時間経過のビデオを作成します。</li>
</ol>

<ol><li>Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+acute+rheumatic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever.</a> Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).</li>
<li>Denny, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li>
<li>Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+low+density+subpopulations+and+CD10+%28CALLA%29+negative+neutrophils+in+severely+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery+Today%22%5BJournal%5D)">The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients.</a> Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).</li>
<li>Schmielau, J., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+granulocytes+and+granulocyte-derived+hydrogen+peroxide+are+the+underlying+mechanism+of+suppression+of+t-cell+function+in+advanced+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients.</a> Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+granulocytes%3A+a+distinct+class+of+neutrophils+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity.</a> Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li>
<li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2013).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Monti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+cell+adhesion+to+neutrophil+extracellular+traps+through+engagement+of+fibronectin+in+neutrophil-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells.</a> Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).</li>
<li>Najmeh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+via+beta1-integrin+mediated+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions.</a> International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Human+Neutrophil+Extracellular+Traps+%28NETs%29+Isolation+and+Handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
<li>Kanamaru, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+neutrophils+%28LDN%29+in+postoperative+abdominal+cavity+assist+the+peritoneal+recurrence+through+the+production+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).</li>
<li>Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+transgenic+for+the+human+CGM6+gene+express+its+product%2C+the+granulocyte+marker+CD66b%2C+exclusively+in+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes.</a> Blood. 91 (2), 663-672 (1998).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

以前の研究は、10、生体内で純基板11循環腫瘍細胞をトラップできることを報告しています。転移性乳癌細胞は、好中球を刺激しターゲット器官17の腫瘍細胞の成長を支援するネットの形成を誘導する示されています。さらに、術後の洗浄液から LDN の短期的な文化が効率的にさらに刺激15せず腫瘍細胞をわなに掛けることができる大規模な網を生産がわかった。これらの観察は、転移のプロセスでネットの機械的介入のための可能な役割をお勧めします。ただし、ネットと腫瘍細胞の接着剤の相互作用を仲介する詳細な分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近の研究は、接着基板12,13として活性化好中球から分離されたネットの在庫を使用してこのプロセスでインテグリンの関与関与しています。ただし、精製と濃縮のネット コンポーネントは...

循環血液における多形核好中球は通常単核細胞から密度グラデーション製法によって区切られます。ただし、CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)、および CD14(-) の表現型を持つ低密度好中球 (LDN) として知られているいくつかの好中球、単核細胞と共同浄化されました。LDN の相対数は、大幅自己免疫疾患1、2敗血症3がん4,5など様々 な病態で増加します。以前の研究では、LDN が好中球6の表現型と機能別のクラスであることを示しています。循環血液で LDN は通常の密度好中球2,7より好中球細胞外トラップ (網) を生成する可能性が高いことに注意してください。ネットは核酸、ヒストンやプロテアーゼ、粉粒体、ゾル性細胞質蛋白質から成る web のような構造であり、彼らは効率的にわなに掛けることができる病原体8を破壊して。
最近では、ネットをキャプチャだけでなく、微生物も血小板、血栓形成9および腫瘍転移10,11に役立つ腫瘍細胞を循環する示されています。しかし、ネットと血小板または腫瘍細胞間接着剤の相互作用の背後にある分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近では、体外で接着アッセイは、骨髄性白血病細胞 (K56212) および肺癌細胞 (A54913) が β3 と β 1 インテグリンを介してネットに接続するを明らかにしました。著者には、好中球由来及びホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 接着基板14によって活性化ネット ストックが使用されます。かどうかの生産網と同じ分子構造を保持"由来の無細胞ネット証券「高速遠心分離によって分離されたこのアッセイは、好中球の不在で NET コンポーネントと現実の相互作用の検出を使用できますが、それは議論の余地vivo。最近、我々 は腹部手術に含まれる大規模な網を生成、腹膜転移15を引き起こす腫瘍細胞に接続されている多くの成熟した LDN 後その腹腔洗浄液を発見します。本研究では、物理的な操作をすることがなくそのままネットへの腫瘍細胞の接着を調べた正常に。ネットと無料の腫瘍細胞間接着の相互作用を検出する技術の詳細を紹介します。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GEヘルスケア、スウェーデン</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>StraightFrom&trade;全血CD66b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ</td><td>130-104-913</td><td></td></tr><tr><td>fc block</td><td>Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>MACS リンス溶液</td><td>Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA ストック ソリューション</td><td>Miltenyi Biotec、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>MACS Magnetic Separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td><td>130-042-501</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO,米国</td><td>P9691</td><td></td></tr><tr><td>希釈剤C</td><td>シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td>CGLDIL</td><td></td></tr> RPMI1640<tr><td>ミディアム</td><td>シグマ-アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州</td><td>、米国R8758</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ's モディファイド イーグル ミディアム ハイ グルコース (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5mol/l-EDTA溶液(pH 8.0)</td><td>nacalai tesque, Japan</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions</td><td>gibco by life technologies, Mexico</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin lyofriized powder, &ge;96% (アガロースゲル電気泳動)</td><td>Sigma-Aldrich, StLouis, MO, USA</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies Japan</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin Prophylactic</td><td>InvivoGen, San Diego, CA-USA</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington, Lakewood NJ)</td><td>LS002138</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well</td><td>岩城, 日本</td><td>4810-040</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well</td><td>岩城市</td><td>4820-040</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン実体顕微鏡</td><td>BX8000, キーエンス, 大阪市</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>全景細胞観察システム</td><td>ニコン, 神奈川県, 日本</td><td>BioStudio (BS-M10)</td><td></td></tr><tr><td>MKN45 ヒト胃がん細胞株</td><td>理化学研究所, 筑波大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NUGC-4 ヒト胃がん細胞株</td><td>理化学研究所, 筑波大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>OCUM-1 ヒト胃がん細胞株</td><td>大阪市立大学, 日本</td><td>N/A</td><td>Gift from Dr. Yashiro</td></tr></tbody></table>

