Name: Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶCas9リボヌクレオタンパク質を用いたヒトNK細胞の遺伝子ノックアウト法。TGFBR2やHPRT1欠損細胞を効率的に作製し、固形腫瘍免疫療法への応用を探索します。

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原稿を編集で彼の親切な助けのブライアン ・ トゥッリウス ・を認めます。

健康なドナー バフィー コート素材としてから中央オハイオ州地域米国赤十字社が得られました。この研究は、制度検討委員会の全国小児病院によって免除の研究に決定されました。
1. ヒト NK 細胞精製と拡大
<ol><li>バフィー コート12から PBMCs を分離します。<ol>
<li>レイヤー Ficoll Paque の 15 mL のバフィー コート サンプルの 35 mL。</li>
		<li>ブレーキなし 20 分間 400 × g で遠心し、インターフェイスから、PBMC を収集します。</li>
		<li>PBS の少なくとも等しいボリュームを追加することによって回復した PBMCs を 3 回洗浄、400 × g で 5 分間遠心分離し、PBC を吸引洗浄します。NK 細胞は RosettesSep13でこの段階で分離することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>照射 10 x 106 mbIL21-表現で刺激することによって NK 細胞を展開し 0、7、および 14 日フィーダー細胞。メディアを置き換えて 10% を含む新鮮な RPMI 1 %fbs グルタミン、1% ペニシリン ストレプトマイシンおよび全体のメディア ボリューム一日おきの IL-2 の 100 IU/mL。</li>
</ol>2. gRNA 設計と選択
<ol><li>対象に、オンライン ツール、例えばNCBI、アンサンブルを使用して特定のゲノム遺伝子座を選択します。 例を示します。 説明/コントロール: 成長因子 β 受容体 2 (TGFBRR2) の変換外部ドメイン レコードを表示: PF08917 InterPro を表示: IPR015013 位置: 49 157 aa 目標とされたシーケンス: エクソン TGFBR2 遺伝子 (ENSG00000163513) の 4</li>
	<li>設計、gRNAs を http://crispr.mit.edu、'Benchling' など CRISPR デザイン web ツールを使用します。<ol>
<li>手順 2.1で選ばれた DNA シーケンスに入力します。ターゲット ゲノムとして人間 (hg 19) を選択します。CRISPR ガイド (PAM 並びに続いて 20 ヌクレオチド: NGG) 以前に入力シーケンスからスキャンされます。また、選択したゲノム全体オフのターゲット候補を示します。</li>
		<li>彼らのターゲットに、ターゲットをオフ率に基づいて、最高のスコアを持つ最高の 3 gRNAs を選択します。たとえば、表 1は、対象とするエクソン 4 遺伝子 TGFBR2 の CRISPR デザイン web ツールによって提案された設計 CRISPR Rna を示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>合成シーケンス固有の crRNAs として CRISPR Rna を注文します。</li>
	<li>保存、注文、crRNA と部分的な相同性を介して対話する RNA (tracrRNA) を transactivating します。</li>
</ol>3. デザイン削除プライマーのスクリーニング
<ol><li>T7E1 突然変異の試金のための gRNA 胸の谷間サイトにまたがるプライマーを設計します。</li>
	<li>SgRNA ターゲット ・ サイトでの小さな挿入・削除 (オクターリピート) のように、予測された胸の谷間サイトから使用プライマー、少なくとも 100 bp は、1.5% の agarose のゲルの突然変異試験を次に表示されます。TGFBR2 外部ドメインを増幅するプライマーを表 2に示します。</li>
</ol>4. 人間のプライマリおよび拡張された NK 細胞の情報伝達
注: NK に Cas9/結合要素の伝達は、4 D システムを次のように使用してエレクトロポレーションによって行われます。
<ol><li>
セル準備
	<ol>
<li>
NK 細胞のため、4 日間 100 IU/mL IL-2 の存在下で RPMI 培地で新鮮単離の NK 細胞をインキュベートし、日 5 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。</li>
		<li>
NK 細胞の拡張のため、日 0 1:1 の比率で照射フィーダー細胞と細胞を刺激し、一日 5、6 または 7 でエレクトロポレーションを実行します。以前と伝達の前に日を説明するよう毎日メディアを交換します。</li>
		<li>エレクトロポレーションの日 8 ml エレクトロポレーションと加湿の 37 ° C、5% CO2インキュベーターで事前 incubate フラスコ細胞の IL-2 の 100 IU/mL を含む新鮮な RPMI の T25 フラスコを準備します。 注:解凍されたセルまたは 2ndや 3rdの刺激を受けた細胞は、前述の回復後にいつでも electroporated をすることができます。</li>
		<li>3-4 × 106細胞伝達ミックスの 26 μ L の条件あたりを取る。 注:エレクトロポレーション ソリューションの NK 細胞の非常に高濃度では、伝達率を向上させます。</li>
