散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには
2018年11月1日
ここでは、結合親和性と固定化固相担膜 (SLB) と A2 を同時に測定することによりアネキシン ラベル無料リン脂質結合蛋白質の相互作用のモードを決定するために用いることができる実験的プロトコルを提案する、質量吸収とアネキシン A2 蛋白質の粘弾性特性。
この方法は、脂質膜を有するタンパク質の方向を研究するのに役立ちます.我々の場合、負に荷電したリン脂質に対するアネキシンのカルシウム依存的結合を分析するために使用する。この手法の主な利点は、ラベルフリー、センシティブ、定量的、および相互作用がリアルタイムで観察できることです。
したがって、実際の結果の直接分析を可能にします。この技術は、より複雑なマイクロ分子集合体または細胞の相互作用などの他のシステムにも適用できる。テキストプロトコルに記載されているように、明確な5ミリモル脂質溶液を使用してください。
溶解した脂質を、10ミリリットルのガラスチューブで所望のモル比に組み合わせます。窒素の乾燥した流れを使用して有機溶媒を蒸発させます。脂質混合物を高真空凍結乾燥システムに3時間放置し、残存痕跡を除去します。
さて、クエン酸緩衝液の1ミリリットルに脂質膜を再懸濁する。水浴で30分間摂氏60度で脂質懸濁液をインキュベートし、5分ごとに激しく渦を出します。この温度は、混合物中で最も高い融解脂質の相転移温度を約10°C上回る。
一方、50ナノメートル径の細孔サイズのポリカーボネート膜を30分間過渡温度で装備した押出機を予熱する。マルチラメラ小胞懸濁液を予熱押出機に積み込みます。ポリカーボネート膜を通して31回そっと通過し、小さなユニラメラ小胞またはSUVを形成します。
温度を転移温度より上に保ちます。SUVサスペンションを2ミリリットルのプラスチック反応容器に移し、クエン酸バッファを追加して最終容積を2ミリリットルにします。2%SDS溶液に4つのセンサーを2%SDS溶液に挿入して、少なくとも30分間インキュベートします。
その後、SDSを完全に除去するために、超純水でそれらを広範囲に洗浄し、乾燥アルゴンまたは窒素の流れを使用してそれらを試してみてください。プラズマ洗浄システムを使用して、汚染物質を完全に除去します。そのためには、プラズマ洗浄室にドライセンサーを挿入し、チャンバーを退出し、酸素で3回洗い流します。
次に、プラズマクリーナーの電源を入れます。真空、高周波電力、および10分の処理時間を使用します。クリーニングの実行後、機械の電源を切り、センサーを取り出します。
ピンセットを使用して、プラズマクリーニングされたセンサーを4つのフローチャンバーに慎重にドッキングします。漏れの原因となるチャンバーやチューブの圧力や引き下げは避けてください。オープンフローモードでクエン酸バッファを使用してシステムを10分間フラッシュします。
プログラムを起動します。周波数と散逸ベースラインが安定するまで、ソフトウェアを使用して、最初の基本的なトーンと倍音の周波数と散逸の周波数と散逸の変化を記録し始めます。ベースラインが安定したら、クエン酸バッファにSUVサスペンションを適用します。
反応容器を使用して、1.5ミリリットルのデッドボリュームを取り除き、ループフローモードでシステムを閉じます。さらに 10 分間、周波数の散逸シフトを記録します。SLBが安定している場合、オープンフローモードで必要なカルシウム濃度のランニングバッファを40分間平衡化します。
カルシウムを含む実行中のバッファにタンパク質を加えます。平衡定常状態になるまでループフローモードでタンパク質の適用を行う。さて、オープンフローモードでランニングバッファ内にカルシウムイオンを5ミリモルEGTAでキレートすることにより、結合タンパク質を解約する。
連続的な開いた流れモードで二重蒸留水の50ミリリットルでマイクロバランスシステムを再生します。水容器からチューブを取り出し、システムを乾燥させます。慎重に結晶センサーを取り外し、ポリテトラフルオロエチレンホルダーを使用して2%SDS溶液で洗浄してください。
センサーが配置されたフローモジュール内部の可視部分を乾燥させます。ここに示す、周波数曲線と散逸シフトの記録である。リポソームの添加時の周波数の顕著な低下は、バッファー充填小胞が剛性ではなく粘弾性であるので、その吸収を示し、散逸が増加する。
その後、合体小胞が破裂する。小胞内部のバッファーの付随放出は、安定した高原に達するまで吸着質量を減少させる。脂質へのアネキシンA2の結合は、明確な周波数シフトによって見られるように質量を追加するが、放散のわずかな変化によって示されるように二重層構造を妨げない。
キレート剤によってカルシウムイオンが除去されると、EGTA、アネキシンA2は脂質膜から解離する。周波数と散逸記録は、アネキシンA2結合がカルシウムイオンに完全に依存し、脂質膜がそのまま残っていることを示す二重層で見られるレベルにシフトします。代表的な陰性制御実験をここに示す。
ホスファチジルセリンが存在しない場合、カルシウムイオンの存在下でアネキシンA2を添加した後、頻度または散逸の変化は明らかでない。この手順を試みる間、適切な二重層形成を確保することが重要です。すぐにリポソームを使用し、そうでなければ小さな小胞は不安定なベースラインにつながる可能性があり、より少ない表面張力を持つより大きなものに融合します。
この手順に従って、膜タンパク質相互作用の定量的記述を行い、協力的結合と非協力的結合のような追加の質問に答えることができます。
概要
この記事では、固体支持型バイレイヤーへのアネキシンA2の結合親和性と相互作用モードを決定するためのプロトコルを提示します。この方法により、脂質膜とのタンパク質相互作用のリアルタイム観察が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 生物物理学
背景
- アネキシンA2はリン脂質結合タンパク質です。
- 脂質膜との相互作用を理解することは細胞プロセスにとって重要です。
- この研究は負に帯電したリン脂質へのカルシウム依存性結合に焦点を当てています。
- この方法はラベルフリーで、感度が高く定量的な測定を可能にします。
研究目的
- 固体支持型リピッドバイレイヤーへのアネキシンA2の結合相互作用を分析すること。
- 研究者のための詳細な実験プロトコルを提供すること。
- この方法の他の複雑なシステムへの適用可能性を実証すること。
使用された方法
- 固体支持型リピッドバイレイヤー（SLB）の準備。
- 質量の取り込みと粘弾性特性の測定のための石英クリスタルマイクロバランスの使用。
- 周波数と減衰変化のリアルタイムモニタリング。
- タンパク質解離を研究するためのカルシウムイオンキレーション。
主要な結果
- アネキシンA2の脂質への結合はカルシウム依存性です。
- 周波数のシフトはタンパク質結合による質量変化を示します。
- 相互作用中、安定なバイレイヤー構造が維持されます。
- ネガティブコントロール実験により結合の特異性が確認されます。
結論
- このプロトコルは膜タンパク質相互作用の定量的描写を提供します。
- リアルタイム分析により結合メカニズムへの詳細な洞察が可能になります。
