ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

この方法は、特別に設計された生体工学組織in vivoの有効性など、眼の自己治療に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、網膜組織を作製し輪郭を描く方法と、動物モデルでの眼移植のための組織処理戦略を提供します。まず、30 x 30 mmのヒト羊膜(hAM)を1〜4個洗浄します。

ナイロン足場を250mlのボトルに1回の洗濯につき80mlのPBSに2回、シェーカーで高速で5分間固定します。2回目の洗浄後、各ボトルに40mlの作業用サーモリシン溶液を加え、ボトルを450rpmで5分間2回振った後、30秒間ボルテックスします。サーモリシン処理の2回目のラウンドの後、示されているように、1回の洗浄で80mlのPBSでさらに2回ピースを洗浄します。

次に、長い滅菌鉗子を使用して、hAMを個別に、10mlのPBSを含む10cmの培養皿に移します。次に、PBSの2番目の10cm培養皿にナイロンを下に向けて1つのメンブレンを置き、メンブレンをナイロンに固定している4つのクリップのうち2つを取り外します。培養インサートの小さい方のリングをナイロンとメンブレンの間に挿入し、メンブレンが小さい方のリングを完全に覆っていることを確認します。

培養インサートの2番目の部分をメンブレンの上部にクリップして、hAMの基底膜が培養インサートの右側を上に向けるようにし、最後の2つのクリップを取り外します。次に、滅菌ハサミを使用して、必要に応じて培養インサートの外側の膜をトリミングします。また、鉗子を使用して、メンブレンを12ウェルプレートの1ウェルに移し、PBSを含んで摂氏37度とCO2を5%で保存します。

播種する前に、バイアル1本につき1本の15mlコニカルチューブに3mlのRPE培地に1回10〜6番目のRPE細胞を1回含むクライオバイアルを温めます。細胞が融解したら、ピペットで各チューブ内の単一細胞懸濁液を取得し、トライパンブルー排除により生存細胞の数をカウントします。遠心分離により細胞を回収し、新鮮なRPE培地に1ミリリットルあたり5番目の細胞濃度の7倍でペレットを再懸濁します。

次に、調製した12ウェルプレートの各ウェルからPBSを吸引し、各培養インサートの中央に500マイクロリットルの細胞を、各ウェルの底部に1mlのRPE培地を添加する。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに30日間戻し、培養が終了するまで週に2回培地を交換します。培養30日目に、8%ゼラチン溶液を摂氏37度の水浴で30分間温めます。

そして、ビブラトームの内部チャンバーを摂氏4度のCO2に依存しない媒体で満たします。メスを使用して、摂氏4度で保存された20%ゼラチンブロックから5cm×5cmのブロックを切り取ります。ブロックの上面を適切な接着剤でサポートに固定します。

そして、新しいブレードをビブラトームに挿入します。ブロックをカミソリの刃と同じ高さになるまで調整し、サポートの周りの浴槽を摂氏4度の新しいCO2に依存しない媒体で満たします。ブロックが滑らかなリーディングサーフェスで均一にカットされるまで、ブロックを中速でカットし、位置をゼロに設定します。

次に、ゼラチンが完全に乾くまで、ゼラチンの周りに培地を吸引します。そして、鉗子を使用して、ブロックの上にRPEシード培養インサートを慎重に開きます。はさみを使用してインサートリングの外側の膜をすべて取り除き、残留媒体の全量を吸引します。

膜が覆われるまで、最大1mlの8%液体ゼラチン溶液をメンブレンに加えます。そして、余分なゼラチンを慎重に取り除きます。5〜8分後、固化した膜が覆われるまで、摂氏4度のCO2に依存しない新しい培地を浴に加えます。

そして、ビブラトームを100ミクロンの位置にして、組織の向きを維持するように注意しながら、膜の一部を中速で切断します。切片の向きを識別できるように、切片の角をメスで切ります。そして、ヘラを使用して、ゼラチンに包埋されたメンブレンを、摂氏4度の保存培地で満たされた6ウェルプレートのいずれかに移します。

コーナーがカットされる前に自由になった動きにより、スライスの向きが反転する可能性があります。そのため、スライスの位置はセクションの直後に固定するように注意してください。その後、インプラントのサイズは、移植前に手術用顕微鏡でレシピエントの目のサイズに調整することができます。

通常、培養インサートに固置した後、メンブレンの表面にいくつかの死細胞が残りますが、培養培地を交換すると、これらの細胞は除去されます。細胞が残っていない場合、基底膜の繊維は高倍率で見えるため、サーモリシンの処理期間が最適化されていることがわかります。網膜上皮は、成熟するにつれて顕微鏡で見やすくなり、3週間で完全な丸石のような単層を形成します。

4週間で、上皮は着床の準備ができるほど成熟しています。この手順を試みる際には、ゼラチンの状態が温度に依存することを覚えておくことが重要です。したがって、推奨温度に厳密に従うように注意してください。

その開発後、この技術は、幹細胞治療の分野の研究者が網膜色素変性症の動物モデルにおけるバイオエンジニアリング組織の治療可能性を探求する道を開きます。この方法は、足場の上に組織を調製するために使用できますが、その後の移植のために、光受容体層を含むより複雑なシステムにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、非常に薄く、簡単に折りたたまれる傾向がある人間の羊膜の取り扱いが難しいため、苦労します。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、ヒトの羊膜固定とゼラチン包埋ステップを学ぶのが難しく、特定の取り扱いアプローチを必要とするため、非常に重要です。