		<li>3 回通常 RNase 活性を含むすべての FBS を削除する PBS のセルを洗浄します。8 分の 300 x g でそれぞれの時間をそれらを回しなさい。 注:ない Cas9/結合と 1 つのコントロールと 2 つの gRNAs (gRNA1 gRNA2、gRNA1 gRNA3、gRNA2 + gRNA3) の組み合わせ Ca/結合が 1 つの gRNA (gRNA1、gRNA2、gRNA3) として 7 エレクトロポレーション条件を検討してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CrRNA:tracerRNA を形成する複雑な/
	<ol>
<li>1 x 200 μ M の最終濃度にテ ・ ソリューションでは、crRNAs (gRNA1、gRNA2、および gRNA3)、tracerRNA を再懸濁します。200 μ M tracerRNA表 3に示すように各 200 μ M gRNA のミックス 2.2 μ L。</li>
		<li>95 ° C、5 分でサンプルを加熱、室温 (15-25 ° C) にベンチの上に冷却すること。ストアは、Rna と crRNA を再停止される: tracerRNA/複合体後で使用のための-20 ° C で。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNP 複合体を形成します。 注:時間を節約する形成 RNP の洗濯物の中に複雑なステップ 4.1.5 。
	<ol>
<li>単一 crRNA:tracrRNA 二重反応は、表 4の例で示すように、36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼを薄くしなさい。</li>
		<li>CrRNA:tracrRNA デュプレックスの組み合わせの伝達の希釈 36 μ m Cas9 エンドヌクレアーゼの例で示すように、テーブル 5 。
</li>
		<li>ピペット チップ、30 以上を旋回しながらゆっくりと crRNA:tracrRNA 二重に Cas9 エンドヌクレアーゼを追加 1 分に s。</li>
		<li>15 〜 20 分のための部屋の温度で混合物を孵化させなさい。インキュベーション後の混合物を使用する準備ができていない場合、は、使用するまで氷の混合物を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
エレクトロポレーション
	<ol>
<li>エレクトロポレーション ソリューション P3 に全体の補足を追加し、部屋の温度でそれを維持します。</li>
		<li>P3 主な 4 D エレクトロポレーション ソリューションの 20 μ l ( 4.1.5 のステップからの 3-4 × 106細胞) 細胞ペレットを再懸濁します。ピペッティングしながら気泡を避けるため。 注: セル P3 ソリューションで長い間放置してはなりません。</li>
		<li>すぐに細胞懸濁液に RNP 複合 (ステップ 4.3) の 5 μ L を追加します。</li>
		<li>Cas9/結合/セルに 100 μ M Cas9 エレクトロポレーション エンハンサーの 1 μ L ミックスを追加します。</li>
		<li>エレクトロポレーション短冊 20 μ Cas9/結合/セル ミックスを転送します。</li>
		<li>サンプルがストリップの底をカバーすることを確認するストリップを軽くたたきます。</li>
		<li>4 D エレクトロポレーション システムを起動し、 EN 138プログラムを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ポスト伝達
<ol><li>細胞のストリップで 3 分間休憩をしましょう。</li>
	<li>キュヴェットへ事前釣合い文化メディア 80 μ L を追加し、そっとフラスコにサンプルを転送します。</li>
	<li>導入後、48 時間は、スクリーニング遺伝子の削除の 5 × 105細胞からゲノム DNA を抽出します。</li>
	<li>ステップ 3.2 Taq DNA ポリメラーゼのキットで設計したプライマーを使用して興味の遺伝子を増幅します。</li>
	<li>PCR 増幅 heteroduplexes T7EI の消化を形成し、37 ° C で T7EI 酵素で 30-60 分間インキュベート製品 注:アッセイは、スクリーニングとは、高速、簡単なを提供します T7EI は、測量アッセイを用いたに比べて電気泳動結果をクリーンアップします。ただし、このメソッドの削除と挿入を検出できません < Cas9 結合実験14(NHEJ) の活動に参加する非相同末端によって生成された 2 拠点。</li>
	<li>1.5% の消化の DNA を実行 30-45 分、110 V で agarose のゲル 15 分ごとを視覚化するゲル。</li>
	<li>MbIL21 発現と細胞の残りの部分を刺激する 1:1 の比率でフィーダー細胞。</li>
	<li>刺激後 5 日間は、qPCR を使用して遺伝子発現レベルの RNA を抽出します。</li>
	<li>以前に報告された12としてカルセイン アッセイを実施します。簡単に言えば、カルセイン AM (例では、3 μ g/mL/1,000,000 DAOY 細胞を用いて) を用いた標的細胞をロードします。NK 細胞の細胞毒性の試金に備える IL2 で一晩休んで (100 IU/mL) プラスまたはマイナス 10 ng/mL 水溶性 TGFβ。NK 細胞は、一晩で休んでいた同じサイトカイン カルセインの試金を実施します。</li>
</ol>