- この方法は他のタンパク質-脂質相互作用の研究に適応可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This label-free, real-time technique enables quantitative assessment of protein-lipid binding dynamics, supporting target validation in membrane-associated pathways. By measuring mass and viscoelastic changes, it provides mechanistic insights into calcium-dependent interactions critical for de-risking early-stage targets. The method supports predictive confidence in screening campaigns by delivering reproducible, quantitative data on binding affinity and specificity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving phospholipid-binding proteins like annexin A2.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative measurement of binding kinetics and calcium dependence.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming specific, reversible interactions with lipid bilayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates robust, reproducible data for assay standardization in membrane protein screening.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding events, facilitating hit confirmation and SAR development.
- Scalability: Compatible with diverse lipid compositions and protein targets, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining native-like lipid environments.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific adsorption.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of target engagement in disease-relevant systems when linked to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for peripherally acting or membrane-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying calcium-dependent binding to anionic lipids.
- Screening: Delivers quantitative frequency and dissipation shifts as primary readouts for compound or mutant evaluation.
- Analytics: Enables comparison of binding affinity, stoichiometry, and reversibility across conditions.
- Translational Research: Maintains structural integrity of lipid bilayers, supporting extrapolation to cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other membrane-binding proteins and lipid systems, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-lipid interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized SLB formation and real-time monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target specificity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated binding mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation and quartz crystal microbalance operation.
- Depends on access to extrusion equipment, plasma cleaners, and fluidic flow systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, calcium concentrations, and regeneration protocols.
- Adaptation to different models requires validation of lipid composition and protein stability under assay conditions.
- Practical limitations include sensitivity to vesicle aggregation and baseline drift if SLB formation is suboptimal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Lipid Vesicle Preparation and Handling the Quartz Sensors
3:03
Microbalance Operation and Cleaning
5:17
Results: Changes in Frequency and Dissipation during Bilayer formation and the Reversible Ca2+-Dependent Interaction of Annexin A2 with the Lipid Bilayer
6:36
Conclusion
