Name: 胎盤のコンドロイチンの合成とキャラクタリゼーション (plCSA) の硫酸塩 - 脂質のターゲット設定 - 高分子ナノ粒子 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学ぶ 胎盤コンドロイチン硫酸A結合ペプチドを用いた脂質-高分子ナノ粒子の合成法。超音波処理と共役反応で、がんや胎盤障害への標的治療薬送達が可能となる再現性の高い手法です。

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広東省 (2016A030313178) の自然科学基礎国立自然科学財団 (81571445 と 81771617) と中国 (2016YFC1000402) の開発プログラム キー研究からへの補助金によってこの作品のサポートだったX. f. と、深セン基本研究基金 (JCYJ20170413165233512) x. f.

1. ストック溶液の調製
<ol><li>100 ml の超純水水エタノール 4 mL を希釈して 4% エタノール水溶液を準備します。4 ° C でソリューションを格納します。 注: 超純水は細菌、微粒子、イオン、核酸などの汚染物質がなく水として定義されます。純水は、ターゲット抵抗低い陰イオン性汚染を意味するまで 18.2 mΩ·cm の水の浄化システムから得られました。</li>
	<li>4% のエタノール水溶液 20 mL に大豆レシチン 20 mg を溶解することにより大豆レシチン原液を 1 mg/mL を準備します。大豆レシチン原液 4 ° C で保存します。</li>
	<li>4% のエタノール水溶液 4 mL DSPE-ペグ-COOH の 100 mg を溶解することにより DSPE ペグ (2000)-COOH 原液を 25 mg/mL を準備します。-20 ° C で原液を保存します。</li>
	<li>5 mL の純水に DOX の 50 mg を溶解して DOX 原液 10 mg/mL を準備します。暗闇に 4 ° C で DOX 原液を格納します。</li>
	<li>10 mL のアセトニ トリルに PLGA の 20 mg を溶解して PLGA 原液 2 mg/mL を準備します。4 ° C で PLGA 原液を保存します。 注意: アセトニ トリルは可燃性、有毒です。発煙のフード、ケアで動作し、適切なパーソナル機器、白衣、安全メガネ、ゴム手袋などを着用します。</li>
	<li>0.1 M 2-(morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES、pH 6.0) のストック溶液を準備するには、100 mL の純水に MES の 2.17 g 溶解します。4 ° C で原液を保存します。</li>
</ol>2. DNPs の合成
注: DOX 光化学分解を避けるためには、すべての操作は暗闇の中で実行されました。 以前に報告されたシングル ステップ超音波法11,13,14によりナノ粒子を合成しました。
<ol><li>4% のエタノール水溶液の 3 mL を滅菌 10 mL の遠心管に追加します。4% のエタノール水溶液の 3 mL に大豆レシチン原液の 90 μ g、DSPE-ペグ-COOH 原液の 210 μ g、DOX 原液の 750 μ g を追加します。</li>
	<li>氷浴に遠心管を置き、超音波プロセッサ上の氷浴を配置します。</li>
	<li>1 mL 注射器ピペット滴 PLGA 原液 2 mg (1 ドロップ/4-6 秒) の遠心管に。一方、超音波照射、DNPs を合成する周波数が 20 kHz と 5 分の 30% の出力振幅超音波プロセッサを使用して管 注: 小さいサイズの均一な微粒子を合成する、PLGA ソリューションはチューブに滴下速度が遅く、する必要があります、バブル世代は避けるべきであります。</li>
	<li>上記の解決策を 0.1 M MES バッファー (pH 6.0) で洗浄することにより、DNPs を浄化 3 回遠心フィルター (MWCO、10 kDa) を使用します。4 ° C で遠心して 3 分たびに 1000 × g。最後に、約 1 mL ナノ粒子の MES 解決のままです。 注: これはの手順で許容可能な停止ポイントです。ない場合、共役ペプチドを使用すると、ナノ粒子は PBS バッファー (pH 7.4) によって浄化することが、精製の DNPs は暗闇の中で 4 ° C で保存できます。</li>
</ol>3. DNPs にペプチドの活用
<ol><li>
エステルの活性化
	<ol>
<li>EDC の 0.4 mg を追加 (最終濃度 2 mM) DNPs 1 mL に。</li>
		<li>反応する NHS の 0.24 mg を追加 (最終濃度 2 mM)。 注: EDC および NHS の正しい量を簡単に追加、試薬を溶解し、すぐに使用場合にストック溶液を調製可能性があります。</li>
		<li>反応成分を混ぜる、シェーカー; に反応暗闇の中で室温で反応の 30 分、1 時間を許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アミンの反応
	<ol>
<li>7.2 7.5 を使用するバッファーの pH を高める PBS (20 ×、pH 7.4)。</li>
		<li>反応液に 0.5 mg plCSA を対象としたペプチド (EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC plCSA BP) を追加します。 注: また、前に 20% アセトニ トリル中のペプチドを溶解します。ペプチド溶ける場合は、風呂超音波発生装置で超音波処理に役立つ可能性があります。</li>
		<li>まあ、ソリューションをミックスし、シェーカー。暗闇の中で一晩 4 ° C で進行する反応を許可します。</li>
		<li>透析バッグ (MWCO、3,500 Da) dialyze plCSA DNPs を浄化しに共役ソリューションを配置暗闇の中 24 時間室温で PBS (pH 7.4) バッファーを使用します。 注: また、浄化をステップ 2.4 plCSA DNPs を取得するように実行でした。</li>
		<li>細胞培養の応用潜在的な沈殿物を削除する 0.22 μ m の滅菌注射器フィルターを溶解した溶液をフィルタ リングします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 plCSA をターゲットとした脂質の特性-高分子ナノ粒子
<ol><li>
動的光散乱 (DLS) を使用して流体力学的ナノ粒子サイズの測定
	<ol>