<ol><li>Guven, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+primary+human+natural+killer+cells+by+retroviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.</a> Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).</li>
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<li>Chmielecki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+a+Large+Set+of+Diverse+Pediatric+Cancers+Identifies+Known+and+Novel+Mutations+across+Tumor+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra.</a> Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).</li>
<li>Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+immunotherapy+for+pediatric+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.</a> Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).</li>
</ol>

DAL は、提供しています/宅配治療や黒曜石治療、Intellia 治療薬、メルク研究所 Miltenyi バイオテックのコンサルタントを務めてし、資本/リーダーシップは、CytoSen 治療。

4,9NK 細胞の DNA 依存した変更にチャレンジしております。我々 は、したがって、直接総合的前もって形成されたリボ核タンパク質 (結合) 複合体と Cas9 タンパク質精製タンパク質としてに導入プライマリおよび拡張された NK 細胞8。このメソッドを使用すると、キャップを排除するために実行できましたが、尾行と他の転写と翻訳プロセス開始 RNA ポリメラーゼ II は、DNA 依存性伝達方法に関連付けられている NK 細胞のアポトーシスを引き起こす可能性があります。
さらに、報告されたメソッドはここで Cas9/結合、アクティブなエレクトロポレーションの直後、すぐに、ターゲット上の増加、現在のプロトコルにオフターゲット効果を減少して品質が低下として使用浄化された Cas9 タンパク質複合体5,6<s...

