Name: ホモとスイカとひょうたんの同種および異種接ぎ木を生成する応答性マイクロ Rna の研究のため (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶスイカとひょうたんの同種・異種接ぎ木法。低温応答性マイクロRNAの研究に応用でき、植物のストレス応答メカニズムを解明する効率的で再現性の高い手法です。

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この仕事はの国民プログラム、キー科学プロジェクトの育種 (2016 C 02051)、浙江省、浙江省 (2017 C 32027) の公益研究プロジェクト中国の国家自然科学基金 (31772191) によって支えられました。(P.X.) に一流の若い専門家のサポート。

1. 種子滅菌・発芽
<ol><li>表面の殺菌のための水の温度は 40 ° C に落ちるまで、時折かくはん 58 ° C で水で満たされた 500 mL ビーカーにひょうたん種子を浸す</li>
	<li>一方、ナイロン バッグと、それを殺菌する泥炭土壌の 3 kg を入れてオートクレーブで 120 ° 20 分 C/0.5 MPa。</li>
	<li>4-5 h ない攪拌しながらより多くのひょうたん種子を浸漬してください。<ol>
<li>水では、部屋の温度に達すると、種子 2 x の - 蒸留水で 3 x をすすいでください。</li>
		<li>余分な水気を切ってガーゼ袋で暗闇の中で成長室 28 ° C で発芽する種子を許可します。</li>
		<li>発芽後滅菌泥炭土を詰めたプラスチック鉢 (直径 6 cm) に種をまきます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ひょうたんの苗は、2 つの平面的な子葉を開発している、手順 1.1-1.3 スイカ種子を繰り返します。 メモ: この時間管理は、成功術、穂木及び台木のサイズを一致を確認します。</li>
</ol>2. 実生と接木
<ol><li>日 (ライト) の間に 28 ° C で、夜の間に 22 の ° C の (暗い) 温度に維持 16 h 光/8-h 暗いサイクル、成長室で苗を生産します。午後遅くに水 1 日 x を追加することによって、苗に水を引きます。</li>
	<li>ひょうたん (台木) の苗は、1 つの真葉期とスイカ (サイオン) の子葉が浮上している (まだ平坦化) するとき、同種および異種接ぎ木をするカット移植法22を使用します。<ol>
<li>スイカ苗の胚軸、子葉の下の 2-3 cm カットし、真のすぐ上のサイトでひょうたんの苗の上部の葉します。</li>
		<li>つまようじを使用して、トリミングされたひょうたんの苗の上部に穴をあけます。トリミングされたスイカ苗を同種および異種接ぎ木をするひょうたんの苗の穴に挿入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 2.2 に示されるように移植するのに同様の方法を使用します。 注: ヒトと heterografting の組み合わせは作られて同時に常に (図 1) が、この場合、結果は、次の: スイカ/ひょうたん (WB, 共台)、スイカ ・ スイカ (WW、同種)、ひょうたん/bottleひょうたん (BB、同種)。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig1.jpg"> 図 1: 移植の組み合わせと接木の植物構造の図。WB = スイカ/ボトルひょうたん heterografting;WW = スイカ/スイカ homografting;BB = ひょうたん/ボトルひょうたんホモ接木;WB S = サイオン葉、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた;WB-R、スイカ/ボトルひょうたん同種および異種接ぎ木サンプリングされた台木葉を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
3. postgrafting、風邪の治療管理、サンプリング
<ol><li>比較的高い湿度を維持し、7 d 16 h 光/8-h 明暗周期、日 (ライト) の間に 28 ° C、22 ° C の間に温度を維持する環境条件下でのそれらを維持する透明ポリエチレン袋で接ぎ木苗を enwrap、夜 (暗い)。</li>
	<li>7 日目に透明なポリエチレンの袋を発見します。植物は同じの下で 7-10 日の追加条件を成長させ。</li>
	<li>健康的な均一な苗を低温処理 (強調) 用と制御 (非強調) の 2 つのグループに分割します。管理グループのため寒さを強調したグループの間、さらに 48 時間同じ成長室 (28 ° C) に苗を残して、手順の説明に従って、明/暗条件での 6 ° c の一定温度で成長室に苗を転送2.1。</li>
