Name: 軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶ、アミロイドβ処理後の軸索成長円錐の可視化手法。マウス胎生14日脳皮質由来培養神経細胞を用い、クラスリン依存性エンドサイトーシスによる成長円錐崩壊を観察する。アルツハイマー病の早期病態機序解明に有用です。

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この作品は、日本学術振興会からの研究補助金によって部分的に支持された (科研費 18 K 07389)、日本、武田科学振興財団、および小林製薬株式会社、日本。

すべての実験ケアと富山大学杉谷キャンパスで実験動物の使用のためのガイドラインに従って実施し、動物と杉谷キャンパスで実験動物の使用委員会によって承認された、富山大学 (A2014INM 1、A2017INM 1)。
1. 崩壊アッセイ
<ol><li>ポリ-D-リジン コーティング<ol>
<li>コートを 5 μ g/mL ポリ-D-リジン (PDL) 400 μ l/8 ウェル文化スライドはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と一晩 37 ° C でそれらを孵化させなさい。</li>
		<li>PDL のソリューションを削除し、蒸留水で 3 回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン文化24<ol>
<li>12% 馬血清、0.6% グルコースと 2 mM L-グルタミン (中 A) を含むニューロン培地の刀と萌芽期日 14 (E14) ddY マウスから新鮮単離の大脳皮質をミンチします。抗生物質を追加しないでください。 メモ: このプロトコル ddY マウスが使用されます。これは、日本でよく使用されるザイモグラムのひずみです。この神経細胞培養のプロトコルをラット大脳皮質ニューロン7,25の適用もできます。</li>
		<li>3 分間 87 x g で組織を遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去します。その後、ペレットに 0.05% トリプシンの 2 mL 追加し、37 ° C で 15 分間インキュベート5 分ごとをタップしてミックスします。</li>
		<li>軽くたたくことによって媒質 A とミックスの 4 つの mL を追加します。</li>
		<li>3 分の 178 x g で組織を遠心します。</li>
		<li>、上澄みを除去し、私は、0.3 mg/mL 大豆トリプシンインヒビターは 37 ° C で 15 分間溶解 PBS で 600 U/mL の組織を孵化させなさい5 分ごとをタップしてミックスします。</li>
		<li>インキュベーション後、軽くたたくことによって媒質 A とミックスの 4 つの mL を追加します。</li>
		<li>3 分の 178 x g で組織を遠心します。</li>
		<li>上清を除去した後媒質 A の 4 つの mL を追加し、洗練されたパスツール ピペットで組織をカップ刻んだ。</li>
		<li>70 μ m 孔サイズ メッシュと摩砕のティッシュをフィルター処理します。濾過後、診断と細胞の密度を計算します。</li>
		<li>文化 8 ウェル培養細胞 104細胞/ウェル中 A × 0.8 でスライドさせ、37 ° C で 10% CO2の加湿雰囲気と CO2インキュベーターでそれらを維持</li>
		<li>培養 4 h 後神経文化、0.6% グルコースと 2 mM L-グルタミン (培地 B) のサプリメントを 1 つ含む 2% に培養液を交換します。 注: 神経細胞の純度は26を前述のように約 75% をだった。</li>
	</ol>
</li>
	<li>崩壊試験27<ol>
<li>商業的得フルレングス アミロイド β 1-42 (Aβ1-42) 0.5 mM の濃度で蒸留水で溶解し、37 ° C で 7 日間インキュベートします。、孵化後使用するまで-30 ° C のフリーザーで集計 Aβ1 42 ソリューションを格納します。 注: このインキュベーション集計と a β27,28,29,30の毒性に必要です。</li>