低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル

Neutrophil Extracellular Traps Generated by Low Density Neutrophils Obtained from Peritoneal Lavage Fluid Mediate Tumor Cell Growth and Attachment

好中球リリース好中球細胞外トラップ (網) を取り込んで微生物を破壊することができますをアクティブ化します。最近の研究では、ネットがさまざまな病気プロセス、自己免疫疾患、血栓症、腫瘍の転移などに関与していることを示唆しています。ここで、網に付着後成長無料腫瘍細胞の捕捉中にネット活動を検出する詳細な培養技術を紹介します。第 1 に、開腹症例から術後腹腔洗浄液から低密度好中球 (LDN) を集めました。LDN の短期養殖緑蛍光核と染色体の対比染色に視覚化された大規模なネット形成で起因しました。ひと胃癌細胞株ネットと NUGC 4、OCUM 1、MKN45 の共同培養後多くの腫瘍細胞は網によって閉じ込められました。その後、添付ファイルは、DNase I. 低速度撮影ビデオは網によって閉じ込められている腫瘍細胞が死んでいなかったこと明らかに取り付けた網の劣化によって完全に廃止されたが、代わりに連続培養における旺盛します。これらのメソッドは、ネットとセルと材料の様々 なタイプの接着剤の相互作用の検出に適用可能性があります。

2 時間の文化で腹膜灌流液の示した文字列の構造から派生した CD66b(+) LDN の緑色蛍光色素で染色核と染色体 (図 1 b) CD66b(-) 単核細胞がいない中 (図 1)。ただし、前処理は LDN 文化 100 U/mL DNase 私は、特徴的な構造は破壊 (図 1)、彼らが好中球から追放された細胞外 DNA で構成されていたことを示します。LDN はコーティングに浮かぶ多くの NET クラスターなしプラスチック プレートで培養したとき (図 1E) の下にいくつかネット メディアは観察されました。
次に、ネットに腫瘍細胞の接着性を調べる MKN45 セルの赤色蛍光色素で標識された網に追加し、5 分イン...

ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。

Activated neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which can capture and destroy microbes. Recent studies suggest that NETs are involved ...