<li>純水 (~ 50 倍希釈) を持つナノ粒子を希釈します。DLS またはゼータ電位器の指示に従ってキュベットに 500 μ L のサンプルをロードします。 メモ: ゼータ電位と DLS キュヴェットは計測器の仕様に基づいてすることができます異なります。</li>
		<li>測定が完了した後に、粒子径、分散インデックス (PDI) ゼータ電位を記録します。平均 4 から得られた結果は、測定値を繰り返し、標準偏差を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
透過型電子顕微鏡 (TEM) 注: ナノ粒子の形態は、ネガティブ染色法による TEM で観察されました。24<ol>
<li>超純水 (400-fold 希釈) ナノ粒子を希釈します。TEM グリッド上にサンプルの 20 μ L を追加し、5 分間座ってできるようにします。</li>
		<li>2% (w/v) リンタングステン酸の 100 μ L を追加し、液滴 2 分芯まで座ることができます。</li>
		<li>室温で TEM グリッドを乾燥させます。</li>
		<li>80 で電子顕微鏡の加速電圧を設定 kV、100,000 × ナノ粒子を可視化する画像の拡大と。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
カプセル化効率 (EE) の定量とル
	<ol>
<li>標準的な曲線の生成。5 つの異なる濃度の DOX ソリューションを準備する純水 DOX の溶解: 1 μ G/ml、5 μ g/mL、10 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL。480 で DOX ソリューションの吸光度 nm 紫外可視分光計。DOX 濃度に基づく標準的な曲線を生成します。</li>
		<li>500 μ L の純水でナノ粒子の 25 μ L を希釈します。480 吸収を測定 nm 紫外可視分光計。標準曲線を用いた薬物濃度を計算します。</li>
		<li>ルの次の式を使用して計算します。 ル = ((ナノ粒子における薬の量)/(材料の重量を合計)) × 100%。</li>
		<li>次の方程式を使用して EE を計算します。 EE = ((ナノ粒子における薬の量)/(量追加薬)) × 100%。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ビシンコニン酸 (BCA) アッセイを用いた活用効率の測定25,26,27<ol>
<li>重複でマイクロ プレートのウェルに標準的なペプチッド解決 (表 1) または plCSA DNPs の 25 μ L をピペットします。各ウェルに作業試薬 200 μ L を追加し、ミックス 30 プレート シェーカーでよくプレート s。</li>
		<li>カバー プレート、および 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>562 で吸光度を測定プレート リーダーの nm。生成された標準的なカーブを使用して、plCSA DNPs の plCSA 濃度を計算します。</li>
		<li>次の方程式を使って活用効率を計算します。 活用効率 = ((ナノ粒子におけるペプチドの量)/(量追加ペプチド)) × 100%。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>バイアル</td>
			<td>希釈剤 (μ L) のボリューム</td>
			<td>ボリュームとペプチド (μ L) のソース</td>
			<td>最終的なペプチド濃度 (μ g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>株式の 300</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>バイアル希釈の 250</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>バイアル B 希釈の 250</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>C のバイアル希釈の 250</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>D のバイアル希釈 200</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>E のバイアル希釈の 250</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>F のバイアル希釈 100</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。標準的なペプチドの作製
5 絨毛癌 (JEG3) 細胞のナノ粒子の取り込みを plCSA ターゲットの蛍光顕微鏡による評価
<ol><li>1.0 × 10 で滅菌 12 ウェル プレートの上に細胞を播く4細胞/ウェルと完全な DMEM/F12 (cDMEM/F12、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む)。高温多湿条件下で CO2を 37 ° C、5% で 60% の合流点に成長する細胞を許可します。</li>
	<li>メディアを取り出して、低血清量と冷たい新鮮なメディアの 1 つの mL を追加 (5 %fbs) DNPs や plCSA DNPs (DOX と同等の 5 μ g)。</li>
	<li>セルと 1 h の 4 ° C でのナノ粒子の混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、メディアを取り出して、洗浄 3 回 PBS のセル。新鮮な cDMEM/f12 キーの 1 つの mL を追加し、37 ° C、30 分で細胞をインキュベートします。</li>
	<li>CDMEM/f12 キーを取り外して洗浄 3 回 PBS のセル。</li>
	<li>冷たい 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 2 mL を追加し、セルを修復するのに 15 分間、室温でインキュベートします。</li>
	<li>PFA を削除します。2 ml の PBS のセルを一度洗ってください。DAPI を含む PBS の 1 mL を追加 (1 μ g/mL) 核染色、10 分間室温でインキュベートし、。</li>
	<li>PBS、吸引し、洗浄 3 回 PBS のセル。</li>
	<li>メディアをマウントを追加し、それぞれ DOX と核を視覚化する緑と青のチャンネルを使用して蛍光顕微鏡を用いた蛍光を画像します。</li>
</ol>

