炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ
2018年9月20日
血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in vitroアッセイ抗インテグリン抗体、ケモカインやその他の要因の影響分析のためのプロトコルを紹介します。
この方法は、末梢器官へのホーミングに必要な免疫細胞の接着カスケードに関する基礎免疫生物学および炎症性腸疾患研究の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、フロー条件下での細胞接着のコンテキストで機能的な質問に答える便利でわかりやすいアプローチであるということです。この方法は炎症性腸疾患における細胞ポワチン抗インテグリン抗体のメカニズムを探索するために開発されたが、他の炎症性疾患の設定で同様の問題を分析するために変更することができる。
小さいはさみで片側にゴム製のチューブを伸ばし、管に約0.5センチメートルの長方形の毛細管を挿入できるようにすることから始めます。その後、パラフィンフィルムとの接続をシールします。目的のアドレス20マイクロリットルでキャピラリーをコーティングし、37°Cで少なくとも1時間インキュベーションのプラスチックパラフィンフィルムでチューブに接続されていない側を密封します。
インキュベーションの最後に、プラスチックパラフィンフィルムを取り出し、液体をキャピラリーからペーパータオルに浸してチューブを空にします。その後、37°Cで少なくとも1時間、20マイクロリットルのブロッキング溶液でキャピラリーをブロックします。コード化されたタンパク質の機能性を損なう可能性があるため、コーティングを取り除いた直後に毛細管にブロッキングを適用することが非常に重要です。
毛細血管がブロックされている間に、 50 ミリリットルチューブから抗凝固全人間の血液 18 ミリリットルを加え、PBS で合計 35 ミリリットルの血液を希釈します。血液溶液下の密度勾配培地の層10ミリリットルを、密度勾配遠心分離によって末梢血単核血球を単離する。分離の終わりに、末梢血単核細胞を密度勾配媒体の界面から新しい50ミリリットルチューブに移す。
そして、新鮮なPBSで50ミリリットルまでのチューブ内の総体積を持って来ます。遠心分離後、ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSでカウントし、メーカーの指示に従って適切な細胞追跡染料で細胞を染色します。染色インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、完全なRPMI培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に1.5倍10回でペレットを再懸濁する。
その後、条件がある48ウェルプレートの多くの井戸に細胞の1ミリリットルを播種します。そして、37°Cで1時間インキュベーションのために適切なウェルに抗インテグリン抗体の適切な量を追加します。次に、P1000ピペットを使用して細胞を数回再懸濁してから、細胞を個々の2ミリリットルチューブに移します。
PBSを1ミリリットルずつよくすすい、適切な2ミリリットルのチューブにスリーチをプールします。カウント後、ペレット細胞を遠心分離し、適切な量の接着バッファーで細胞をリサスペンし、ミリリットル懸濁液当たり10〜6番目の細胞を1.5倍得た。次に、適切な量の塩化マンガンを各チューブに1ミリモルの最終濃度に加えます。
細胞の準備ができたら、顕微鏡をオンにし、適切なフィルターとレーザー、目的および取得モードを選択します。毛細血管の先端からプラスチックパラフィンフィルムを取り出し、毛細血管を小さなチューブに接続できるように、はさみを使用して5センチメートルのゴムチューブを伸ばします。毛細管とチューブの間の接続をプラスチックパラフィンフィルムで密封します。
そして、固定トレイに毛細血管を取り付けます。毛細管が焦点を合わせるように、顕微鏡のトレイホルダーにトレイを置きます。そして、ゴムチューブを蠕動ポンプの対応するノッチに挿入します。
チューブの未接続の端部を、細胞懸濁液を含む最初のサンプルチューブに入れる。そして、毛細血管の反対側の短いチューブを15ミリリットルのチューブに挿入して、流れを収集します。細胞懸濁液がキャピラリーに近くなるまで、チューブを毎分500マイクロリットルの流量で満たします。
次に、1分間に100マイクロリットルの流量で毛細管を充填させます。毛細血管が細胞で満たされたら、流量を毎分10マイクロリットルに調整し、2秒ごとにアコティンコーティングされた壁の内側に沿って毛細血管をゆっくりと移動する細胞のタイムラプス画像を合計3分間キャプチャします。細胞懸濁液が毛細管の内側に達すると、静的インテグリンアカテイン相互作用が測定に偏る可能性を招く可能性を招くため、フローの中断を避けるのが重要です。
マイクロスコープの接眼部を通して毛細管全体を廃棄する前に、画面で観察されたセクションが代表的であることを確認する。ポンプからチューブを解放し、残りの流体を2ミリリットルチューブに戻します。次に、キャピラリーとチューブを固定トレイから取り外し、ちょうど実証したように次の毛細管を画像化します。
タイムラプスの記録を評価するには、適切な解析ソフトウェアの最初のシーケンスを開き、最初と最後の3つの画像をTIFFファイルとしてエクスポートします。ImageJ で 3 つの開始イメージを開き、イメージ、タイプ、および 32 ビットを選択して、イメージを 32 ビットに変換します。次に、画像、カラー、およびマージチャネルを選択して画像を1つの画像にマージし、合成画像をRGBに変換してTIFFファイルとして保存します。
最後の 3 つの画像を同じ方法で変換した後、合成画像の先頭と末尾に表示される白いセルを数えます。終了画像の白いセルの数から、開始画像の白いセルの数を減算します。ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1でコーティングされた毛細血管の灌流は、人間のPBMCを有するイソタイプFcキメラではないが、3つのアカチンのいずれかが存在すると顕著な接着をもたらす。
対照的に、中和抗体を用いたインテグリン・アカテニン相互作用の阻害は、典型的には、アイソタイプ対照抗体が添加された場合に存在しない動的接着の著しい減少をもたらす。さらに、特定のケモカインを有するCD4ヒトT細胞の治療は、未治療のヒト細胞と比較してアカチンへの接着性の増加をもたらす。この手順を試みる間、このアッセイでは完全に再現できない生体内の動的細胞接着に様々な要因が寄与することを覚えておくことは非常に重要です。
しかし、非常に複雑な質問に対処するためにアッセイを調整することが可能です。試験細胞タイプの差付着挙動に関する追加の質問に対処するために、異なる細胞追跡色素で標識された異なる細胞タイプで競合接着アッセイを行うことも可能である。その開発後、この技術は、炎症性腸疾患の治療のために使用または現在開発中の異なる抗インテグリン抗体の効果を探求することを可能にしました。
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概要
この記事では、腸ホミングに不可欠な血管壁への免疫細胞の動的付着を分析するための機能的in vitroアッセイのプロトコルを提示します。この方法により、フロー条件下でのヒト細胞付着に対する抗インテグリン抗体、ケモカイン、その他の因子の影響分析が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 免疫生物学
- 炎症性腸疾患研究
- 細胞付着メカニズム
背景
- 動的付着は免疫細胞のホミングに不可欠です。
- この方法は免疫生物学における重要な疑問に対処します。
- さまざまな炎症性疾患の設定に適応させることができます。
- 付着カスケードの理解は治療戦略にとって重要です。
研究目的
- 抗インテグリン抗体が細胞付着に与える影響を探求すること。
- 機能分析のための簡単なアプローチを提供すること。
- フロー条件下での免疫細胞挙動の研究を促進すること。
使用された方法
- 毛細血管挿入のためのゴムチューブの伸ばし。
- アドレスインによる毛細血管のコーティング。
- 37度セルシウスでのインキュベーション。
- パラフィンフィルムによる接続部のシーリング。
主要な結果
- この方法は細胞付着動態を効果的に分析します。
- ケモカインと抗体の役割に関する洞察を提供します。
- 結果は炎症性疾患の治療アプローチに情報を提供できます。
結論
- この技術は免疫生物学研究にとって貴重なツールです。
- さまざまな炎症性疾患に適応させることができます。