がん免疫療法は、近年進められています。遺伝子組み換えキメラ抗原受容体 (車) T 細胞は、癌免疫療法に正常に展開設計の免疫細胞の優れた例です。これらの細胞は最近に対する治療薬として FDA によって承認された CD19 + B 細胞悪性腫瘍、しかし、成功のいくつかの対象抗原を軸受の病気に限られているところし、免疫の脱出によって故障しやすいがこのような限られた抗原のレパートリーを対象とします。さらに、車の T 細胞は移植片対宿主病同種 T 細胞によって引き起こされるの危険のため自己の T 細胞の使用に注目されています。対照的に、NK 細胞は、抗原非依存性に腫瘍ターゲットを殺すことやがん免疫療法6,7,8,9の良い候補になる GvHD が発生しません。
CRISPR/Cas9 技術は、エンジニア リングの免疫細胞で最近使用されていますが、遺伝子組み換えプラスミドを持つ NK 細胞をリプログラミング常に挑戦されています。これは実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスと遺伝子組み換え NK 細胞4の限定生産を引き起こすレンチ ウイルス、レトロ ウイルスの伝達など DNA 依存的遺伝子配信の難しさによるずっと,9。
多くの自然免疫系細胞、病原体関連分子パターンの受容体の高レベルを表現レチノイン酸誘導性遺伝子私(リグ-私)、外来 DNA の高められた認識を有効にします。遺伝子組み換え10の DNA ベースのメソッドを使用する場合、これらの経路の抑制が NK 細胞の情報伝達効率を有効に。
プライマリと拡張のヒト NK 細胞 Cas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を利用の編集無料の DNA ゲノムを使用する方法をご紹介します。Cas9/結合組換え Cas9 蛋白質複合体 crRNA と tracerRNA から成る合成の単一ガイド RNA との複合体の 3 つのコンポーネントで構成されます。これらの Cas9/結合機能性錯体としての配信のための外国の DNA 依存性アプローチと比較して高効率なゲノムのターゲットを切断が可能です。また、Cas9/結合セルからの迅速なクリアランスは、アポトーシスの誘導などのターゲットをオフの効果を減らす可能性があります。したがって、彼らは、ノックアウト、またはノックを相同組換え6、7の DNA と組み合わせた場合を生成する使用できます。Cas9/結合のエレクトロポレーションを示した NK 細胞で遺伝子組み換えの前の制約を克服する簡単で比較的効率的な方法です。
TGFβ は、主要な免疫サイトカイン、活性化、NK 細胞の機能を阻害します。TGFβ 経路をターゲットで免疫細胞の機能を高めることができると言われています。我々 は TGFβ11.にバインドする TGBR2 外部ドメインをエンコーディング地域を対象と代表の結果は、この遺伝子の発現レベルが大幅に低下を示し、さらに変更された NK 細胞なる TGFβ に耐性を示します。さらに、変更されたセルに保持の生存率、増殖能拡張ポスト エレクトロポレーション照射フィーダー細胞.を使用することは、したがって、次のメソッドがいずれかの NK 細胞を遺伝子操作する有望なアプローチさらに臨床や研究の目的。

<table><tbody><tr><td>ロゼットSep&trade;ヒトNK細胞濃縮カクテルSTEMCELL</td><td>テクノロジー</td><td>ズ15065</td><td>ロゼットSep&trade;Human NK Cell Enrichment Cocktailは、ネガティブセレクションにより全血からNK細胞を分離するように設計されています。</td></tr><tr><td>フィコル・パケ&reg;プラス</td><td>GEヘルスケア - ライフサイエンス</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg;CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1072532</td> 独自の<td>化学修飾を含むTracrRNAは、ヌクレアーゼ耐性を増加させます。crRNAにハイブリダイズしてCas9酵素</td></tr><tr><td>Alt-R&regを活性化します。CRISPR-Cas9 crRNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Alt-R&regとして合成的に生産されました。CRISPR-Cas9 crRNA、intrest Alt-R&regの遺伝子を標的とする設計済みgRNAの配列に基づく</td></tr><tr><td>。ゲノム編集検出キット</td><td>統合DNA技術</td><td>1075931</td><td>各キットには、T7EIエンドヌクレアーゼ、T7EI反応バッファー、T7EIアッセイコントロールが含まれています。</td></tr><tr><td>プラチナ&reg;Taq DNAポリメラーゼハイフィデリティ</td><td>Invitrogen</td><td>11304-011</td><td></td></tr><tr><td>4D-ヌクレオフェクター&trade;システム</td><td>ロンザ</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>人間の組換えIL-2タンパク質</td><td>ノバルティス</td><td>65483-0116-07</td><td></td></tr><tr><td>P3初代細胞4D-Nucleofector&trade;Xキット</td><td>ロンザ</td><td>V4XP-3032</td><td>はpmaxGFP&tradeが含まれています。ベクター、ヌクレオフェクター&貿易;溶液、サプリメント、16ウェルNucleocuvette&trade;ストリップ</td></tr><tr><td>非ターゲティング:カスタムsiRNA、標準0.05 2mol ON-TARGETplus</td><td>Dharmacon</td><td>CTM-360019</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg; S.p. Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1074181</td><td>Cas9 Nuclease</td></tr><tr><td>DNeasy&reg;ブラッド&ティッシュハンドブック</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>ThermoFisher</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td>バイオレジェンド</td><td>580706</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg;CRISPR-Cas9コントロールキット、ヒト</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>1072554</td><td>tracrRNA、HPRTポジティブコントロールcrRNA、ネガティブコントロールcrRNA#1、HPRTプライマーミックス、ヌクレアーゼフリーデュプレックスバッファーが含まれています。</td></tr><tr><td>IDTE pH 7.5 (1X TE Solution)</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>11-01-02-02</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R&reg;Cas9エレクトロポレーションエンハンサー</td><td>統合DNA技術</td><td>1075915</td><td>Cas9エレクトロポレーションエンハンサー</td></tr></tbody></table>