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</ol>

X. f. B.Z. は、特許 PCT/CN2017/108646 と plCSA をターゲットとしたナノ粒子合成法と応用をカバーする SIAT 投稿 201710906587.6 の発明者。いいえ利害対立の可能性、他の著者によって明らかにされました。

このプロトコルは、plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を合成するため効率的かつ再現性のある方法を提供します。脂質高分子ナノ粒子を準備するシングル ステップ超音波法は高速、再現性と暖房、ボルテックス、または蒸発を伴う典型的な nanoprecipitation メソッドとは異なる。したがって、開発した方法は、合成時間を著しく短縮します。さらに、このプロトコルで使われる EDC/NHS ナノ診断は共役ペプチド ・ ナノ粒子に対する抗体によく使用され、便利な手法です。したがって、組み合わせ plCSA ターゲット脂質高分子を合成する EDC/NHS ナノ診断手法でシングル ステップ超音波処理法のナノ粒子が臨床応用スケールできます。
特定の手順は、正常に合成と plCSA DNPs を特徴付けるのために重要です。まず、レシチン、PLGA と DSPE-ペグ-COOH の相対濃度は、脂質高分子ナノ粒子のサイズと多分散性を決定します。レシチン濃度が固定 DSPE-ペグ-COOH 結果低い多分散性の高い濃度およびより小さいナノ粒子のサイズ、13...

