3 つの補完的な手法を使用して胎盤をターゲットとした薬剤投与の安全性の総合評価
2018年9月10日
安全性と胎盤をターゲットとした薬剤投与の有効性を評価する 3 つの方法を利用するシステムについて述べる:生体内のイメージ投射ナノ粒子蓄積、胎盤と胎児の開発を監視する高周波超音波を監視するには、および高速液体クロマトグラフィー組織への薬物送達を定量化します。
この方法は、ナノ粒子に充填された薬剤の有効性と安全性に関するナノメディシン分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、胎盤に送達される薬物量の正確な生化学的測定を容易にすることです。この技術の意味は、胎盤への薬物送達の正確な標的化を確保することが重要であるため、胎盤介在性妊娠合併症の治療にまで及びます。
胚発生の高周波超音波評価を習得するには忍耐と経験が必要なため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。ナノ粒子の静脈内注射では、尾静脈が熱拡張したEmbryonic Day 14.5妊娠マウスを拘束装置に移し、アルコール綿棒で尾を洗浄します。次に、28ゲージのインスリン注射器の針先を拡張した尾静脈に挿入し、プランジャーを5〜10秒かけてゆっくりと押し下げ、均一な圧力でナノ粒子を尾静脈に送達します。
注射の30分後、麻酔をかけた妊娠中のマウスをin vivo蛍光イメージングシステムのイメージングチャンバーに仰臥位で配置します。インドシアニングリーン蛍光シグナルをイメージングするための2D蛍光と適切な写真パラメータを選択し、オートへの露出と励起波長と発光波長をそれぞれ710ナノメートルと820ナノメートルに設定します。次に、動物を画像化し、妊娠中のマウスをケージに戻します。
注射の48時間後、Graefe鉗子、Graefe組織鉗子、および解剖ハサミを使用して胎児と胎盤を採取し、採取した組織を動物全体に対して示したように画像化します。胚発生の高周波超音波評価のためには、ナノ粒子注入の24時間後に、麻酔をかけた妊娠中のダムを摂氏37〜42度の予熱超音波イメージングプラットフォームに仰臥位で固定し、40メガヘルツのトランスデューサをメカニカルアームに配置します。次に、トランスデューサーの位置を調整して、焦点ゾーン内の関心領域を持つ胎児と胎盤の縦方向の画像を取得します。
Bモードのイメージングと解析では、Bモードを選択し、胎児と胎盤が見えるまでトランスデューサーを腹部に下げます。[スキャン/フリーズ]をクリックしてイメージングを開始および停止し、[シネストア]をクリックしてシネループを保存し、[フレームストア]をクリックしてフレーム画像を保存します。次に、[測定] をクリックして、胎嚢の長さ、胎児の歯冠の臀部の長さ、両頭頂の直径、腹囲、胎盤の直径、および胎盤の厚さを分析します。
脈波ドップラーイメージングと分析の場合は、同じスキャン投影を使用して、最初に[色]をクリックし、次に[パルス波]を選択し、サンプリングボリュームボックスを臍帯動脈の中央に配置します。[スキャン/フリーズ]をクリックしてイメージングを開始し、[Cine Store]をクリックして臍帯動脈の画像を収集します。次に、[測定] をクリックして、臍帯動脈のピーク速度を計算します。
カラードップラーモードのイメージングと分析では、同じスキャン投影を使用して[カラー]をクリックし、トランスデューサーの位置を調整して、示されているように胎児の心臓の画像を取得します。次に、「測定」をクリックして、保存されたシネ画像ループの胎児心拍数を計算します。高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)分析では、まず、示されているように、妊娠14.5日目のEmbryonic Dayマウスにナノ粒子を単回注入します。
24時間後、妊娠した動物の心臓に氷冷した0.9%生理食塩水50ミリリットルを10分間灌流して、結合していないナノ粒子を取り除き、胎児と胎盤を採取して摂氏マイナス80度で保存します。分析当日、調製したばかりのホモジナイズ溶液500マイクロリットルを各200ミリグラムの組織サンプルに加え、解離ごとに30秒間、サンプルを全速力で2回ホモジナイズします。2回目の均質化後、サンプルを遠心分離し、上清を0.45マイクロメートルのシリンジフィルターでHPLCバイアルにろ過します。
サンプルバイアルを注入用のオートサンプラートレイに入れ、HPLCデガッサーをオンにしてシステムから空気を取り除きます。次に、フローをオンにしてカラムを移動相と 30 分間平衡化し、ベースラインノイズを低減し、カラムの温度を摂氏 25 度に設定します。次に、30分以内に1ミリリットル/分の流量で20マイクロリットルのサンプルを注入し、[メソッドの実行]をクリックして分析を開始します。
