Name: ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学ぶオートメタログラフィーによる鯨類肝臓・腎臓組織中の銀の局在化と半定量化手法。CHAAを用いて環境毒性学における重金属蓄積評価を行い、海洋哺乳類の健康リスク理解に貢献する。

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私たちはサンプル コレクションとストレージ、台湾鯨社会、台北などの台湾日本鯨類のストランディング ネットワークに感謝します。鯨類研究所 (教授先取特権 Siang 周)、生態学研究所、進化生物学、国立台湾大学、台北。自然科学 (博士 Chiou じゅ八尾)、台中; 国立博物館海洋生物学・日本鯨類研究所国立チェン Kung 大学。我々 はまた彼らの許可の林業局、農業委員会、行政院を感謝します。

国際ガイドラインに従って研究を行い理事会の農業の台湾 (研究許可 104-07.1-SB-62) によって鯨組織サンプルの使用が認められて。
1. 組織誘導結合プラズマ質量分析の前処理
注: 肝臓と腎臓組織を採取から新鮮な死んで、適度いる自己融解座礁鯨類24をはじめ 4 種の 1ハナゴンドウ(Gg) の孤立した鯨類 6 2 Kogia属 (Ko) 2 Lagenodelphis 法政(Lh) 1スジイルカ属 attenuata (Sa)。各座礁鯨は、個体識別のためのフィールド番号を持っていた。誘導結合プラズマ質量分析のための組織サンプル準備か陳のラボで定められた方法に従い、か陳研究室実施誘導結合プラズマ質量分析11,13,25。
<ol><li>座礁鯨類から誘導結合プラズマ質量分析のための肝臓と腎臓の組織を収集し、使用するまで − 20 ° C で保存します。</li>
	<li>肝臓のペアに一致を収集し、同じから腎組織座礁 AMG 解析の鯨類 (手順 2 を参照してください)。</li>
	<li>ステンレス製メスによる誘導結合プラズマ質量分析の収集された組織サンプルの外側の層をトリムします。小さなキューブ (約 1 cm3) に組織サンプルの内側の部分を切り取って、zip ロックの袋にそれらを置きます。通常、各袋には、組織の 10 g が含まれています。</li>
	<li>以降の手順については − 20 ° C に組織サンプルを含むビニール袋を格納します。</li>
	<li>定数に秤量することにより完全に乾燥凍結試料乾燥システム (-50 ° C 少なくとも 98 L/分、0.002 mBar の変位を真空ポンプ) 少なくとも 72 時間までの 1 cm3のキューブを置きます。</li>
	<li>その後ティッシュの消化力のためのホモジナイザーと粉に乾燥したキューブを均質化します。</li>
	<li>ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 瓶 30 mL の均質化試料の 0.3 グラムの重量を量るし、65%/w 硝酸 10 mL でそれらをミックスします。</li>
	<li>PTFE ボトルにクロージャを置くが、untightened クロージャのまま。 注: これにより、PTFE のボトルと逆流でフォームに茶色のヒューム消化ボトル中茶色の煙が消えるし、が明確になるまで。</li>
	<li>2 ~ 3 週間まで PTFE 瓶褐色のガスが無色になる、PTFE ボトルの液体になる半透明 gree PTFE ボトルで (成形条件茶色ヒューム) によると 110/120 ° C ~ 30 ° C からのホット プレートなどの実試料を熱します。ニッシュ淡い黄色または完全にオフにします。 注: は、化学の発煙のフード暖房プロセスを実行します。</li>
	<li>唯一 0.5-1 まで PTFE ボトルに硝酸を蒸発させるための 120 の ° c の実試料を熱 mL のまま。 注: 化学の発煙のフードでは、加熱プロセスを実行し、常に PTFE ボトルのクロージャから褐色のガスが漏れないように温度上昇を監視します。</li>
	<li>クロージャを締めるし、約 1 時間室温で冷ます。</li>
	<li>フィルターとファンネル論文 25 mL メスフラスコと 25 mL の最終巻に 1 M 硝酸溶液3残りの液体の洗浄の場所。 注: は、二度と閉鎖の少なくとも 3 回の瓶を洗います。</li>
	<li>冴えない男 2 (ツノザメ肝) と寮 2 (ツノザメ筋肉) を含む標準試料を用いた誘導結合プラズマ質量分析の分析の品質を検証します。</li>
	<li>各分析サンプルの重複および誘導結合プラズマ質量分析用標準物質のトリプリケートを使用します。</li>
	<li>各分析サンプルの Ag 濃度を平均し、乾燥重量基礎濃度 (μ g/g 乾燥重量) としてデータを表示します。</li>
</ol>2. AMG 解析ティッシュ サンプルの準備
<ol><li>座礁クジラ目の動物から AMG の分析のためのペアをマッチさせた肝臓と腎臓組織を収集し、使用するまで 10% 中性緩衝ホルマリンでそれらを修正します。 注: は、24 ~ 48 時間 10% 中性緩衝ホルマリン (NBF、pH 7.0) のプラスチックびんの組織サンプルを格納します。NBF のボリュームを少なくとも 10 倍以上の組織ボリュームにする必要があります。</li>