効果的ながん治療法は減り、最小限の全身毒性を有する腫瘍をなくします。したがって、ターゲットに選択的な腫瘍は、成功した治療法を探索するための鍵です。ナノ粒子がん治療の有望な機会を提供する、異なる官能基を持つ分子薬の有効性を強化し、関連する副作用1,2削減します。さらに、ナノ粒子系は主にパッシブとアクティブの目標ターゲット腫瘍3を利用します。
受動的ターゲティング ナノ粒子と高められた透磁率および腫瘍細胞に到達する保持 (EPR) 効果の生得的な性質を悪用します。カチオン性リポソームは、臨床応用4,5,6腫瘍に様々 な抗がん剤を提供する正常に使用されています。潜在的な効果的な癌治療効果にもかかわらず腫瘍領域と正常組織と腫瘍細胞を区別することができない低薬物濃度でナノ粒子の受動ターゲット7の 2 つの主要な制限は。
アクティブなターゲット戦略から抗原抗体、リガンド受容体、特に腫瘍8に薬を提供する他の分子認識の相互作用を活用します。グリコサミノグリカン胎盤コンドロイチン硫酸 (plCSA) は広く、ほとんどのがん細胞や胎盤トロホブ表されます。また、マラリアの蛋白質 VAR2CSA はすることができます具体的に plCSA9,10にバインドします。したがって、VAR2CSA は、ひと癌細胞をターゲットとするためのツールをすることができます。しかしときに、VAR2CSA のナノ粒子に共役は、実物大の蛋白質は腫瘍細胞へのナノ粒子の浸透を制限があります。最近、我々 はマラリア タンパク質 VAR2CSA 由来 plCSA 結合ペプチド (plCSA-BP) を発見しました。plCSA 共役 BP 脂質高分子ナノ粒子は急速に絨毛癌細胞と大幅に増加したドキソルビシン (DOX) 抗癌活性生体内で11に結合これらの粒子は具体的にも胎盤トロホブに接着し、胎盤12への薬物の対象となる配信のためのツールとして役立つことができます。
脂質高分子ナノ粒子はから成っている脂質単分子膜シェルと疎水性高分子コア、ドラッグデリバリーのための新しいキャリアを表します。これらのナノ粒子は、リポソームと制御可能なナノ粒子のサイズ、高い生体適合性、持続的な薬物放出、高い薬剤積載効率 (ル)、安定性に優れる13などの高分子ナノキャリアの利点を結合します。この作品は、脂質高分子ナノ粒子を合成するのにシングル ステップ超音波処理法を使用しました。このメソッドは、高速、便利でスケール アップに適した、脂質高分子ナノ粒子を準備する私たちグループ11,14等で広く使用されています15,16,17,18.
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド塩酸塩 (EDC) はアミンとカルボン酸の19を含む生体分子の活用の架橋剤として使用される人気のあるカルボジイミド。EDC は、に加えて N hydroxysulfosuccinimide (NHS) は表面およびナノ粒子抱合反応20,21の最も一般的な活用試薬です。NHS は副反応の数を削減でき、安定性を高めるし、収量エステル中間体22,23。
ここでは、plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を合成するためのプロトコルについて述べる。まず、DOX ロード脂質高分子ナノ粒子 (DNPs) のシングル ステップ超音波合成を説明します。さらに、plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を生成するための EDC/NHS ナノ診断技術を導入します。このナノ診断手法は、他の抗体とナノ粒子にペプチド共役に使用もできます。最後に、我々 は plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を特徴付けるために使用プロパティと体外の物理化学的アッセイをについて説明します。我々 は、これらの plCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子がほとんどの人間のがん、胎盤疾患を治療するために胎盤にペイロードのターゲットを絞った配信に薬のターゲットを絞った配信のための効果的なシステムを構成する可能性が信じています。