分析が完了したら、移動相をHPLCグレードのアセトニトリルに手動で変更し、アセトニトリルを約15分間分析してシステムを保護します。In vivoイメージングでは、胎盤コンドロイチン硫酸結合蛍光標識ナノ粒子注入の30分後に子宮組織に強いインドシアニングリーンシグナルが明らかになり、結合していないナノ粒子は主に肝臓と脾臓領域に局在します。注射の48時間後、胎盤コンドロイチン硫酸結合ナノ粒子を注射した動物の胎盤では蛍光シグナルが観察されますが、胎児内ではシグナルは検出されません。
胎盤コンドロイチン硫酸結合蛍光標識ナノ粒子注入動物の高周波超音波モニタリングにより、主要な胎児および胎盤の発達ランドマークが大幅に減少していることが明らかになりました。興味深いことに、メトトレキサート結合ナノ粒子による処理も、胎児および胎盤の発達をわずかに損なうことがあり、ナノ粒子が強化された透過性と保持効果を介して胎盤へのメトトレキサートの送達を改善する可能性があることを示しています。HPLCによるメトトレキサート濃度の測定は、メトトレキサート結合ナノ粒子注入マウスの胎盤内での保持時間が7分であることを示しています。
注射の24時間後、メトトレキサート結合ナノ粒子注入群の胎盤メトトレキサートレベルは、胎盤コンドロイチン硫酸およびメトトレキサート結合ナノ粒子群で測定されたレベルよりも有意に低く、後者の胎児ではメトトレキサートは検出されませんでした。メトトレキサートは、胎盤コンドロイチン硫酸およびメトトレキサート結合ナノ粒子注射の48時間後も胎盤で検出され、胎盤コンドロイチン硫酸およびメトトレキサート結合ナノ粒子が胎盤を通過できないため、胎児への潜在的な悪影響が最小限に抑えられることを示しています。この手順を試みる際には、胎盤が胚期9日目半頃に形成され始めるため、in vivoイメージング実験は胚期10日目1/2以降に行う方が適切であることを覚えておくことが重要です。
この手順に続いて、免疫蛍光染色や分析などの他の方法を実行して、胎盤内のナノ粒子の局在に関する追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、生殖医療分野の研究者が妊娠合併症における胎盤標的治療の可能性を探求する道を開きました。
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概要
本研究では、胎盤標的薬物配送の安全性と有効性を評価するための新しいシステムを提示します。このシステムでは、生体内イメージング、高周波超音波、およびHPLCを用いて、薬物の蓄積をモニタリングし、胎盤および胎児の発育を評価します。
研究の主要構成要素
科学分野
- ナノメディシン
- ドラッグデリバリーシステム
- 胎盤生物学
背景
- 胎盤への薬物送達を理解することは、母体および胎児の健康にとって極めて重要です。
- ナノ粒子は、標的薬物送達を強化することができます。
- 高周波超音波は、胚の発達に関する知見を提供します。
- 薬効を評価するためには、正確な生化学的測定が不可欠です。
研究目的
- 胎盤への薬剤輸送の安全性および有効性を評価すること。
- 胎盤介在性の合併症に対する治療の精密なターゲティングを確実にすること。
- リアルタイムモニタリングにおける本手法の適用可能性を実証すること。
使用した手法
- ナノ粒子の蓄積をモニタリングするためのin vivoイメージング。
- 胎盤および胎児の発達を評価するための高周波超音波。
- 組織への薬剤送達量を定量化するためのHPLC。
- 妊娠マウスへのナノ粒子の静脈内投与。
主な結果
- この手法により、薬剤送達のリアルタイムモニタリングが可能になります。
- 高周波超音波を用いることで、胚の発達を効果的に評価できます。
- 胎盤内における薬剤濃度の正確な測定が達成されました。
- この技術は、妊娠合併症への対処に有望です。
結論
- このシステムは、胎盤標的型ドラッグデリバリーへの理解を深めます。
- これは、ナノメディシンの今後の研究に向けた枠組みを提供します。
- さらなる研究により、臨床現場における応用の拡大が期待されます。
よくある質問
業界における重要性