	<li>移植 (図 1) から、穂木と台木の葉をサンプルします。すぐに液体窒素でサンプルを凍結し、使用するまで-70 ° C で保存します。</li>
</ol>4. ライブラリの作製と高スループット シーケンス
<ol><li>凍結試料を液体窒素で 2 mL の微量遠心チューブに転送します。</li>
	<li>組織を含む各管にステンレス製ビーズ (直径 5 mm) を追加します。</li>
	<li>30 のビーズ工場ホモジナイザーを用いた微粉末に組織をホモジナイズしてください s。</li>
	<li>移植の組み合わせごとに 10 苗から粉砕の等しい量 (0.1 g) を取るし、10 mL の遠心管にそれらをミックスします。Guanidium 塩酸塩試薬 (資材表) を組織重量に対応するメーカーの提案に基づいての適切な量を追加します。<ol>
<li>ゲノム DNA 汚染削除 RNA 無料 DNase I 37 ° C 1 時間で 150 U/mL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>合計を決定する RNA の整合性を確保するマイクロキャピ ラリー電気泳動システムの RNA 量数 &gt; 7.0。 注: 凛 &gt; 7.0 は、RNA サンプルの高い整合性します。</li>
	<li>製造元の指示に従って商業キット (資材表) を使用して小さな RNA ライブラリを準備します。サンプルあたりの総 RNA の 1 μ g を使用開始します。<ol>
<li>ライブラリ正規化試薬、製造元のガイドラインに従ってアダプターを解凍します。5 'と 3' のアダプター分子 Rna を縛ると溶出し、それらを浄化します。その後、逆転写、5 ' 3' 製造元のガイドラインに従う低分子 Rna の結紮と。</li>
		<li>製造元のプロトコルに従って PCR 増幅を実行します。マイクロキャピ ラリー電気泳動を用いた cDNA ライブラリの量と質を評価します。</li>
		<li>RIN ようにマイクロキャピ ラリー電気泳動システムの RNA ライブラリの 1 μ L を読み込む &gt; 7.0。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高スループット シーケンス楽器23を他の場所で説明されているように小さな RNA ライブラリをシーケンスします。</li>
</ol>5. miRNA とターゲット遺伝子予測
<ol><li>移植の組み合わせごとに質の悪いシーケンスを削除し、生の読み取りからアダプター シーケンスをトリミング オープン ソース UEA スルナ ワークベンチ 2.4 植物版24を使用します。18 より小さいシーケンスを破棄 nt または 32 を超える nt。</li>
	<li>認識し、rRNA、tRNA、snoRNA、および他の目的の読み取りを削除するオープン ソース Rfam 11.0 データベースへ高品質の「クリーン」シーケンスを比較します。</li>
	<li>短鎖リード シーケンス配置ツール25を使用して参照ゲノムに残りの読み取りを合わせます。この手順では、不一致は許可されません。 注: スイカ「97103」ゲノム アセンブリ26は、サイオンから読み取りを配置に使用された V1 とひょうたん"HZ"ゲノム アセンブリ V127台木からの読み取りに使用されました。</li>
	<li>オープン ソースの miRBase 22.028で知られている成熟 Mirna に対して残りの読み取りを比較します。相同性の高い既知の miRNAs の読み取りは、保存されている miRNAs に分類されます。</li>
	<li>ゲノム シーケンスと知られている miRNA 前駆体を一致するように失敗するシーケンスを比較します。MIREAP29アルゴリズムを使用すると、既定の設定の下で潜在的な新規 Mirna を検出します。</li>
</ol>6. 発現と遺伝子の Ontology 解析
<ol><li>自分の読み取りの数に基づいて Mirna の発現レベルを比較します。Mirna のP-値 (フィッシャーの正確なテスト) &lt; 0.05 と絶対ログ2値 &gt; 2 が発現すると考えられています。</li>
	<li>アンチセンス オリゴヌクレオチド ターゲット サイトの選択ツール (TargetFinder)30を使用すると、既定のパラメーターの下で発現の miRNAs に潜在的な相補的な Mrna (miRNA ターゲット遺伝子) を予測します。</li>
	<li>遺伝子の ontology を使用 (行く) P下パターンを濃縮分析ツール31 miRNA ターゲット遺伝子オントロジー (GO) を明らかにするための統計的な有意性 0.05 の値のしきい値。</li>
</ol>