<table><tbody><tr><td>plCSAペプチド</td>上海<td>GLペプチド</td><td>合成のための</td>生化学<td>573518</td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>Sinopharm</td>ナノ<td>粒子合成のための</td>化学<td>10009218</td></tr><tr><td>大豆レシチン</td><td>Avanti極性脂質</td><td>441601</td><td>ナノ粒子合成</td></tr>のための<tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti極性脂質</td><td>880125</td><td>ナノ粒子合成のための</td></tr><tr><td>ナノ粒子合成のためのドキソルビシン</td><td>JK化学</td><td>113424</td> ナノ<td>粒子合成</td></tr>のための<tr><td>アセトニトリル</td><td>上海Lingfeng</td><td>1008621</td><td></td></tr><tr><td>ナノ粒子合成のための</td><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich 719897</td><td></td>ナノ粒子合成</tr>のための<tr><td>超音波プロセッサ</td><td>ナノ粒子合成のための</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td></tr><tr><td>遠心分離機フィルター(MWCO 10 kDa)</td><td>ミリポア</td><td></td><td>ナノ粒子精製</td>用UFC801024</tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>ナノ粒子精製用</td></tr><tr><td>2-[モルフォリノ]エタンスルホン酸(MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>ペプチド抱合</td></tr>用 <tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>ペプチド抱合用</td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)</td><td>ペプチド結合用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td></tr><tr><td>透析バッグ</td><td>ナノ</td><td>粒子精製用</td>Spectrum <td>132592T</td></tr> 細胞<tr><td>培養</td><td>用PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td></tr><tr><td>10 mL遠心分離管、ポリプロピレン</td><td>アラジン</td><td>S-025</td><td>ナノ粒子合成用</td></tr><tr><td>15 mL遠心分離管、ポリプロピレン</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td>さまざまな用途に対応</td></tr><tr><td>0.22 以上 μ;m 滅菌シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGV033RB</td><td>ナノ粒子精製用</td></tr><tr><td>1mlシリンジ、ポリプロピレン</td><td>BD</td><td>ナノ粒子合成用</td><td>328421</td></tr><tr><td>マルバーン ゼータサイザー</td><td>マルバーン</td><td>ナノZS</td><td>粒度分析用</td></tr> リン<tr><td>タングステン酸</td><td></td><td></td><td>TEM</td></tr><tr><td>グリッド</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>TEM用</td></tr><tr><td>紫外可視分光器</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td>TEM</td></tr><tr><td>用 Transmission 電子顕微鏡</td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>粒度分析用</td></tr><tr><td>BCA試薬 A</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23228</td><td>BCAアッセイ用</td></tr><tr><td>BCA試薬 B</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23224</td><td>BCAアッセイ用</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3599</td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Multiskan&trade;BCA</td><td>アッセイ用</td>GO</tr><tr><td>12ウェルプレート</td> 細胞<td>培養用</td><td>Corning</td><td>3513</td></tr><tr><td>JEG3細胞</td><td>中国科学院の細胞バンク</td><td>TCHu195</td><td>ヒト胎盤</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ハイクロン</td><td>SH30272.01</td><td>フェノールレッドフリー</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10100</td> 細胞<td>培養用</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>細胞培養用</td><td>15070063</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>セルラー取り込み用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>上海霊風</td><td>1372021</td>セル取り込み<td>用</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>A606584</td>セル<td>取り込み用</td></tr><tr><td>マウンティング培地</td><td>寿命</td><td>P36961</td> セルラー<td>取り込み用</td></tr></tbody></table>