	<li>ステンレス鋼の使い捨てのミクロトーム刃と肝臓と腎臓組織を固定ホルマリンをトリミングし、トリミング切片を入れてラベル カセット。 注: 各切片の大きさは約 2 cm × 1 cm にする必要があります、各切片の厚さが超えない 3 mm. 同じカセットに同じ個体から肝臓と腎臓の組織を置きます。</li>
	<li>脱水、トリミングされたティッシュ セクション傾斜エタノール (1 h 70%、1 h の 80%、95 %1 h、2 h の 95%、1 h × 2、料理を染色の 100%、2 h で 100%) のシリーズを介して組織プロセッサと非-キシレン (1 h と異なる染色料理 2 h)、parafﬁn (1 h と異なる染色料理 2 h) のための脱水の組織サンプルを浸す。</li>
	<li>鋼の組織型の底の水分を取り除かれた組織サンプルを配置し、パラフィンと脱水組織サンプルを埋め込みます。</li>
	<li>パラフィン凝固までコールド プレートにパラフィン (FFPE) ティッシュのブロックを固定ホルマリンを冷やします。組織面が露出するまで FFPE ブロックをミクロトームでトリミングします。</li>
	<li>− 20 ° C で 10 分間セクション 5 μ m で FFPE ブロック FFPE ブロックをミクロトームでチルします。</li>
	<li>45 ° C で二重蒸留水で水浴を埋めるティッシュ セクションのリボンを持ち上げ、ピンセットやブラシを使用して、暖かい水の表面に浮くようにします。</li>
	<li>ピンセットでティッシュ セクションのリボンを区切ります。顕微鏡スライド上にセクションを配置します。</li>
	<li>暖かいスライドの顕微鏡スライドを配置でき、37 ° C で一晩乾燥してセクション</li>
	<li>顕微鏡スライドをスライド ラックに入れ、純粋な非-キシレン (およそ 200 に 250 mL)、8、5、3 分の 3 つの異なる染色料理でそれらを浸すことによってそれらを deparaffinize します。</li>
	<li>傾斜エタノール溶液 (100% エタノール二度、一度 90% エタノールと 80% エタノール一度 【 1 分 】) の異なる染色料理でそれらを浸すことによってスライド ラックに切片をメタンハイド レートし、ダブル蒸留水でそれらをすすいでください。 注: これらのソリューションは、異なる染色料理約 200 ~ 250 ミリリットルです。各洗浄のため 30 秒は十分です。</li>
	<li>組織の節リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 0.5% トリトン X-100, いくつかのための PBS の回と二重蒸留水で洗い、洗浄リンス。 注: これらのソリューションは、異なる染色料理約 200 ~ 250 ミリリットルです。それぞれは、30 秒で十分です。</li>
	<li>暗闇の中で銀の強化キットによって提供される 3 つのコンポーネント (イニシエーター、モデレーター、および活性化) の同量を準備し、それらを徹底的にミックスします。 注意: モデレーターとアクティベーターのソリューションは粘着性がある、使用してください広い先端開口を有するピペット (またはより広い開口部を作成するためのヒントをカット)。スライドごとに 300 μ L の混合液 (ティッシュ セクションのサイズ) によって異なりますが通常は十分です。したがって、10 のスライドを使用する場合、各コンポーネント (イニシエーター、モデレーターや活性剤) の量は 1000 μ L (混合液はスライドは 10 枚のため 3000 μ L) です。</li>
	<li>室温で暗闇の中で 15 分間混合溶液中ティッシュ セクションを孵化させなさい。混合溶液をスライドにティッシュ セクションを完全にカバーします。偽陽性 AMG 信号インキュベーション時間がかかる可能性があります。</li>
	<li>二重蒸留水とスライドを洗って、それらを 10 のヘマトキシリンで染色、対比染色として s。</li>
	<li>水道水を実行しているスライドを洗って水気をメディアをマウントでそれらをマウントします。</li>
	<li>光学顕微鏡でスライドを確認します。</li>
	<li>ランダムにコンピューターのイメージング ソフトウェアで接続されたデジタル カメラを使用して各組織切片から 40 倍対物レンズ 10 組織学的イメージをキャプチャします。</li>
</ol>3. 半定量的な解析 AMG 組織標本画像の正の値を
注: AMG の正の値は、AMG の肯定的な信号を持つ領域の割合を意味します。
<ol><li>画像解析ソフト (ImageJ) を使用して、組織のイメージを分析します。</li>
	<li>ファイルを押すことによって組織の画像を開く |オープン。</li>
	<li>画像を押すことで選択した画像を 3 つのカラー チャンネル (赤、青、および緑) 分割 |種類 |RGB スタックします。
</li>
	<li>青のチャネルを使用して AMG の肯定的な信号を定量化します。核の偽肯定的な信号は通常青のチャネルの下で低下したヘマトキシリン染色が核対比染色 (図 2) に適用されます。</li>
	<li>AMG 肯定的な信号をしきい値ツールと各組織の画像領域の割合を測定 (画像 |調整 |しきい値)。</li>
