Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

この方法は、エフェクター細胞の機能を調節する特定の遺伝子と経路の役割と機能に関するNK細胞生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、DNA依存型アプローチと比較して成功率が高いことであり、NK細胞治療において最も臨床的に重要な遺伝子の1つを非常に効率的にノックアウトすることができます。この技術の意味するところは、免疫逃避の手段としてTGF-βを発現する固形腫瘍および脳腫瘍の免疫療法にまで及びます。

初代NK細胞形質導入のために、T75フラスコあたりIL2のIL21ミリリットルあたり100IUを補充したRPMI培地1ミリリットルあたり5つの新たに単離されたNK細胞に3回10回インキュベートし、1日おきおよび形質導入の前日に培地を交換します。NK細胞の形質導入を拡大するには、1日おきおよび形質導入の前日に、1対1の比率で、放射膜結合IL21発現K562フィーダー細胞を用いて初代NK細胞を刺激します。エレクトロポレーションの日に、実験細胞条件ごとにIL21ミリリットルあたり100IUを補充した8ミリリットルの新鮮な培養培地で1つのT2フラスコを満たし、フラスコを加湿摂氏37度および5%CO2インキュベーターに入れます。

培地が平衡化している間に、形質導入混合物26マイクロリットルあたり条件ごとに6番目の細胞に10の3〜4倍を加え、円錐形のチューブに混合し、遠心分離により細胞をペレット化します。次に、1回の洗浄で12ミリリットルの滅菌PBSで細胞を3回洗浄し、細胞懸濁液からすべてのFBSを取り除きます。細胞を洗浄している間に、各CRISPR RNAおよびtracrRNAを最終濃度200マイクロモルに再懸濁します。

各CRISPR RNAの2.2マイクロリットルを、サンプルあたり200マイクロモルのtracrRNA1個と混合し、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。次に、サンプルを室温まで冷却し、CRISPR RNA/tracrRNA複合体をマイナス20°Cで保存します。リボ核タンパク質複合体を形成するには、Cas9エンドヌクレアーゼを適切な対応するCRISPR RNA/tracrRNA複合体に30〜60秒かけて渦巻きながら添加し、得られたCas9リボ核タンパク質複合体を室温で15〜20分間インキュベートします。

最後の洗浄後、Nucleofector solution P3 キットからエレクトロポレーションサプリメントの全量を追加し、気泡を避けながら各細胞ペレットを 20 マイクロリットルの P3 一次 4D-Nucleofector 溶液に再懸濁します。直ちに、各リボ核タンパク質複合体の5マイクロリットルを適切な細胞懸濁液に加え、100マイクロモルのCas9エレクトロポレーションエンハンサーをCas9リボ核タンパク質複合体細胞ミックスに1マイクロリットル加えます。Cas9リボ核タンパク質細胞溶液26マイクロリットルをNucleocuvetteストリップの個々のウェルに移し、ストリップを軽くたたいて、サンプルが各ウェルの底を覆っていることを確認します。

次に、4D-Nucleofector system EN138プログラムを起動します。形質導入の最後に、細胞を3分間休ませます。次に、80マイクロリットルの予め平衡化した培地を各キュベットに加え、37°Cのインキュベーションで1つの条件につきサンプルを1つのフラスコに静かに移します。

培養の48時間後、標準的なプロトコルに従って遺伝子欠失スクリーニングのために、5×10から5つの形質導入細胞にゲノムDNAを抽出します。次に、形質導入した残りの細胞を新鮮な膜結合IL21発現フィーダー細胞で1対1の比率で刺激し、定量的PCRによる遺伝子発現解析の標準プロトコルに従って5日間の共培養後にRNAを抽出します。フローサイトメトリー解析により、EN138プログラムは、利用可能なNucleofectorシステムプログラムの中で最も高い割合の細胞生存率と形質導入効率をもたらすことが明らかになりました。

例えば、市販のガイドRNAを用いて、ヒトHPRT1は拡大したヒトNK細胞でノックアウトに成功します。さらに、ガイドRNA2、ガイドRNA1プラスガイドRNA2およびガイドRNA3を含有するCas9リボ核タンパク質は、成功したTGF−β受容体2つのエクトドメイン遺伝子ノックアウトを示すが、ガイドRNA1単独では、T7E1検出可能な挿入欠失を誘導しない。実際、Cas9リボ核タンパク質エレクトロポレーションにEN138プログラムを使用すると、このプログラムを介して形質導入された細胞におけるTGF-β受容体2mRNA発現が60%減少します。

さらに、形質導入細胞をTGF-β細胞株およびヒト初代髄芽腫細胞株と共培養することは、対照の非TGF-β処理形質導入細胞と比較してNK細胞の細胞毒性に有意に影響を及ぼさず、タンパク質レベルでCas9リボ核タンパク質改変細胞におけるTGF-β受容体2つの機能の対応する欠如に直面している。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば5時間で完了することができます。この手順を試みる際には、最適な遺伝子編集結果を見つけるために、いくつかの異なるガイドRNAを設計することを忘れないでください。

この手順に続いて、DNAシーケンシングやT7E1変異アッセイなどの他の方法を実行して、遺伝子編集の効率や潜在的なオフターゲット遺伝子変異の決定方法に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、がん免疫療法の分野の研究者が遺伝子編集されたNK細胞をがん治療に使用する可能性を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ヒトNK初代細胞の遺伝子編集の方法について十分に理解できるはずです。

このプロセス後のNK細胞の増殖の詳細については、以前のJoveの記事をご覧ください。人間の血液を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には常に普遍的な健康と安全の予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。