- 付着メカニズムの理解はより良い治療法につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Functional analysis of immune cell adhesion under flow conditions is critical for evaluating anti-adhesion therapies in inflammatory bowel disease. This dynamic adhesion assay provides a physiologically relevant system to assess target engagement and mechanism of action for integrin inhibitors. It supports early-stage de-risking by enabling quantitative comparison of therapeutic candidates before in vivo testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of integrin-dependent adhesion mechanisms under shear stress to validate target relevance in IBD pathogenesis.
- Operational Value: Provides a reproducible readout for functional screening of anti-integrin antibodies like vedolizumab and emerging candidates.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking antibody treatment to reduced adhesion under defined flow conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative adhesion metrics by comparing cell counts before and after perfusion through addressin-coated capillaries.
- Operational Value: Uses standardized perfusion parameters (10 µL/min flow rate, 3-minute capture) to ensure reproducible dynamic adhesion measurements.
- Assay Readiness: Compatible with multiplexing via competitive adhesion assays using differentially labeled cell types to compare therapeutic effects.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human immune cell homing dynamics using primary PBMCs and physiologically relevant addressins (ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1).
- Translational Continuity: Bridges in vitro target modulation with ex vivo functional outcomes predictive of tissue-specific immune cell recruitment.
- Preclinical Utility: Enables dose-response analysis of neutralizing antibodies to inform lead optimization and biomarker strategy.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional adhesion data that informs go/no-go decisions for anti-adhesion candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of integrin blockade effects on cell adhesion under flow, clarifying mechanism of action for therapeutic antibodies.
- Screening: Delivers quantitative, perfusion-based adhesion outputs that enable comparison across antibody candidates and chemokine-modulated conditions.
- Analytics: Employs time-lapse imaging and cell counting to generate subtractive adhesion scores (ending minus starting cell count) as a functional endpoint.
- Translational Research: Uses human PBMCs and disease-relevant addressins to enhance predictive confidence for IBD-specific immune cell trafficking.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other inflammatory disease models and cell types, supporting platform reuse across immunology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in anti-integrin antibody function by providing direct, real-time visualization of adhesion inhibition.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, perfusion, and imaging steps to improve reproducibility across laboratories and projects.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by validating functional target engagement before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of adhesion-modulating therapeutics based on quantitative, mechanism-linked functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, perfusion microscopy, and time-lapse image analysis for accurate adhesion quantification.
- Depends on specialized instrumentation including microscopes with flow chambers, peristaltic pumps, and environmental control at 37°C.
- Necessitates standardization of addressin coating, blocking, and perfusion protocols to minimize variability in adhesion readouts.
- Must account for physiological complexity limitations; the assay simplifies in vivo adhesion cascades and may not capture all contributing factors.
- Adaptation to alternative cell types or addressins requires re-optimization of cell concentration, flow rates, and incubation times.