cas9 ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の nk 細胞の生成

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 技術が多くの細胞の種類が今のところ、遺伝子デリバリーのゲノム工学を加速し、安定した遺伝子の改変は、NK 細胞の挑戦されています。たとえば、レンチ ウイルスやレトロ ウイルスの伝達の使用 transgene 配信実質的な手順による NK 細胞のアポトーシスにより NK 細胞を遺伝子組み換えの限られた収量結果になったCas9 リボ核蛋白質複合体 (Cas9/結合) を使用してプライマリおよび拡張の NK 細胞を人間のゲノムの編集を DNA 法をご紹介します。このメソッドは、NK 細胞における HPRT1 遺伝子 TGFBR2と効率的なノックアウトをできました。RT-PCR のデータを示した遺伝子発現レベルが大幅に低下、代表的な細胞製品の細胞毒性の試金は RNP 変更 NK 細胞 TGFβ により少なく敏感になったことを提案しました。遺伝子組み換え細胞ことができる照射 mbIL21 発現刺激による拡張されたポスト エレクトロポレーション フィーダー細胞。

エレクトロポレーション効率
Cas9/結合へのエレクトロポレーションを最適化するため、我々 は NK 細胞に GFP を対象とした siRNA とプラスミドの伝達で 16 の異なるプログラムをテストしました。流れの cytometry の試金を認めたEN 138細胞生存率および伝達効率 (35% ライブ GFP 陽性細胞) (図 1 ・図 2) 両方の粒子の割合が最も高い。興味深いことに、Cas9/結合エレクトロポレーションのこのプログラムを使用して効率は高い TGFBR2 mRNA 発現レベル (図 5) で 60% 削減しました。さらに、遺伝子組み換えの NK 細胞が成長して 30 日間、凍結保存 (データは示されていない) に展開します。</...