<ol><li>Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304423810004243">Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants.</a> Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。小さな RNA シーケンス データは GenBank 加入番号 SRP136842 の下に堆積されています。

このプロトコルでヒトや同種および異種接ぎ木スイカとひょうたんを作る高効率で再現性のある方法で詳しく述べる。特定の機器を必要としない、このメソッドは、操作が非常に簡単で、通常移植の非常に高い生存率を持っています。メソッドは、スイカ、キュウリ、カボチャのように他のウリの移植にも使用できます。
台木と穂木の相対的なサイズ (歳)、成功したグラフト (プロトコルの手順 2.2) をさせることが重要であることに注意する価値があります。我々 は、サイオンと比較して、使用台木が大きすぎて場合接木連合よりフォームにので難しかった御曹司の幹はややくり観察。私たちの以前のプロテオーム データの31に基づき、自己接ぎ木穂木及び台木の接ぎ木自己コントロールとして含めることが強く推奨される (プロトコルの手順 2.3) ために接続し、傷害を移植の衝撃を大きく除去ことができます。
このプロトコルでは、heterografting システムの...

移植くらい採用されている農業技術として作物生産と生物的・非生物的ストレス1,2,3への耐性を向上させる。ことができますエリート台木 heterografting システムで植物の水および栄養素の吸収を高めるため、土壌病原体への抵抗を強化し、金属毒性4、5、強化されたグラフトを与える可能性がありますの負の影響を制限成長活力と環境ストレス耐性が向上します。多くの場合、heterografting はまた改良されたフルーツの味と健康関連化合物6、7の増加のコンテンツにつながる、園芸植物の果実品質を影響します。台木と穂木の植物ホルモン、Rna、ペプチド、タンパク質の長距離転送が機構は、成長と開発のサイオン植物8,9 のリプログラミングを調節することであることがわかった ,10。移植は、長距離シグナル伝達と環境適応11に関連して交通機関の研究で広く使用されています。移植実験は、明確な組織や血管の sap と活性化または信号伝送12のための分子ターゲットの抑制を受信送信される分子検出のため特に強力です。
非コード Rna、RNA が細胞で重要な調節機能を発揮の大きなクラスは、非生物的ストレス13に植物への適応を促進する役割を果たすと報告されています。Mirna が小さい非コード Rna 約 20-24 内因性 nt 研究は植物の活動のさまざまな側面の miRNAs の規制の役割を明らかにした、生長、横ルート形成14,,1516養分吸収、硫酸代謝、恒常性17、およびレスポンスを生物的・非生物的ストレス18。最近では、Mirna とそのターゲット遺伝子発現 heterografted キュウリ苗19ストレス耐塩性に関連していた。ブドウの intervariety の移植、遺伝子依存性20miRNA 式乾燥ストレスに対する応答が見つかりました。
急速な発展と高スループット シーケンス技術のコストの減少は、miRNA の規則農業植物の研究のための絶好の機会を提供しています。スイカ (スイカ地ばい栽培における[について]Mansf.)、世界全域で栽培される重要な cucurbit 作物は低温に敏感であります。ひょうたん (ラゲナリア ヒョウタン[モリーナ] (37) つる割り病.) はより弾力性のある気候 cucurbit スイカを接木する農家で一般的です。現在の研究の主な目的は標準、効率、および同種および異種接ぎ木スイカ (スイカ地ばい栽培における[について] の間を作るための便利な方法を確立するにはMansf。)ひょうたん (ラゲナリア ヒョウタン[モリーナ] (37) つる割り病)。このプロトコルも、詳細な実験手法および分析的手続の次の移植、miRNA の表現の規制を検討 heterografting の利点の基になるメカニズムを明らかにするために便利です。
本研究で使用される植物材料は、スイカの品種とひょうたん在来種もあります。スイカの品種は低温に感受性が高収率で商業品種です。ひょうたん在来種は低温21の優秀な耐性のため、ひょうたん、キュウリ、スイカの接木の人気の台木です。