	<li>核および/または赤血球の偽肯定的な区域のプレゼンスに基づく (110 90) から各組織画像の閾値のカットオフ値を手動で調整します。 注: 既定の設定、AMG の肯定的な信号は赤色でハイライトする必要があります。</li>
	<li>プレス分析 |測定の設定、し面積率を記録することを指定する面積率のボックスをご確認ください。</li>
	<li>プレス分析 |メジャー。各組織学的イメージの肯定的なパーセント領域が% 地域の結果ウィンドウの列に表示されます。</li>
	<li>各組織切片から 10 組織標本画像の肯定的なパーセント エリアを平均し、各切片に AMG の正の値として結果を定義します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig2.jpg"> 図 2: 異なる色チャネルの下で核の偽肯定的な信号の存在 (対比染色: ヘマトキシリン染色).代表的な核の偽肯定的な信号は黄色の矢印で示されます。PPA 領域の正のパーセント値を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
4. 回帰モデルによる鯨類の組織学的 Ag アッセイ (チャー) の確立
注: 次の分析は、Windows 用プリズム 6.01 で実行です。
<ol><li>ICP-MS の結果と AMG 正の値との相関を評価します。</li>
	<li>ソフトウェアを開き、新しいプロジェクト ファイルを作成、 XYを選択し、相関します。
</li>
	<li>ICP-MS と AMG の正の値の結果を含むデータを入力。</li>
	<li>分析を押し、ピアソン相関解析による ICP-MS の結果と AMG の正の値の間の関連の強さを分析するXY 分析カテゴリの下に相関を選択します。 メモ: 誘導結合プラズマ質量と AMG の正の値の結果がお互いと正の相関があります。そうでなければ、その後回帰モデルは開発されない必要があります。</li>
	<li>線形回帰、二次回帰式、回帰、および統計ソフトウェア12,26,27を通じての原点を線形回帰を含む回帰モデルを統計的に比較します。 注: 回帰モデルでは、非現実的な Ag 濃度を生成する場合は、放棄された12が回帰モデルでする必要があります。</li>
	<li>データ テーブル (左側のパネル) に戻るし、分析を押す |非線形回帰 (近似曲線) XY 分析カテゴリの下 |[Ok]をします。</li>
	<li>ウィンドウでパラメーター: 非線形回帰フィットページに異なる回帰モデルを選択し、比較ページで異なる回帰モデルを比較します。</li>
	<li>比較ページで比較メソッド、余分な合計の二乗 F 検定と赤池の情報量規準 (AIC) を含むを選択します。比較メソッドの結果によると、サーチャーで比較的適切な回帰モデルを使用します。</li>
	<li>チャーを使用して不明な銀濃度と鯨の肝臓と腎臓の組織の Ag 濃度を見積もる。</li>
	<li>精度と肝臓と腎臓組織のチャーの精度を評価します。精度と確度の違いを図 3に示します。</li>
	<li>精度: は、知られていると推定される Ag 濃度の違いから平均標準偏差 (SD) を計算します。</li>
	<li>精度: は、同じ FFPE 組織から連続切片の AMG の正の値の (少なくとも帳票) 繰り返しの測定を実行します。知られていると推定される銀濃度との間の違いから肝臓や腎臓の組織からの測定値の平均 SD を計算します。 注: 精度と精度の評価の方法は、図 4に描かれています。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig3.jpg"> 図 3: 精度と精度の違い。精度を意味する測定が (すなわち、 ICP-MS による Ag 濃度); の真の値に近いか精密測定 (すなわち、 AMG 帳票ティッシュ セクションからの正の値の繰り返し測定間の整合性) の再現性を意味します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig4.jpg"> 図 4: 正確さと精度の評価の方法を描いたスキーム。チャー = 鯨組織 Ag の試金;FFPE = ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた;ICP-MS = 誘導結合プラズマ質量分析法;Ai = 各ペアをマッチさせた組織サンプルの ICP-MS による Ag 濃度のそれぞれBi = 各ペアをマッチさせた組織サンプルのチャーの Ag 濃度のそれぞれEi、Di と Ci = 各ペアをマッチさせた組織サンプルから帳票サンプルのチャーの Ag 濃度のそれぞれ私 n に 1 を =。代表的な結果のセクションの正確さと精度のテストの raw データを参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
5. チャーによる Ag 濃度の推定。
<ol><li>座礁鯨類から肝臓と腎臓組織を収集し、10% 中性緩衝ホルマリンでそれらを修正します。</li>
	<li>日常的にホルマリン固定組織を処理 (手順 2 を参照してください)。</li>
	<li>チャーで Ag 濃度が不明な鯨の肝臓と腎臓の組織の Ag 濃度を推定 (手順 3 と 4 を参照してください)。</li>
</ol>