胎盤を標的とした薬物送達は、胎児および母体への毒性を最小限に抑えるための精密なターゲティングが不可欠であり、妊娠合併症の治療において依然として重要な未充足のニーズとなっています。このマルチメソッド評価システムは、ナノ粒子を介した胎盤への薬物蓄積の定量的な評価を可能にし、初期探索段階におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。in vivoイメージング、HFUS、およびHPLCを組み合わせることで、標的への結合と組織特異的な保持に関する予測的な信頼性が得られ、胎盤治療薬の開発におけるgo/no-go判断に有用な情報を提供します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：ナノ粒子の生体内蓄積を直接可視化することにより、胎盤標的化の仮説を検証することが可能になります。
- 実用的価値：HPLCを用いて胎盤への薬剤輸送を生物化学的に定量化でき、代替エンドポイントへの依存度を低減します。
- 予測的価値：胎児への移行を伴わずに、メトトレキサート結合ナノ粒子が胎盤に特異的に保持されることを実証し、標的への信頼性を裏付けます。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：ナノ粒子注入、組織採取、および各タイムポイントにおけるマルチモーダル読み取りの整合性のための標準化されたプロトコルを確立します。
- 定量的な出力：HPLCにより、胎盤への薬剤蓄積の用量反応分析を可能にする保持時間と濃度データが得られます。
- 再現性：HFUSにより、群間比較のための一定の発達指標（胎盤径、胎児の頭臀長）が得られます。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性： 胚齢14.5日の妊娠マウスにおける薬剤送達を評価することで、胎盤を介した合併症を直接的にモデル化します。
- トランスレーショナルな一貫性： 相関させたイメージング、超音波検査、および生化学的データを通じて、ナノ粒子の標的化と機能的なアウトカムを関連付けます。
- リスク調整済み進展： 胎児への薬剤移行がないことを実証し、さらなる開発に向けた安全性プロファイリングを裏付けます。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットのバリデーションから前臨床評価に至るディスカバリー・コンティニュアム（創薬連続体）に組み込まれており、胎盤ターゲット戦略の反復的な洗練を可能にします。
- 探索生物学：時空間的なナノ粒子トラッキングを通じて、胎盤コンドロイチン硫酸A結合ペプチドの特異性に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：定義された注入プロトコル、灌流洗浄、およびHPLC用組織ホモジナイズにより、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析：定量的HPLC読み取り値（保持時間7分）およびHFUS由来の発達指標を生成し、多パラメータ評価を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：胎盤への薬剤蓄積を胎児の安全性アウトカムに結びつけ、リスク・ベネフィット評価に情報を供します。
- 企業による再利用：メトトレキサート以外の他のナノ粒子製剤や治療ペイロードに適応可能なモジュール式プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：胎盤特異性を確認し、胎児への移行がないことを立証することで、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：イメージング、超音波、およびクロマトグラフィーのプラットフォームにわたるワークフローを標準化し、多施設間での再現性を確保します。
- 戦略的価値：胎盤を通過しないナノ粒子を早期に特定することで、後期段階での胎児毒性リスクを回避し、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：定量的な組織分布データに基づき、胎盤標的戦略のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の考慮事項
- 齧歯類の外科的手技、静脈注射、および妊娠した母マウスの麻酔管理に関する専門知識が必要です。
- 生体内蛍光イメージングシステム、40 MHzのHFUSトランスデューサ、および蛍光検出器付きHPLCシステムへのアクセスが不可欠です。
- 薬物回収のばらつきを最小限に抑えるため、標準化された組織灌流およびホモジナイズプロトコルが必要です。
- 胎盤形成は胚性9.5日頃に始まるため、最適な注射ウィンドウに影響を与える妊娠時期を考慮しなければなりません。
- 前臨床齧歯類モデルに限定されます。ヒト胎盤への外挿には、ex vivoまたは高度なin vitroシステムでの追加検証が必要です。