		<li>4 日間神経培養治療を新しい培地 B の 100 μ l/ウェルは後、は、1 h の Aβ1 42 または車両のソリューション (蒸留水) を集計 0.5 μ M を含みます。 注: Aβ1 42 の効果が、用量依存的 0.1 から 5 μ M に増加し、0.5 μ M27を前述のようにピークに達した。神経文化31の 3 日後 1 h の Aβ1 42 治療でと同様の結果が観測できます。</li>
		<li>培を削除し、ホット プレート上の 37 ° C で 1 時間 PBS で 4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドでニューロンがすぐに解決します。</li>
		<li>固定後、3 回 PBS でニューロンを洗って水土台媒体でそれらをマウントします。2-4 日のための 4 ° C でメディアをマウントを乾燥させます。</li>
		<li>倒立顕微鏡上の 20 X 乾燥対物レンズの各ウェルの全体の区域 (7.8 x 9 mm2) をキャプチャします。</li>
		<li>前述した32,33として段階 3 または 4 軸索、各ニューロンの長い神経突起を分類します。</li>
		<li>次の基準に従って成長円錐の分類: ケラトサイトを欠けているまたは 2) よりも少ない 3 つの突起を有すると見なされます 1) 軸索成長円錐17を前述のように成長円錐を崩壊しました。 注: 健全な成長円錐を 0 ポイントとして獲得しています。折りたたまれた成長円錐は、1 点として採点されています。各治療のためスコアの計算の崩壊を意味します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 アミロイド β 免疫染色
<ol><li>手順 1.2 で 3 日間、マウス大脳皮質ニューロンの文化.</li>
	<li>集計 Aβ1 42 治療 (5 μ M) や CO2インキュベーターで 37 ° C で 4 時間車。</li>
	<li>メディアを削除せず各ウェルに PBS で 4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドの等量を追加し、5 分間ホット プレート上の 37 ° C で文化を維持します。</li>
	<li>ソリューションを 400 μ L の pbs は、4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドに置き換えて、1 h のホット プレート上の 37 ° C で維持します。この固定プロトコルは、以前レポート34から変更されました。</li>
	<li>PBS にニューロンを 3 回洗います。</li>
	<li>PBS で 5% ヤギ血清をブロックします。</li>
	<li>ニューロン マウス抗アミロイド β 免疫グロブリン G (IgG) (1:50)、PBS の 4 ° C でウシ血清アルブミンを 1%、一晩インキュベートします。</li>
	<li>PBS にニューロンを 3 回洗います。</li>
	<li>蛍光標識二次抗体 (1: 400) と PBS で 2 時間室温にウシ血清アルブミンを 1% のニューロンを孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で 3 回ニューロンを洗って水土台媒体でそれらをマウントします。</li>
	<li>倒立顕微鏡 B. 40 X 乾燥対物レンズを用いた蛍光画像と傾斜照明による明視野画像をキャプチャします。</li>
</ol>3. 軸索染色27
<ol><li>1.3.3 の手順で説明するよう培養神経細胞固定後 PBS で 3 回ニューロンを洗ってください。</li>
	<li>マウス抗 tau-1 ニューロンをインキュベート IgG (1: 500) ウサギ抗微小管関連タンパク質 2 (MAP2) 5% ヤギ血清と 0.3 %t - octylphenoxypoly-ethoxyethanol PBS で 4 ° c 一晩 IgG (1: 500)。</li>
	<li>PBS にニューロンを 3 回洗います。</li>
	<li>蛍光標識二次抗体 (1: 400) および 0.3 %t - octylphenoxypolyethoxyethanol PBS で 2 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>PBS で 3 回ニューロンを洗って水土台媒体を使用してマウントします。</li>