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論文研究の目的は、suborgan レベルで Ag 分布を評価して Ag の鯨類の組織内濃度を推定する補助方法を確立することです。現在のプロトコルは、ICP-MS、知られている Ag 濃度とペアをマッチさせた組織試料の 2) AMG 分析 3) Ag 濃度を推定する回帰モデル (チャー) の確立による鯨類の組織 1) Ag 濃度の測定AMG の正の値、4) が精度とチャー、及び 5 の精度の評価) チャーによる Ag の推定濃度。
本研究では ICP-MS のデータ大幅かつ積極的には有意に AMG の正の値、AMG の正の値で鯨類体内 Ag 濃度を推定できることを示唆しました。したがって、AMG の正の値、回帰モデルに基づくチャーは Ag の鯨類の肝臓と腎臓の組織内濃度を推定するためにしてきた.一般に、回帰モデル (すなわちより複雑な回帰モデル) より多くのパラメーターをデータによく合うが、それはより複雑な 1 つは実際に単純な 1 つのより断固としたではないです。したがって、最適な回帰モデルの統計的解析26<sup...

銀ナノ粒子 (AgNPs) は、商業製品、繊維製品、化粧品、その偉大な抗菌効果1,2のためのヘルスケア アイテムなどで広く使用されています。したがって、AgNPs、AgNP 含有製品の数の生産は時間3,4に増加しました。しかし、AgNPs は環境に放出される可能性があります、海5,6に蓄積されます。銀汚染の主要なソースとなっているし、Ag の環境毒性の国民の意識が増加しています。
海洋環境における AgNPs と銀の状態は複雑で絶えず変化します。以前の研究は、粒子、集計、溶解、化学種と反応や Ag+イオン7,8からを再生成すると AgNPs が残ることができることを示されています。銀化合物、塩化銀などのいくつかの種類は、海底堆積物、彼らが底生生物が摂取することができ、食物連鎖の9,10」と入力で発見されています。台湾の南西部の海岸に沿ってチー区ラグーン エリアで行われた以前の研究によると海底堆積物中の Ag 濃度が非常に低く、地殻の存在と同様、魚の肝臓組織の通常検出下(&lt; 0.025 μ g/g ウェット ・ ウェット)11を制限します。ただし、さまざまな国で行われた以前の研究は、鯨類12,13の肝臓で比較的高い Ag 濃度を示しています。鯨類の肝における Ag 濃度は年齢に依存する自分の体で Ag のソースが最も可能性の高い彼らの獲物の12であることを示唆しています。さらにこれらの調査結果より高い栄養レベルで動物の Ag の biomagnification をお勧めします。クジラ、海、頂点捕食者として受けた可能性があります銀/銀化合物12,13,14によって引き起こされる負の健康への影響。クジラ目の動物のような最も重要なことは、人間では哺乳類、鯨類の銀/銀化合物によって引き起こされる影響がヒトでも発生する負の健康。つまり、鯨類は、sentinel 動物海洋環境および人間の健康のため可能性があります。したがって、健康への影響、組織分布、鯨類の銀の濃度は大きな関心事です。
誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による鯨類体内 Ag/銀化合物の濃度が測れる、ICP-MS の使用 (楽器と保守)、高資本コストおよび組織のストレージの要件によって制限されます。/preparation12,15。さらに、通常物流の困難は、労働力の不足と関連リソース12の不足のため座礁鯨ケースのすべての調査で包括的な組織サンプルを収集することは困難です。誘導結合プラズマ質量分析のための凍結するティッシュ サンプルは、限られた冷凍スペースのため簡単に格納されず、壊れた冷凍機器12 のため凍結するティッシュ サンプルに破棄される可能性があります。これらの前述の障害は、凍結組織試料を用いた誘導結合プラズマ質量分析による鯨類の体内汚染レベルの調査を妨げます。対照的に、ホルマリン固定組織サンプルが比較的死者座礁鯨類の死体解剖の間に集めやすいです。そのため、ホルマリン固定組織サンプルを用いて鯨類体内重金属の検出/測定に使いやすい、安価な方法を開発する必要があります。
Suborgan 分布とアルカリ及びアルカリ土類金属の濃度は、ホルマリン固定中に変更される可能性があります、パラフィン (FFPE) プロセス、Ag などの遷移金属の低い効果だけは指摘した16をされています。したがって、FFPE 組織は金属および測定16,17理想的なサンプル リソースとして考えられています。Autometallography (AMG)、組織化学的プロセスは FFPE 切片の黒い AMG の肯定的な信号に可変サイズのゴールデン イエローとして重金属を増幅することし、光顕18,の下でこれらの増幅された重金属を視覚化できます。19,20,21します。 したがって、AMG メソッドは、重金属の suborgan 分布に関する情報を提供します。ICP-MS のみ臓器レベル18の重金属の濃度を測定できるので生物における重金属の代謝経路を研究するための重要な追加情報を提供できます。さらに、ImageJ など、デジタル画像分析ソフトウェアは、組織学的組織のセクション22,23の定量分析に適用されています。FFPE 切片の黒い AMG の肯定的な信号を可変サイズの黄金色を定量化し、重金属類の濃度を推定するために使用することができます。それを画像の定量的解析と ICP-MS、鯨の名前はから得られるデータに基づく回帰モデルによって推定できる画像定量解析を用いた AMG 法による絶対 Ag 濃度を直接判断できないが組織学的 Ag 試金 (チャー)。最も孤立した鯨類の誘導結合プラズマ質量分析法による Ag 濃度を測定の難しさを考慮したチャーは鯨類体内の不足のための誘導結合プラズマ質量分析によって確定できない Ag 濃度を推定する貴重な補助方法冷凍組織サンプル。Suborgan レベルと Ag の鯨類の肝臓と腎臓の組織内濃度を推定するチャーというアッセイで Ag のローカライズに関する組織化学的手法 (AMG 法) のプロトコルについて述べる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58232/58232fig1.jpg"> 図 1: Ag 濃度を推定するための確立と鯨類の組織学的 Ag 試金 (チャー) のアプリケーションを描いたフローチャート。