この方法は、腫瘍免疫学における好中球亜集団の役割、特に腫瘍転移における好中球細胞外トラップ(NET)の機械的関与に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、腫瘍細胞と無傷のNETへの接着相互作用を視覚化できることです。この技術の意味は、がんの治療にまで及びます。特定のニュートロフィルサブセットに由来するNETは腫瘍転移を促進する可能性があるためです。その手順を実演していただくのは、当研究室の翔尾原淳子さんです。好中球を取得するには、まず、胃腸悪性腫瘍のために腹部手術を受けたばかりの患者の腹腔内に直接、創傷閉鎖直前に1リットルの正常な滅菌生理食塩水を注入し、少なくとも1分間腹腔内を広範囲に洗浄します。次に、キャビティ内の生理食塩水を攪拌し、4つの50ミリリットルの注射器で200ミリリットルの洗浄液を回収します。ラボでは、腹膜洗浄液を100マイクロメートルのナイロンフィルターを介して個々の50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。0.02%EDTAを添加した5ミリリットルのPBSにペレットを再懸濁し、各細胞懸濁液を3ミリリットルの密度勾配溶液に慎重に重ねます。密度勾配分離後、各チューブから2〜3ミリリットルの中間層を採取し、チューブあたり10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAで腹膜液サンプルを洗浄します。ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAでプールして追加の洗浄を行い、細胞を磁気活性化細胞選別(MACS)緩衝濃度60マイクロリットルあたり10〜7番目の細胞の1倍に希釈します。20マイクロリットルのFcブロックで4°Cで10分間ブロックし、その後20マイクロリットルの抗CD66b磁気ビーズを添加して、非特異的結合をブロックします。摂氏4度で10分後、細胞を500マイクロリットルのMACSバッファーに洗浄して再懸濁し、適切な磁気セパレーターの磁場内で適切なサイズの磁気カラムに細胞を添加します。すべてのCD66bネガティブセルがカラムを通過したら、15ミリリットルの新鮮なMACSバッファーをカラムリザーバーに加え、マグネティックセパレーターから新しい円錐管にカラムを移します。その後、すぐにカラムを突っ込んで、磁気標識されたCD66b陽性をチューブにフラッシュします。遠心分離後、単離された低密度好中球を、FBS濃度を補充した培地の1ミリリットルあたり10〜6細胞分の5倍で再懸濁しRPMI1640 6ウェルポリ-L-リジンコーティングプレート上にウェルあたり1ミリリットルの好中球をシードします。摂氏37度および5%二酸化炭素で2時間後、各ウェル内の細胞を適切な蛍光膜不透過性の核および染色体色素でメーカーの指示に従って染色し、直ちに蛍光顕微鏡でNETの形態を観察します。NETへの腫瘍細胞の接着を評価するには、対照的な蛍光色素で染色した胃腫瘍細胞を、0.1%ウシ血清アルブミン濃度を添加したRPMI1640 1ミリリットルあたり10〜6回で再懸濁し、低密度好中球培養の各ウェルに1ミリリットルの腫瘍細胞を添加します。摂氏37度で5分後、各ウェルから上清を取り除き、BSAを添加した2ミリリットルの温めたRPMI1640培地で細胞を2回穏やかに洗浄します。5分間のインキュベーションは、NET固有のバインディングを検出するのに十分な長さです。温めた培地を各ウェルの側面に加え、プレートをゆっくりとゆっくりと渦巻き、吸引器で上清を取り除きます。その後、NETと付着した腫瘍細胞を蛍光顕微鏡で観察することができます。トラップされた腫瘍細胞のタイムラプスビデオ分析のために、35ミリメートルの皿で腹膜低密度好中球を培養し、染色します、ポリ-L-リジンコーティングされた皿、実証されたように、0.1%BSAとRPMI1640の2ミリリットルで短時間洗浄します。培地を、BSAを添加した2ミリリットルのRPMIに懸濁した10〜6番目の未染色胃腫瘍細胞を1回交換し、室温で5分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、BSAを添加した2ミリリットルの新鮮なRPMIで室温で5分間細胞をすすぎ、続いて穏やかに渦巻いて付着していない腫瘍細胞を取り除きます。その後、上清をFBSと抗生物質を添加したDMEMに交換し、NETsによる腫瘍細胞トラップのタイムラプス解析のために、全景細胞観察システムにディッシュを取り付けます。2時間の培養後、腹膜洗浄液由来のCD66b陽性低密度好中球は、緑色蛍光核および染色体染色によりストリング構造を示しますが、CD66b陰性単核細胞は示しません。しかし、低密度好中球培養物を1ミリリットルあたり100単位のDNAse Iで前処理すると、好中球から排出された細胞外DNAによって構造が構成されていることを示す特性構造が破壊されます。低密度好中球をコーティングされていないプラスチックプレートで培養すると、皿の底に付着したNETがほとんどなく、培地内に多くのNETクラスターが浮遊していることが観察できます。蛍光標識された胃腫瘍細胞株とのインキュベーションを5分間行った後、多くの腫瘍細胞がNET内の好中球に付着しますが、これはDNAse I.での前処理後には観察されない現象です。OKUM-1およびNUGC-4。興味深いことに、NETは長時間の腫瘍細胞共培養から数時間以内に徐々に消失しますが、NETに捕捉された腫瘍細胞はNETの放出後に活発に増殖し始めます。この手順では、NETがプレートに弱く付着するため、洗浄と皿の移し替えプロセスは特に慎重に行う必要があることを覚えておくことが重要です。この技術の開発後、生物医学のさまざまな分野の研究者が、血栓症、全身性炎症反応症候群、自己免疫疾患などのさまざまな疾患とNETsの因果関係を探求する道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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このビデオは、好中球の細胞外トラップ(NET)を生成および単離するin...

ヒト好中球細胞外トラップを作製するIn Vitro技術

このビデオでは、蛍光顕微鏡を使用してがん細胞の好中球細胞外トラップ(NET)への付着を検出するアッセイを実演しています。試験ウェルでは、NETsに付着する蛍光標識がん細胞の数が顕著に増加していますが、DNaseで処理されたウェルでは、NETsへのがん細胞の接着が減少しています。...

がん細胞の好中球細胞外トラップへの付着を検出するためのin vitro接着アッセイ

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抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

ここに提示されるのは、 in vitro...

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

本稿では、膜透過性依存性二重色素アプローチと組み合わせた生細胞解析システムを利用して、好中球細胞外トラップ(NET)を定量する自動化されたハイスループット法を紹介します。...

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

ヒト血漿からの低密度リポタンパク質 (LDL) の単離、HL-60 細胞の好中球様細胞への分化、LDL の存在下での好中球細胞外トラップ (NET) の調製、および NET と LDL の混合物によるヒト大動脈内皮細胞の刺激。...

低密度リポタンパク質の存在下での好中球細胞外トラップを用いた血管内皮細胞の刺激

学ぶ低密度好中球由来の細胞外トラップ（NETs）を用いた腫瘍細胞捕獲と接着の可視化手法。腹腔洗浄液から好中球を回収し、がん転移メカニズムの解明に貢献する。

低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル

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