胎盤のコンドロイチンの合成とキャラクタリゼーション (plcsa) の硫酸塩 - 脂質のターゲット設定 - 高分子ナノ粒子

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

効果的ながん治療法は減り、最小限の全身毒性を有する腫瘍をなくします。積極的にターゲットのナノ粒子は、ガン治療の有望なアプローチを提供しています。グリコサミノグリカン胎盤コンドロイチン硫酸 (plCSA) は、がん細胞と胎盤トロホブと VAR2CSA が plCSA にバインドできます特にマラリアの蛋白質の広い範囲で表されます。マラリア蛋白質 VAR2CSA から派生した報告された胎盤コンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP)、具体的にも、がん細胞と胎盤トロホブ plCSA にバインドできます。したがって、ひと腫瘍および胎盤トロホブへの標的化薬物送達のツールとして plCSA BP 共役系ナノ粒子を使用可能性があります。このプロトコルを装荷したドキソルビシン (plCSA DNPs); plCSA BP 共役脂質高分子ナノ粒子を合成する手法について述べるメソッドは、単一の超音波処理ステップやナノ診断技術で構成されます。さらに、plCSA-DNPs 胎盤絨毛癌 (JEG3) 細胞による細胞内取り込み、物理化学的性質などの特性評価法のいくつかを説明します。

このプロトコルでは、PLGA、DSPE-ペグ-COOH、大豆レシチン、代表的なポリマー、脂質-ペグ-COOH 共役と脂質がそれぞれ。PlCSA をターゲットとした脂質高分子ナノ粒子を介してシングル ステップ超音波処理法の EDC/NHS 法合成は図 1に示します。まず、超音波照射条件下で大豆レシチン、PLGA と DSPE-ペグ-COOH フォーム コア-シェルに自己組み立てる構造 DNPs。中核は PLGA のカプセル化された DOX から成り、シェルから成っている DSPE-ペグ-COOH と大豆レシチン単分子膜は、シェルとコアのインターフェイスに位置しています。- COOH グループ大日本印刷表面に露出したは、ペプチドのを介してplCSA DNPs を合成する EDC/NHS 法 -NH2グループと共役しました。
このプロトコルの...

ここでは、胎盤のコンドロイチン硫酸 A 結合ペプチド (plCSA BP) の合成のためのプロトコルを提案する-共役脂質高分子ナノ粒子を介してシングル ステップ超音波処理とナノ診断技術。これらの粒子は、最もひと腫瘍と癌、胎盤疾患を治療するために胎盤トロホブに治療のターゲットを絞った配信するための新しいツールを構成します。