チャー鯨類の組織学的な Ag の試金、FFPE を = = ホルマリン固定、パラフィン包埋、ICP-MS = 誘導結合プラズマ質量分析法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58232/58232fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>HQ 銀強化キット</td><td>ナノプローブ</td><td>#2012</td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>パラフィン</td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>武藤純薬(株</td>) <td>4026</td><td></td></tr><tr><td>非キシレン</td><td>武藤純薬(株</td>) <td>4328</td><td></td></tr><tr><td>シランコーティングスライド</td><td>武藤純薬(株</td>) <td>511614</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (25 x 50 mm)</td><td>武藤純薬工業株式会社</td><td>24501</td><td></td></tr><tr><td>マリノール</td><td>武藤純薬工業株式会社</td><td>20092</td><td></td></tr><tr><td>GMヘマトキシリン</td>染色<td>武藤純薬工業株式会社</td><td>3008-1</td><td></td></tr><tr><td>10%中性緩衝ホルマリン溶液</td><td>チン・イ・パオ株式会社</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Tip (1000 &mu;L)</td><td>MDBio株式会社</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>ピペットマン クラシック P1000</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F123602 15 ml 遠心チューブ</td><td>GeneDireX, Inc.</td><td>PC115-0500</td><td></td></tr><tr><td>Dogfish liver</td> National <td>Research Council of Canada</td><td>DOLT-2</td><td></td></tr><tr><td>Dogfish muscle</td><td>National Research Council of Canada</td><td>DORM-2</td><td></td></tr><tr><td>誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS)</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>PE-SCIEX ELAN 6100 DRC</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 6リットル凍結乾燥システム</td><td>Labconco</td><td>7752030</td><td>凍結乾燥用</td></tr><tr><td>BRAND&reg;SILBERBRAND容積フラスコ</td><td>メルク</td><td>Z326283</td><td></td></tr><tr><td>30 mL標準バイアル、フラットインテリア、33 mmクロージャー付き</td><td>Savillex Corporation</td><td>200-030-12</td><td>診断用</td></tr><tr><td>硝酸、スーパーパー&reg;、65.0%</td><td>メルク</td><td>1.00441</td><td>診断用</td></tr><tr><td>ホットプレート/スターラー</td><td>コーニング&reg;</td><td>PC-220</td><td>診断用</td></tr><tr><td>高剪断ラボミキサー</td><td>シルバーソン</td><td>SL2T</td><td>均質化用</td></tr><tr><td>滅菌ポリプロピレンサンプルジャー (250mL)</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>6186L05</td><td>均質化用</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ニコン株式会社</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ニコン株式会社</td><td>ECLIPSE Ni-U</td><td></td></tr><tr><td>Shandon&trade;フィネス&トレード;325手動ミクロトーム</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td></td><td></td>A78100001H</tr><tr><td>アキュカット&reg;SRM&trade;200回転式ミクロトーム</td><td>さくら</td><td>1429</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム刃 S35</td><td>FEATHER&reg;</td><td>207500000</td><td></td></tr>スライド<tr><td>染色皿とカバー</td><td>脳研究所</td><td>#3215</td><td></td></tr><tr><td>鋼染色ラック</td><td>脳研究所</td><td>#3003</td><td></td></tr><tr><td>シャンドン埋め込みセンターThermo</td><td>Scientific&trade;</td><td>S-EC</td><td></td></tr><tr><td>シャンドン シタデル &reg; ティッシュプロセッサ</td><td>サーモサイエンティフィック & 貿易;</td><td></td><td></td>69800003</tr><tr><td>スライドウォーマー</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>26005</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>シャンドン Capshaw</td><td>3964</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>メルク</td><td>1541-070</td><td></td></tr><tr><td>プリズム 6.01 for windows</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>国立衛生</td><td></td><td></td>研究所</tr><tr><td>ステンレス鋼ティッシュ埋め込み金型</td><td>Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd</td><td>RD-TBM003</td>パラ<td>フィン埋め込み用</td></tr></tbody></table>