<table><tbody><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNAフリー DNase I</td><td>タカラ</td><td>D2270A</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Small RNA sample prep Kit</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bionalyser</td><td>Agilent</td><td>5067</td><td></td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>UEA sRNA ワークベンチ 2.4-プラントバージョン&nbsp;(ソフトウェア)</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr> <tr><td>http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ Rfam 11.0データベース&nbsp;(ウェブサイト)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://rfam.janelia.org</td></tr><tr><td>miRBase 22.0&nbsp;(ウェブサイト)</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.mirbase.org/ MIREAP(ソフトウェア)</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr> <tr><td>https://sourceforge.net/projects/mireap/ TargetFinder&nbsp;(ソフトウェア)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://targetfinder.org/</td></tr></tbody></table>

ホモとスイカとひょうたんの同種および異種接ぎ木を生成する応答性マイクロ rna の研究のため

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

マイクロ Rna (Mirna) は内因性小さい非コード Rna 約 20-24 nt、工場開発と適応の重要な役割を果たすことが知られています。移植するときに、特定の Mirna の表現を変更ことを示す蓄積証拠がある一般農家で作物生物的・非生物的ストレス耐性を改善するために使用される農業の練習。ひょうたんは、スイカを含む、後者のための最も広く使用されている台木のいずれかをレンダリングする多く他主要のウリと比較して本質的に気候弾力性のある作物です。高スループット シーケンス技術の最近の進歩は、低温馴化の miRNAs と共台の利点は、彼らの貢献を検討する絶好の機会を提供しています。しかし、適切な実験手順はこの目的のための前提条件です。ここでは、ホモ ・寒さの影響を受けやすいスイカと組織採取、データ生成、およびデータ解析のメソッドに加えて、冷え性のひょうたんの同種および異種接ぎ木を効率的に生成するための詳細なプロトコルを提案する.提示方法、また他の植物移植システム、熱、乾燥、塩分などの種々 の環境ストレス下の miRNA 規制を尋問するに役立ちます。

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58242/58242fig2.jpg"> 図 2: 常温、冷強調条件様々 な移植の表現型。(、) このパネルとして表示されますホモ ・ heterografted 苗室温コントロール。(b) このパネルは、低温処理の 48 時間後ホモ ・ heterografted 苗を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58242/58242fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
組織移植のための 98% の高い成功 (サバイバル) 率を得た記述されているメソッドを使用して。常温、冷...

ホモとスイカと組織採取、データ生成、およびデータ解析の応答性マイクロ Rna の調査のためのメソッドに加えて、ひょうたんの同種および異種接ぎ木を効率的に作るための詳しいプロトコルをご紹介します。

ホモとスイカとひょうたんの同種および異種接ぎ木を生成する応答性マイクロ Rna の研究のため

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...