胎盤のコンドロイチンの合成とキャラクタリゼーション (plCSA) の硫酸塩 - 脂質のターゲット設定 - 高分子ナノ粒子

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

この方法は、ヒト癌および胎盤細胞芽細胞への治療の標的送達など、薬物送達分野の重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、他の粒子に結合したペプチドを合成する簡便で再現性の高い方法である点である。まず、滅菌10ミリリットル遠心管に4%エタノールの3ミリメートルを加えます。次に、90マイクログラムの大豆レシチンストック溶液、210マイクログラムのDSPE-PEG-カルボン酸ストック溶液、および750マイクログラムのDOXストック溶液を添加します。PLGAストック溶液の2ミリグラムをピペットに1ミリリットルのシリンジを使用してください。遠心管を超音波処理機の氷浴に入れ、2分間超音波処理します。次に、PLGAストック溶液を遠心管に滴下して加えます。DMPを精製するには、遠心分離フィルターを使用して溶液を0.1モルMESバッファーで洗浄します。次いで、摂氏4度で3分間1000Gで溶液を遠心する。エステル活性化を開始するには, DMP の 1 ミリリットルに EDC の 0.4 ミリグラムを追加します。.その後、反応にNHSの0.24ミリグラムを追加します。次いで、暗闇の中で室温で1時間まで反応を起こさせます。その後、反応成分を十分に混ぜ合わせ、シェーカーに反応を入れます。アミン反応を開始するには、PBSを使用してバッファー pH を 7.2 から 7.5 に増やします。次いで、反応溶液に0.5ミリグラムのピチカ標的ペプチドを加える。溶液をよく混ぜて、シェーカーの上に置きます。その後、暗闇の中で一晩摂氏4度で反応を進行させます。翌日、コンジュゲート溶液で透析袋を充填します。暗所で24時間室温でPBSバッファーでピクスカDMPを精製します。テキストプロトコルに従って細胞を培養した後、メディアを取り除き、FBSとPICSA DMPまたはDMPを5%の新鮮なコールドメディア1ミリリットル追加します。次に、細胞とナノ粒子混合物を摂氏4度で1時間インキュベートする。この後、培地を取り出し、PBSで細胞を3回洗浄します。その後、新鮮な培地を1ミリリットル加え、30分間摂氏37度で培養します。この後、培地を取り出し、PBSで細胞を3回洗浄します。その後、2ミリリットルの冷たい、4%のPFAを加え、室温で10分間インキュベートします。PFAを取り出し、2ミリリットルのPBSで細胞を洗います。次に、核染色用のDAPIを用いてPBSを1ミリリットル加える。混合物を室温で10分間インキュベートする。最後に、取り付け媒体を加え、蛍光顕微鏡で蛍光を画像化します。このプロトコルを使用して、DMP は正常に準備され、PICSA BP に結合されました。結合後、一次DMPの直径は約109ナノメートルに増加した。DDNPとピクスカDMPのTEM画像は、粒子が十分に分散し、一般的に球面形態を実証していることを示した。ナノ粒子のゼータ電位は20.1ミリボルトと29.9ミリボルトの陰性であり、ナノ粒子が非常に安定していたことを示している。JEG3細胞取り込みアッセイは、30分以内に株中のジクサのDMPがJEG3細胞に結合することを示した。そのため、ピクスABPを表面に効率的に共役させた。この手順を試みている間、PLGAを追加する前に1〜2分間混合物を超音波処理することを忘れないでください。この手順に従って、HPLCアッセイのような我々の方法は、より正確に活用効率を決定するために行うことができる。その開発後、この技術は、生殖生物学の分野の研究者が妊娠合併症における胎盤標的治療の可能性を探求する道を開いた。

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、ジブロック共重合体を用いたポリマーをベースとしたナノ粒子を合成するナノ析出の方法を説明します。私たちは、ジブロックの合成共重合体、ナノ析出技術、及び潜在的なアプリケーションについて説明します。...

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&gt;jove_content&lt;この研究では、生体適合性ナノ粒子の超小さな集団を合成する方法と、それらの細胞相互作用を評価するためのいくつかのin vitro方法が説明されました。...

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

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組織工学のためのアルギン酸微粒子と熱ゲルポリ（N-イソプロピルアクリルアミド） - グラフト - コンドロイチン硫酸複合材料の合成

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液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

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サイズと架橋密度にナノスポンジ可変性

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3 つの補完的な手法を使用して胎盤をターゲットとした薬剤投与の安全性の総合評価

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ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

このプロトコルは、注射可能な、上分子ポリマーナノ粒子(PNP)ヒドロゲルバイオマテリアルの合成および処方を記述する。これらの物質の薬物送達、バイオ医薬品安定化、細胞カプセル化および送達への応用が実証されている。...

細胞および薬物送達用途のための注射可能な高分子ポリマーナノ粒子ヒドロゲル

学ぶ 胎盤コンドロイチン硫酸A結合ペプチドを用いた脂質-高分子ナノ粒子の合成法。超音波処理と共役反応で、がんや胎盤障害への標的治療薬送達が可能となる再現性の高い手法です。

胎盤のコンドロイチンの合成とキャラクタリゼーション (plCSA) の硫酸塩 - 脂質のターゲット設定 - 高分子ナノ粒子

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