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) の欠乏を生成されます。

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

この方法は、エフェクター細胞の機能を調節する特定の遺伝子と経路の役割と機能に関するNK細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、DNA依存型アプローチと比較して成功率が高いことであり、NK細胞治療において最も臨床的に重要な遺伝子の1つを非常に効率的にノックアウトすることができます。この技術の意味するところは、免疫逃避の手段としてTGF-βを発現する固形腫瘍および脳腫瘍の免疫療法にまで及びます。初代NK細胞形質導入のために、T75フラスコあたりIL2のIL21ミリリットルあたり100IUを補充したRPMI培地1ミリリットルあたり5つの新たに単離されたNK細胞に3回10回インキュベートし、1日おきおよび形質導入の前日に培地を交換します。NK細胞の形質導入を拡大するには、1日おきおよび形質導入の前日に、1対1の比率で、放射膜結合IL21発現K562フィーダー細胞を用いて初代NK細胞を刺激します。エレクトロポレーションの日に、実験細胞条件ごとにIL21ミリリットルあたり100IUを補充した8ミリリットルの新鮮な培養培地で1つのT2フラスコを満たし、フラスコを加湿摂氏37度および5%CO2インキュベーターに入れます。培地が平衡化している間に、形質導入混合物26マイクロリットルあたり条件ごとに6番目の細胞に10の3〜4倍を加え、円錐形のチューブに混合し、遠心分離により細胞をペレット化します。次に、1回の洗浄で12ミリリットルの滅菌PBSで細胞を3回洗浄し、細胞懸濁液からすべてのFBSを取り除きます。細胞を洗浄している間に、各CRISPR RNAおよびtracrRNAを最終濃度200マイクロモルに再懸濁します。各CRISPR RNAの2.2マイクロリットルを、サンプルあたり200マイクロモルのtracrRNA1個と混合し、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、サンプルを室温まで冷却し、CRISPR RNA/tracrRNA複合体をマイナス20°Cで保存します。リボ核タンパク質複合体を形成するには、Cas9エンドヌクレアーゼを適切な対応するCRISPR RNA/tracrRNA複合体に30〜60秒かけて渦巻きながら添加し、得られたCas9リボ核タンパク質複合体を室温で15〜20分間インキュベートします。最後の洗浄後、Nucleofector solution P3 キットからエレクトロポレーションサプリメントの全量を追加し、気泡を避けながら各細胞ペレットを 20 マイクロリットルの P3 一次 4D-Nucleofector 溶液に再懸濁します。直ちに、各リボ核タンパク質複合体の5マイクロリットルを適切な細胞懸濁液に加え、100マイクロモルのCas9エレクトロポレーションエンハンサーをCas9リボ核タンパク質複合体細胞ミックスに1マイクロリットル加えます。Cas9リボ核タンパク質細胞溶液26マイクロリットルをNucleocuvetteストリップの個々のウェルに移し、ストリップを軽くたたいて、サンプルが各ウェルの底を覆っていることを確認します。次に、4D-Nucleofector system EN138プログラムを起動します。形質導入の最後に、細胞を3分間休ませます。次に、80マイクロリットルの予め平衡化した培地を各キュベットに加え、37°Cのインキュベーションで1つの条件につきサンプルを1つのフラスコに静かに移します。培養の48時間後、標準的なプロトコルに従って遺伝子欠失スクリーニングのために、5×10から5つの形質導入細胞にゲノムDNAを抽出します。次に、形質導入した残りの細胞を新鮮な膜結合IL21発現フィーダー細胞で1対1の比率で刺激し、定量的PCRによる遺伝子発現解析の標準プロトコルに従って5日間の共培養後にRNAを抽出します。フローサイトメトリー解析により、EN138プログラムは、利用可能なNucleofectorシステムプログラムの中で最も高い割合の細胞生存率と形質導入効率をもたらすことが明らかになりました。例えば、市販のガイドRNAを用いて、ヒトHPRT1は拡大したヒトNK細胞でノックアウトに成功します。さらに、ガイドRNA2、ガイドRNA1プラスガイドRNA2およびガイドRNA3を含有するCas9リボ核タンパク質は、成功したTGF−β受容体2つのエクトドメイン遺伝子ノックアウトを示すが、ガイドRNA1単独では、T7E1検出可能な挿入欠失を誘導しない。実際、Cas9リボ核タンパク質エレクトロポレーションにEN138プログラムを使用すると、このプログラムを介して形質導入された細胞におけるTGF-β受容体2mRNA発現が60%減少します。さらに、形質導入細胞をTGF-β細胞株およびヒト初代髄芽腫細胞株と共培養することは、対照の非TGF-β処理形質導入細胞と比較してNK細胞の細胞毒性に有意に影響を及ぼさず、タンパク質レベルでCas9リボ核タンパク質改変細胞におけるTGF-β受容体2つの機能の対応する欠如に直面している。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了することができます。この手順を試みる際には、最適な遺伝子編集結果を見つけるために、いくつかの異なるガイドRNAを設計することを忘れないでください。この手順に続いて、DNAシーケンシングやT7E1変異アッセイなどの他の方法を実行して、遺伝子編集の効率や潜在的なオフターゲット遺伝子変異の決定方法に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、がん免疫療法の分野の研究者が遺伝子編集されたNK細胞をがん治療に使用する可能性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ヒトNK初代細胞の遺伝子編集の方法について十分に理解できるはずです。このプロセス後のNK細胞の増殖の詳細については、以前のJoveの記事をご覧ください。人間の血液を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に普遍的な健康と安全の予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

generation-knock-out-primary-expanded-human-nk-cells-using-cas9

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

学ぶCas9リボヌクレオタンパク質を用いたヒトNK細胞の遺伝子ノックアウト法。TGFBR2やHPRT1欠損細胞を効率的に作製し、固形腫瘍免疫療法への応用を探索します。

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