	<li>A. 倒立顕微鏡 20 × 乾燥対物レンズを用いた蛍光と差動干渉の対照 (DIC) 画像をキャプチャします。</li>
</ol>4. ライブセル イメージング27
<ol><li>PDL の 500 μ L とガラス ベースの料理をコート (5 μ g/mL)、1.1.1 の手順で説明されているようです。 注: このプロトコルで自家製ガラス ベースの料理が使用されました。市販ガラス ベースの料理をライブ イメージングの使用もできます。自家製ガラス ベースの料理は次のように準備された: 1) 手パンチで 35 mm ディッシュの中央に直径約 1.4 mm の穴を作るし、2)、シリコーンが付いている皿の背面ガラス基板 (直径 22 mm) に取り付けます。</li>
	<li>1.1.2 の手順で説明するように、蒸留水でプレートを洗うし、3 x 10 の4セル/皿中、1.2 の手順で説明したようにガラス皿に皮質ニューロンの文化します。</li>
	<li>細胞培養の 4 日間は、新しい培地 B、2 mL と転送媒体を交換後に皿倒立顕微鏡 A. 維持加湿雰囲気 37 ° C で 10% CO2の文化</li>
</ol>5. エンドサイトーシス実験
<ol><li>手順 1.2 マウス大脳皮質ニューロンの文化.</li>
	<li>4 日後は、新しい培地 B 20 μ M 蛍光膜プローブ 1 分を含むの 100 μ L で媒体を置き換えます。</li>
	<li>ピペッティングで 1 μ 0.05 mM 集計 Aβ1 42 (最終的な 0.5 μ M) や車両 (蒸留水) ソリューションとミックスを追加します。20 分間インキュベートします。</li>
	<li>メディアを取り出して、あらかじめ 37 ° C に加温されている培地 B で 2 回洗浄</li>
	<li>修正、洗浄、1.3.3 および 1.3.4 の手順で説明するようにニューロンをマウントします。</li>
	<li>蛍光と倒立顕微鏡 A の油対物レンズ × 63 DIC 画像をキャプチャします。</li>
	<li>イメージ ソフトウェアを使用して各健全な成長円錐の蛍光膜プローブ陽性領域の密度を定量化します。</li>
</ol>6. 遺伝子導入
<ol><li>ステップ 1.2 に従って、皮質ニューロンを準備します。1.2.1 に 1.2.10 の手順を完了すると、3 分の 178 x g でニューロンを遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去、Ca2 +の 4 つの mL を追加-無料と Mg2 +-無料のハンクス平衡塩溶液 (CMF HBSS) のピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>3 分の 178 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去、CMF HBSS の 4 つの mL を追加し、ピペッティングで混ぜます。次に、手順 1.2.10 細胞密度を計算します。</li>
	<li>5 x 10 の6セルを転送すると、1.5 mL チューブと 1,677 × g で 1 分間遠心します。</li>
	<li>上澄みを除去サプリメントのトランスフェクション溶液の 100 μ L およびエンコーディング EGFP または C 末端 EGFP AP180 DNA のプラスミッドの 3 μ g を追加して、ピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>認定キュベットに上記の解決 (手順 6.6) を転送し、製造元のプロトコルによると、遺伝子導入装置と transfect。</li>
	<li>トランスフェクション、直後後キュヴェットに媒質 A の 500 μ L を追加し、ソリューションを認定ピペットと 1.5 mL チューブに転送します。次に、手順 1.2.10 細胞密度を計算します。</li>
	<li>1.2.11 と 1.2.12 の手順の説明に従って 104細胞/ウェル、× 0.8 で 8 も培養スライドの細胞を培養します。</li>
	<li>手順 1.3 で説明した細胞培養 4 日後崩壊試験を実行します。</li>
</ol>