ローカライズする autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues

銀ナノ粒子 (AgNPs) は、商業製品、繊維製品、化粧品、彼らの強力な抗菌効果のためのヘルスケア アイテムなどで広く使用されています。また、環境中に放出されることがあります、海に蓄積されます。したがって、AgNPs は銀汚染の主な原因で、Ag の環境毒性に対する国民の意識が増加しています。以前の研究は、(生産者) の蓄積と Ag の (消費者/捕食者) の倍率を示しています。クジラ、海の頂点捕食者として否定的に遭った Ag/銀化合物による。誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) による鯨類体内 Ag/銀化合物の濃度を測定できますが、ICP-MS の使用は資本コストが高いと組織にストレージを/準備の要件によって制限されます。したがって、autometallography (AMG) 法を用いた画像定量分析にホルマリン固定、suborgan レベルで Ag イオン分布をローカライズし、鯨で Ag 濃度を推定する補助メソッドがあります (FFPE) 組織のパラフィン包埋組織。AMG の肯定的な信号は主に近位尿細管上皮、肝細胞、クッパー細胞の細胞質で様々 なサイズの黒い顆粒に茶色です。時折、内腔といくつかの近位腎尿細管基底膜の茶色の AMG の肯定的な信号をいくつかの非晶質の黄金色が記載されています。Ag 濃度を推定するための試金、鯨組織 Ag の試金 (チャー)、AMG 法と誘導結合プラズマ質量の画像定量的解析からのデータによって設立された回帰モデルであるといいます。AMG をローカライズするチャーと半定量化重金属の使用は、時空とクロス種の研究の便利な方法を提供します。