この方法は、スイカボトルひもグラフトの冷たいストレス下でmiRNAがどのように調節されているかなど、植物移植片のストレス能力に対するmiRNA応答の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点はホモおよびヘテロ移植片を作るために非常に能率的で再生可能な方法である。それは特定の装置を必要としない、それは非常に行い易く、そして典型的には移植の非常に高い生存率をもたらす。この方法により、スイカボトルひんごグラフト系における冷たいストレスに対するmiRNA応答に関する洞察を提供できる。また、ローカルおよび長距離miRNA輸送のメカニズムを明らかにするために、他の現代の生物にも適用することができます。移植ステップは学習が困難であるため、この方法の視覚的実証は重要である。このステップは、高度なスキルを必要とし、移植された植物の生存の鍵です。まず、ボトルのうまくもの種を摂氏58度の500ミリリットルのビーカーに浸します。水温が摂氏40度になるまで、時折種をかき混ぜます。水が冷える間、3キロの泥炭の土壌をナイロンバッグに入れ、オートクレーブします。水が室温に達したら、種子を蒸留水で2〜3回洗い流し、余分な水を排出します。種子が暗い成長室で摂氏28度でガーゼ袋に芽を出すことを許可します。発芽後、種子を殺菌された泥炭土壌で満たされたプラスチックポットにまきます。ボトルヒール苗が2つの平らなコチルドンを開発したら、スイカの種でこのプロセスを繰り返します。成長室でボトルのヒリガメとスイカの苗を成長させます。午後に1日1回苗に水を加えます。次に、スイカの苗の低コチルをコチルレドンの下に2〜3センチメートル切ります。ボトルのヒールヒ足の苗の上を、コチルドンのすぐ上に切ります。その後、爪楊枝を使用して、トリミングされたボトルヒョルヒの苗の上部に穴を開けます。トリミングしたスイカの苗を穴に入れ、ヘテロ移植片を作ります。この後、先に述べた方法を用いて同種移植片を調製する。まず、移植した苗を透明なポリエチレン袋に包み、比較的高い湿度を維持します。その後、7日間の成長室で包まれた苗を維持します。7日目以降、袋を取り出し、7~10日間同じ条件で植物を育てるようにします。苗を2つのグループに分け、1つは冷たい処理用、もう1つはコントロール用です。制御苗を同じ環境条件に戻します。冷たい処理された苗を、対照群と同じ明るい暗い条件で摂氏6度に設定された成長室に入れます。48時間後、サイオンと根株のサンプルを移植片から残します。サンプルを液体窒素で直ちに凍結し、マイナス70度で保管してください。冷凍サンプルを液体窒素中の2ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。各サンプルチューブにステンレスビーズを加え、組織を細かい粉末に均質化します。各接木の組み合わせについて、10個の苗から等量の挽いたサンプルを採取し、10ミリリットルの遠心分離管に混ぜます。適量のグアニジウム塩酸試薬を加える。次に、RNAフリーDNaseを1〜150単位で37°Cで1時間加えます。次に、マイクロキャピラリー電気泳動システム上のRNAの総量を求めます。この後、ライブラリの正規化試薬およびアダプタを解凍します。その後、5つの素数と3つのプライムアダプタで小さなRNaseをリゲートし、それらを溶出して浄化します。メーカーのガイドラインに従って、5つの素数と3つのプライムリゲーテッド小さなRNaseを逆に書き起こします。次に、メーカーのプロトコルに従ってPCR増幅を行います。次に、マイクロカイラリー電気泳動システムを使用して、RNAの完全性の数が7より大きいことを確認します。RNAの完全性の数が7より大きいことを保障するためにマイクロキャピラリー電気泳動システムのRNAライブラリーの1マイクロリットルをロードする。最後に、小さなRNAライブラリをハイスループットシーケンシング装置で配列します。このプロトコルを用いて、移植のための98%の生存率と室温および低温ストレス条件のためのフェノタイプが得られた。24ヌクレオチドのsRNAは、温度処理に関係なく、すべての移植結合のsRNAの最大のクラスを構成した。48時間の冷たい治療の後、30および268マイクロRNAはそれぞれ上下調節された。ヘテロ移植片におけるサイオンの葉では、逆に、根株の葉では、31および12マイクロRNAがそれぞれ上下調節された。スイカとスイカの同種移植片では、64および83マイクロRNAがそれぞれ上下調節されていた。これは、異種移植がマイクロRNA表現の深い再プログラミングを引き起こしたことを示した。この手順を試みる間、娘の茎の相対的な大きさと年齢を覚えておくことが重要であり、サイオンは正常な移植片を作るために重要です。この手順に従って、lncRNAシーケンシングのような他の方法、移植系におけるlncRNAおよびタンパク質およびコード系の調節を調査するためにプロテオームプロファイリングを行うことができる。その開発後、この技術は、Cucurbitaceaeおよびそれ以降の植物移植の利点のメカニズムを探求するために植物の不生物耐性の分野での研究のための道を開いた。グアニジン塩酸塩での作業は非常に危険であり、適切な予防措置は、常にこの手順を実行して取られる必要があることを忘れないでください.

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組換えフォックステールモザイクウイルスおよびサトウキビモザイクウイルス感染性クローンの注射によるトウモロコシ苗木の直接農業接種

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学ぶスイカとひょうたんの同種・異種接ぎ木法。低温応答性マイクロRNAの研究に応用でき、植物のストレス応答メカニズムを解明する効率的で再現性の高い手法です。

ホモとスイカとひょうたんの同種および異種接ぎ木を生成する応答性マイクロ Rna の研究のため

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