著者は、何を開示します。

本研究では記述されているプロトコルには、Aβ1 42 治療後軸索成長円錐における初期現象の観察が有効になります。Aβ1 42 20 分以内の軸索の成長円錐におけるエンドサイトーシスと成長円錐の破壊処理の 1 h で観測されていた。このエンドサイトーシスによりクラスリン媒介おそらく。このプロトコルを使用して、クラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制は、Aβ1 42 誘起成長円錐の破壊と27培養神経細胞の軸索変性を防ぐために確認されました。また、クラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制は Aβ1 42 誘発性の軸索変性と27体内メモリの赤字を減衰します。これらの結果は、そのクラスリン依存性エンドサイトーシスが広告防止のための有望な治療上の道を示します。
このプロトコルが開発されたから軸索の成長忌避剤、セマフォリン 3 a と ephrin A516,17<s...

アミロイド β (a β) の預金はアルツハイマー病 (AD) 患者の脳で発見され、メモリ障害2,3,4につながる神経のネットワークを混乱させる広告1の重要な原因と考えられています。アミロイド β (a β) の生産を効果的に防ぐまたは a β の預金を削除する多くの臨床薬の候補者が示されています。しかし、どれも AD 患者5の記憶機能の改善に成功しています。メモリ障害6; 発症する前に脳に a β が沈着既にしたがって、患者の脳内の a β レベルを低下出展記憶障碍なく効果的かもしれません。A β 沈着がある臨床の AD 患者;しかし、これらの患者はほとんど神経変性とメモリの赤字6提示します。A β 沈着と記憶障害との間のタイムラグがあります。したがって、広告の防止のための重要な戦略は、記憶障害の開発の前に、広告の初期の段階でシグナル a β 毒性をブロックされています。A β の沈着を誘導する軸索変性7,8,9,10、11,12,13の崩壊につながる可能性があります。ニューラル ネットワークとメモリ機能の永久的な障害。多くの研究は、a β 毒性のメカニズムを検討しました。たとえば、広告マウス脳の変性した軸索は、オートファジー14を増加するいると示されています。軸索変性の a β による15の可能なメカニズムとしてカルシニューリンの活性化が報告されています。しかし、軸索変性の直接のトリガーは不明のまま。
本研究は成長円錐と呼ばれる軸索終末の崩壊に焦点を当てています。軸索成長円錐の崩壊は、軸索の成長忌避剤、セマフォリン 3 a と ephrin A516,17,18,19、など20によって引き起こされることができます。崩壊のような栄養障害による軸索終末は、AD 患者21,22の脳で観察されています。さらに、成長円錐の機能の障害は、軸索変性23を引き起こすことができます。しかし、a β が成長円錐の破壊を誘発するかどうかは知られています。したがって、本研究は、培養神経細胞における a β の初期効果を観察し、a β による成長円錐の破壊を調査する新しいプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>ddY マウス</td><td>SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8ウェル培養スライド</td><td>ファルコン</td><td>354108</td><td></td></tr><tr><td>poly D リジン</td><td>和光</td><td>168-19041</td><td></td></tr><tr><td>培地・神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ハウス血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>和光</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>和光</td><td>074-00522</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Worthington</td><td>DP</td><td></td></tr><tr><td>大豆トリプシン阻害剤</td><td>Gibco</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>フィルター 70 &micro;mメッシュサイズ、セルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベータ</td>ー <td>Astec</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Amyloid &beta;1-42</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9810</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>和光</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>スクロース&nbsp;</td><td>和光</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>水性封入剤 アクアポリ/マウント</td><td>polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 A</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer Z1&nbsp;</td><td>AxioCam MRm、ヒーティングユニットXL S、CO2モジュールS1、TempモジュールS1に接続</td></tr><tr><td>対物レンズ プランアポクロマート 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ プランアポクロマート 63x</td><td>Carl Zeiss</td><td>440762-9904</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ、CFI プランアポ Lambda 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2 IgG</td><td></td><td>Abcam ab32454</td><td></td></tr><tr><td>anti-tau-1 IgG</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td></td></tr><tr><td>anti-Amyloid &β; 抗体</td><td>IBL</td><td>10379</td><td>クローン 11A1</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>和光</td><td>143-06561</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>和光</td><td>010-25783</td><td></td></tr><tr><td>t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール</td><td>和光</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>日清</td><td>NHP-M30N</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>35mm皿</td><td>岩城</td><td>1000-035</td><td></td></tr><tr><td>シリコーン RTV</td><td>信越</td><td>KE42T</td><td></td></tr><tr><td>ハンドパンチ</td><td>ローパー ホイットニー</td><td>号</td><td></td>XX</tr><tr><td>蛍光メンブレンプローブ、FM1-43FX</td><td>Invitrogen</td><td>F35355</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+- および Mg2+-free ハンクス平衡塩溶液</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション溶液、ヌクレオフェクター溶液</td><td>ロンザ</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター、ヌクレオフェクター I</td><td>アマクサ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 B</td><td>キーエンス</td><td>BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>画像ソフト ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

アミロイド β (a β) アルツハイマー病 (AD) のメモリ障害が発生します。治療は、AD 患者の脳内 a β レベルを減らすために示されている、ただしこれらはメモリ機能を改善しません。以来、メモリ障害の出現の前に脳内の a β を集約、a β をターゲットできないがあります既に記憶障害を示す AD 患者を治療するため効率的です。したがって、a β 沈着による下流シグナリングは、広告開発の前にブロックする必要があります。A β は、ニューロン ネットワークとメモリ障害の混乱につながる軸索変性を誘導します。A β 毒性のメカニズムに関する多くの研究がありますが、a β の毒性の原因は不明のまま。ソースを識別するために、顕微鏡、遺伝子導入、培養神経細胞の軸索の成長円錐における a β による初期の変化を調査するためのイメージングを使用して、新しいプロトコルを提案する.このプロトコルでは、a β は、エンドサイトーシスの阻害が a β 毒性を防止することを示す成長円錐の破壊、続いて軸索の成長円錐におけるクラスリン依存性エンドサイトーシスを誘導を明らかにしました。このプロトコルでは、a β の初期効果の研究に有用であるしより効率的かつ予防の AD 治療につながる可能性があります。