鯨の肝臓と腎臓の組織で AMG の肯定的な信号の代表的なイメージは、図 5のとおりです。AMG の肯定的な信号には、近位尿細管上皮、肝細胞、クッパー細胞の細胞質の様々 なサイズの黒い顆粒に可変サイズのブラウンがあります。時折、内腔といくつかの近位腎尿細管基底膜の茶色の AMG の肯定的な信号を非晶質の黄金色が記載されています。ICP-MS の結果と肝臓と腎臓組織に AMG 陽性値には正の相関があるし、の原点を線形回帰は最寄りの二乗の合計の余分な F 検定と AIC12,26によると 27。精度テストで平均肝臓と腎臓のチャーの SDs は 3.24 0.16 で、それぞれです。精度テストでは、平均の肝臓と腎臓のチャーの SDs、2.8、0.35 がそれぞれ。精度試験の生データを表 1にまとめます。...

プロトコルは、autometallography による鯨の肝臓と腎臓の組織で Ag をローカライズするのに提示されます。さらに、それらのティッシュの Ag 濃度を推定する鯨類の組織学的 Ag 試金 (チャー) という、新しいアッセイを開発します。

ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used in commercial products, including textiles, cosmetics, and health care items, due to their strong ...

この方法は、生体内の重金属のサブ器官分布と濃度に関する環境毒性学の分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、AMGが使いやすく安価な方法論であり、組織中の重金属を調査するための貴重なアジュバントであるということです。私たちは、プロトコルを実証するためにイルカやクジラからの組織を使用しています。しかし、このプロトコルは様々な動物種に使用できると考えています。Wen-Ta Liとの手順を実証することは、私たちの研究所の臨床医であるShun Thengになります。まず、鎖でつながれた鯨類からAMG分析のためにペアマッチした肝臓と腎臓組織を収集し、24〜48時間の10%中性緩衝ホルマリンの体積の10倍の体積で組織を固定することから始めます。次に、使い捨てステンレススチールのミクロトームブレードを使用して、ホルマリン固定肝臓と腎臓組織を1センチメートル、3ミリメートルの切片で2センチメートルにトリミングし、同じ個人の肝臓と腎臓の両方の切片を同じ標識カセットに入れる。一連のグレード付きエタノールとキシレン浸漬を通じて組織プロセッサのセクションを脱水し、続いて1時間と2時間のパラフィン浸漬を行います。2時間のパラフィン浸漬後、組織を鋼組織の鋳型の底に移し、脱水組織サンプルに新鮮な溶けたパラフィンを埋め込みます。ホルマリン固定のパラフィン埋め込み組織ブロックを冷たいプレートに固めるまで冷やし、組織表面が露出するまでミクロトームで各ブロックをトリミングする。サンプルをマイナス20度で10分間冷やし、ミクロトーム上で5マイクロメートルの組織切片を得る。ピンセットとブラシを使用して、組織セクションのリボンを獲得時に持ち上げ、45°Cの二重蒸留水浴の表面に浮かべ、分離できるまで、個々の顕微鏡スライドに置きます。その後、スライドをスライドウォーマーの上に1時間、摂氏60度で置きます。次に、スライドをスライドラックに入れ、8分と3分間のインキュベーションのために200〜250ミリリットルの純粋な非キシレンを含む3つの異なる染色皿でセクションを非パラフィン化します。脱パラフィン化されたサンプルを、等級エタノール溶液の異なる染色皿で水和し、続いて二重蒸留水ですすいだ。5%トリトンX100を補うPBSでセクションを1回リンスし、PBS単独で数回、1回は洗浄ごとに30秒間新鮮な二重蒸留水で1回洗い流す。最後の洗浄後、各サンプルに300マイクロリットルの混合銀強化キット溶液をラベル付けし、室温で暗闇の中で15分以下にします。インキュベーションの最後に、二重蒸留水でスライドを洗浄し、1枚あたり300マイクロリットルのヘマトキシリンで10秒間セクションを反染色します。水道水でスライドを洗います。それらを乾燥させ、取り付け媒体でセクションを取り付けます。次に、各組織部のランダムな

use-autometallography-to-localize-semi-quantify-silver-cetacean

Research

JoVE Journal

Environment

環境

出典:Hare, D. J., et.al.レーザーアブレーション-誘導結合プラズマ-質量分析(LA-ICP-MS)による脳組織中の金属のイメージング。J. Vis. Exp.

