真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna にバインドが検出されます。

この方法は、RNA結合タンパク質がin vivoで特定のRNAにどのように集合し、それによって転写後遺伝子制御を課すかなど、遺伝子発現制御の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、クローニングや遺伝子操作を必要としないことです。あらゆるモデル生物やサブタイプに適応させることができます。

オリゴヌクレオチドを設計するには、オンラインツールを使用してmRNAまたはそのフラグメントの二次構造を解析します。まず、空のボックスにヌクレオチド配列を入力し、次に[基本オプション]ボックスで最小自由エネルギーを選択し、孤立した塩基対を避けます。「Output Options」ボックスで、「Interactive RNA secondary structure plot」を選択し、最後に「Proceed」ボタンをクリックします。

新しいウィンドウがポップアップし、目的のmRNAの二次構造が表示されます。目的のmRNA内で少なくとも3つの異なる21〜24ヌクレオチド長配列を、広範な二次構造を欠く領域で、3プライム非翻訳領域に位置する領域で優先的に選択します。グアニジン/シトシン比が50%に近く、ヌクレオチドタンデムリピートが不足している領域を選択して、ヘアピンの形成や自己アニーリングの可能性を回避します。

3プライムにビオチン部分を持つ2-プライムメトキシ修飾RNAオリゴヌクレオチドを手動で設計し、目的のターゲットmRNA内の選択した領域に完全に相補的になるようにします。適切なオンラインツールを使用して、RNAハイブリッドの融解温度を60〜65度に調整し、言語配列の複雑さを良好に保ちます。Basic Local Alignment Search Toolを使用して、トランスクリプトーム内の他のmRNAとのASOクロスハイブリダイゼーションの可能性を探索します。

Nucleotide BLASTを選択し、空のボックスに配列を挿入して、目的の生物を選択します。残りのパラメータはデフォルトのままにして、[BLAST]をクリックします。10 cmの組織培養皿でHEK293細胞を70%の密度でトランスフェクションします。これには、2マイクログラムのレポーター遺伝子と20マイクロリットルのトランスフェクション試薬を混合し、細胞に添加します。

細胞を摂氏37度のインキュベーターに48時間置いてから、回収します。収穫当日は、血清ピペットで培地を取り出し、摂氏37度に予熱した10ミリリットルのPBSで細胞を2回すばやく洗浄します。次に、6ミリリットルのPBSを皿に加え、氷の上に置きます。

次に、細胞をUVクロスリンカーで100ミリジュール/平方センチメートルの紫外線にさらします。UV曝露後、細胞とPBSをこすり落とし、15ミリリットルのチューブに移します。次に、細胞を250倍gで摂氏4度で10分間スピンダウンします。

ピペットで上清を除去した後、チューブを氷上に保持しながら5〜6回ピペッティングして、2ミリリットルの予冷溶解バッファーに細胞を再懸濁します。ピペットでライセートを氷上に置いた5ミリリットルのチューブに移し、10ミクロンの振幅で20秒のバーストからなる3ラウンド、氷上で30秒の冷却期間を設けて超音波処理します。ライセートを2ミリリットルのチューブに移した後、摂氏4度で10分間、15, 000倍gで遠心分離します。

上清を収集し、新しいチューブに移します。RNA単離を開始するには、500マイクロリットルの溶解バッファーに1ミリグラムのオリゴ(dT)結合磁気ビーズを平衡化します。ローテーターからチューブを取り外し、磁気ラックに置き、溶解バッファーを取り出します。

4ミリグラムのHEK293タンパク質抽出物とオリゴ(dT)25結合磁気ビーズを組み合わせます。サンプルを激しく混合し、摂氏25度で10分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに10秒間置き、上清を取り除きます。

その後の回復ラウンドのために、上清を氷の上に置いておきます。500マイクロリットルの洗浄バッファーAをビーズに加え、5秒間ボルテックスします。ビーズを磁石で集め、次にビーズを500マイクロリットルの洗浄緩衝液で2回洗浄 B.To RNAを溶出させ、30マイクロリットルの10ミリモルTris-HClを加え、チューブを摂氏80度で2分間インキュベートし、1, 000RPMで連続的に振とうします。

チューブを直接磁気スタンドに移し、10秒程度後にできるだけ早く溶出液を回収して、低温でmRNAがビーズに再結合する可能性を防ぎます。その後、繰り返しのラウンドから溶出液を結合し、摂氏マイナス80度で保存することができます。特定のmRNAを捕捉するには、0.1ミリグラム/ミリグラムの大腸菌トランスファーRNAを含む1ミリリットルの結合洗浄バッファーに、30マイクロリットルのストレプトアビジン結合磁気ビーズを添加します。

ローテーター上で室温で1時間平衡化します。1時間後、ビーズを750マイクロリットルの結合液と洗浄バッファーで3回洗浄します。チューブをボルテックスし、B&Wバッファーを取り外し、30マイクロリットルのバッファーに再懸濁し、使用するまで氷上に保ちます。

前回多(A)分離した全タンパク質約35μgを100μLの結合および洗浄緩衝液で希釈し、次に適切なアンチセンスオリゴヌクレオチド200ピコモルを加え、70°Cで5分間インキュベートしてアニーリングを促進します。デバイスからヒートブロック全体を取り外し、室温で10分間置いてゆっくりと冷まします。次に、30マイクロリットルの平衡化ストレプトアビジン結合磁気ビーズをサンプルに加え、混合物を摂氏25度で30分間インキュベートし、ミキサーで950rpmで一定に振とうします。

チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除き、750マイクロリットルの予熱結合でビーズを3回洗浄し、摂氏55度で緩衝液を洗浄します。20マイクロリットルの10ミリモルTris-HClを加え、摂氏90度に置き、950rpmで10分間絶えず振とうしてRNAを溶出させます。10分後、チューブをマグネットスタンドに入れ、すぐに溶出液を回収します。

これは、オリゴ(dT)およびHEK293細胞抽出物からのp27 mRNAへのアンチセンスオリゴヌクレオチドで捕捉された際に、特異的プライマーを使用してRT-PCRでmRNAを検出するために使用されるアガロースゲルです。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含まないコントロールも示されています。入力レーンは、架橋細胞からの全RNAを示しています。

また、poly(A)との競合結果も示しています。ここに示されているのは、mRNA結合タンパク質と、未知のRNA結合タンパク質であるヒト抗原R、およびネガティブコントロールタンパク質であるβ-アクチンを検出した抗体を用いたイムノブロット解析です。このブロットは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたp27 mRNAの捕捉時に、ポリ(A)RNA分離株においてヒト抗原Rが成功裏に検出されたことを示しています。

ヒト抗原Rは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含まないコントロール分離株では検出されませんでした。インプットレーンは、架橋細胞からの抽出物中のタンパク質を示し、poly(A)との競合の結果も示しています。この手順に続いて、質量分析などの他の方法を実行して、in vivoで特定のRNAと相互作用するタンパク質の全サンプルを体系的に分析できます。

重要なことに、TRIPは、RNAタンパク質相互作用の動的配置を理解するために、生物全体のすべてのタイプのポリアデニル化RNAに適応できる汎用性の高いアプローチです。したがって、発生制御されたRNAや疾患関連のRNAの研究に使用でき、最終的には治療介入の新たな標的につながる可能性があります。