このプロトコルでは Aβ1 42 使用前に 7 日間の 37 ° C で培養された Aβ1 42 の孵化だった有毒フォーム27,28,30,35の生産に必要なため。この後、a β の集計フォーム (図 1 a) を認めた.それは、線維状 a β36Aβ1 42 のような孵化に生産が報告されています。この集計 Aβ1 42 治療後 a β35,37の有毒なオリゴマーの抗体で免疫染色を行ったと培養神経細胞 (図 1 b) に陽性が検出されまし...

ここで、脳にアミロイド β (a β) の初期の影響を調査するためのプロトコルが表示されます。 これは、a β がクラスリン依存性エンドサイトーシスと軸索成長円錐の崩壊を誘発することを示しています。プロトコルは有用性軸索成長円錐の a β の初期の影響が、アルツハイマー病の予防を促進するかもしれない。

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

この方法は、アルツハイマー病研究の分野で重要な質問に答えることができます, 特に成長コーン崩壊に関与する初期のイベント.この技術の主な利点は、アミロイドベータ治療の直後に軸索成長コーンを可視化し、分析することを可能にすることです。抗生物質を含まないニューロン培養培地で、マイクロハサミを使用して、胚性14日目マウスから新たに単離された大脳皮質をミンチすることから始めます。組織を収集し、3分間87Gで組織を遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットに0.05%トリプシンの2ミリリットルを加えます。摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとにタップして混ぜます。15分後、トリプシンを中和するために4ミリリットルのミディアムAを加え、タップして混ぜます。その後、組織を178倍Gで3分間遠心分離する。上清を取り除いた後、DNAseと大豆トリプシン阻害剤溶液を加え、前のように5分ごとに混合して摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、以前のように4ミリリットルの培地A.Mixと遠心分離機を加えます。上清を取り除いた後、4ミリリットルの培地Aを加え、磨かれたパスツールピペットで組織をトリチュレートして、破片が見られないまで行います。次に、70ミクロンの細孔サイズのメッシュで三角組織をフィルター処理します。濾過後、ヘモサイトメーターで細胞を数え、細胞密度を計算します。ピペット0.8倍10〜培地Aの4番目の細胞を8ウェル培養スライドの各ウェルに入れた。その後、摂氏37度で10%CO2の加湿雰囲気でインキュベートします。4時間の培養後、培養培地を培地Bに変更し、この方法を用いたニューロンの純度は、市販の全長Aベータ42の新鮮なバイアルを開き、その内容物を無菌で溶解して、0.5ミリモルの濃度に溶解することにより、少なくとも1週間前にこのアッセイを開始する。7日間摂氏37度でインキュベートし、凝集と毒性を誘発します。集約されたAベータ1-42のアリコートを準備し、使用するまでマイナス80度で保存します。神経細胞培養の4日目に、前述のように1時間、0.5マイクロモル集合体Aβ1-42または車体溶液を1時間の0.5マイクロモル集合でウェルを治療する。時間が経過した後、培養培地を取り除き、すぐに4%パラホルムアルデヒドを含むニューロンをPBSで4%のパラホルムアルデヒドで直し、ホットプレート上で摂氏37度で1時間ずつ固定します。固定は、成長コーンの形状を維持することは、このプロトコルにとって重要であるため、最も重要です。固定後、PBSでニューロンを3回洗浄します。次にチャンバーを取り外した後、水性取り付け媒体でニューロンを取り付ける。取り付け媒体を摂氏4度で2~4日間乾燥させます。20X乾燥対物レンズを逆顕微鏡で取り込み、各井戸の全領域を

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Research

JoVE Journal

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