レーザーアブレーション誘導結合プラズマ質量分析法によるマウス脳組織中の金属の可視化

本稿では、空間相関化学的、構造的、およびナノインデンテーションを用いAtractosteusへらの多層スケール（A.ヘラ ）の機械的特性をプロービングするために使用される方法を提示し、フーリエ変換赤外（FTIR）分光法、走査電子顕微鏡（SEM）およびX-線が断層撮影（X線CT）を計算しました。実験結果は、保護生物学的材料の設計原理を調査するために使用されてきた。...

多層魚の鱗の特性（<em&gt; Atractosteusヘラ</em&gt;）ナノインデンテーション、X線CT、FTIR、およびSEMを用いて

このプロトコルは、鯨類のミオグロビンに強く反応する2つのIgGクラスモノクローナル抗体(mAb)の開発について説明しています。これらのモノクローナル抗体は、サンドイッチフォーマットに基づく金コロイドイムノクロマトグラフィー試験ストリップに適用され、鯨類のMbをアザラシや他の動物と区別します。...

クジラミオグロビンの検出のための金コロイドベースのイムノクロマト法テストストリップの開発

胚期は最も生体異物の影響を受けやすいです。化学的毒性は塩分に依存しますが、水生生物に対する毒性の塩分依存性を試験する方法は存在しません。ここでは、水生胚に対する毒性の塩分依存性を決定するための新しいハイスループットな方法について説明します。...

メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)でハイフンでつながれたSize exclusion...

サイズ排除ICP-MSを用いた定量Metalloproteomic分析のための基準

水生環境での微量金属研究のための水サンプルを適切に収集し処理するためには、「クリーンな技術」を使用した特別な注意が必要です。詳細な微量金属研究のための信頼性の高い環境モニタリングデータと高感度の結果を得ることを目的とした、サンプリング、処理、および分析手順のプロトコルが提示されます。...

きれいなサンプリングと微量金属の研究のために川や河口ウォーターズの分析

定量的にレーザアブレーションによって組織に金属をマッピングする - 誘導結合プラズマ - 質量分析法（LA-ICP-MS）は、金属が正常な機能と疾患過程に関与どのように新たな洞察を提供することができます敏感な分析技術です。ここでは、定量的にマウス神経組織の薄い部分に金属を画像化するためのプロトコルについて説明します。...

誘導結合プラズマ -   - レーザーアブレーションによる脳組織におけるイメージング金属質量分析法（LA-ICP-MS）

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マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

プランクトンや懸濁粒子は、海の物質循環に大きな役割を果たします。ここでは、海水の大量の処理能力を持つ、超クリーン、低応力法の粒子と海でプランクトンの様々...

サイズ分画した海洋プランクトンや懸濁粒子を収集するための超きれいな積層装置

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて調製した試料に導入した金属を容易に定量するためのアッセイを提示する。この方法は、比色金属指標としてヒドロキシナフトールブルーを使用し、UV-Vis分光光度計を検出器として使用する。...

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおける金属浸出の定量

このプロトコルは、鯨類環境DNA(eDNA)サンプルをホエールウォッチング船から採取するための標準化されたワークフローを記述しています。研究者や訓練を受けた市民科学者の実現可能性が優先され、環境条件、ろ過時間、濁度、船内物流が実際の適用限界を定めます。...

鯨類モニタリングのためのホエールウォッチング船からの環境DNAサンプリング

学ぶオートメタログラフィーによる鯨類肝臓・腎臓組織中の銀の局在化と半定量化手法。CHAAを用いて環境毒性学における重金属蓄積評価を行い、海洋哺乳類の健康リスク理解に貢献する。

ローカライズする Autometallography と鯨類体内半定量化の銀の使用

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