Name: 単一金属ナノ粒子の高解像度物理特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 学ぶナノポア検出法によるポリオキソメタレートの単一分子レベルでの物理特性評価。従来法より高速かつ高精度な測定が可能で、DNAシーケンスへの応用も期待される革新的アプローチです。

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欧州分子生物学機構のポスドク・フェローシップ(J.E.)とNIH NHGRI(J.J.K.)からの助成金に対する財政的支援に感謝します。我々は、ヘプタメリックαHLを提供し、ジョセフ・ライナー教授(バージニア・コモンウェルス大学)との刺激的な議論のために、ジンギュエ・ジュ教授とセルゲイ・カラチコフ教授(コロンビア大学)の助けを借りて感謝します。

注:以下のプロトコルは、電子バイオサイエンス(EBS)ナノパッチDCシステムに固有です。しかしながら、平面脂質二重層膜(標準脂質二重層膜室、U管幾何学、引っ張られた微小キャピラーなど)を介して電流を測定するために用いられる他の電気生理学装置に容易に適合させることができる。実験結果を記述するために、商業材料とその供給源の同定が与えられる。この識別は、国立標準技術研究所による勧告を意味するものではなく、また、材料が利用可能な最良であることを意味するものではありません。
1. ソリューションと解数の準備
<ol><li>Type-1浄水システムから18 MΩ-cmの水を使用したすべての電解質溶液を準備して、微量有機種を除去し、イオンチャネル記録の直前に0.22 μmの真空フィルターを通してすべての電解質溶液をろ過します。 注:水質は、膜ナノポア系の安定性と寿命の重要な要因です。</li>
	<li>ワイルドタイプαHL。<ol>
<li>αHL毒素タンパク質を取り扱う場合は、MSDS の注意事項に従ってください。</li>
		<li>凍結乾燥した野生型単体S.アウレウス-ヘモリシン(α HL)粉末を1mg/mLで18 MΩ-cmの水と混合します。サンプルの10~30μLのアリコートを凍結安全な遠心管に分配し、液体窒素中で素早く凍結し、-80°Cに保存します。あるいは、精製前形成ヘプタメリックαHL31を用いる。 </li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhyPC)をn-デカン中0.2mg/mLにポリテトラフルオロエロチレンフロンコーティングキャップで4mLガラスシンチレーションバイアルで溶解する。溶液を4°Cで保存し、最大1ヶ月間繰り返し使用してください。</li>
	<li>ホスホトン酸溶液を調剤する。<ol>
<li>ホスホトン酸粉末を取り扱う場合のMSDSの注意事項に従い、H3 PW12O40の57.6mgを1M NaClおよび10 mM NaH2PO4の10mLに溶解することにより、2mMホスホトン酸ストック溶液を調出す。ストックソリューションを構成するソリューション。</li>
		<li>この溶液の5 mLを取り、3 M NaOHでpHを5.5に調整します。ストック溶液の他の5 mLのpHを3M NaOHで7.5に調整します。 注:pH 5.5では、12-ホスホトン酸(PTA、H3PW12O40)が主に単空アニオンに分解する[PW11O 39]7-.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. テストセルアセンブリ
<ol><li>製造元の指示に従ってテスト セルを組み立てます。</li>
	<li>600グリットサンドペーパーで摩耗した後、漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム)にAg/AgClワイヤーを1本浸し、10分間浸します。石英ナノポア膜(QNM)内に電極を配置します。</li>
	<li>QNMの外側に銀線に埋め込まれた円筒形のAgClペレット電極を配置します。</li>
	<li>テストセルをセットアップしたら、電源装置とデータ集録プログラムをオンにします。テスト セルに溶液がない場合は、DC 電流読み取り値が 0 pA であることを確認します。</li>
	<li>流体線を介して試験セルに接続されたシリンジを使用して、QNMの面の上に緩衝電解液を追加し、イオン電流がアンプを飽和させるようにします。そうでない場合は、QNM が詰まっている可能性があります。ポップ電圧(±1V)および/または300 mm Hgを超える圧力を加えてクリアします。それがうまくいけば、電圧と圧力を下げる。</li>
</ol>3. 脂質二層形成
<ol><li>ソリューションレベルがQNMの面をはるかに上回るように、テストセルに溶液を塗りつぶします。次に、シリンジを介して溶液レベルを顔の下に下げ、電流がゼロに減少するようにします。</li>
	<li>脂質バイアルに10μLピペットチップを浸します。ピペット先端のバックエンドを押し、バイアルの側面をタップして、目に見える脂質をすべて取り除きます。</li>
	<li>溶液レベルがQNMの顔の上にある場合は、テストセル内の溶液の空気水界面にピペット先端をタッチし、脂質が均一に広がるのを2~5分待ちます。</li>
	<li>現在飽和するまでQNMの面より下の溶液レベルをゆっくりと下げ、次にQNMの面を越えて溶液レベルをゆっくりと上げて脂質二層膜を形成する。<ol>
<li>バイレイヤーが形成されると(つまり、電流がゼロになったとき)、圧力を上げて数回ポップし、QNMが詰まらないようにしてください。脂質二重層膜を改質するには、溶液レベルをQNMの面より下に下げ、ゆっくりと上げます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脂質二重層膜が初めて形成されなかった場合は、顔の下の溶液を下に下げ、再び上げます。3つの試験の後に形成されない場合は、3.2および3.3に記載されているように、より多くの脂質を追加します。</li>
	<li>膜を形成した後、適用電位がゼロの場合は、電流オフセットをゼロに設定します。</li>
</ol>4. αHL細孔形成
<ol><li>精製された前形成されたα HLヘプタメリックタンパク質サンプル(または250ngのモノメリックαHL)を試験細胞に加え(体積≥200μL)チャネル形成を可能にする。</li>
	<li>二重層が形成された後にガスタイトシリンジ(図1)で二層層への圧力を高め、QNMから膜を膨張させ、ナノポア挿入を容易にする。各QNMに応じて、通常40~200mmHgの間で適用される背圧を上げます。 注:EBSソフトウェアは、より高いバイアス(通常は200~400mV)を適用して細孔形成を誘導し、単一チャンネルが形成されると自動的に測定バイアスに必要な電圧を低減する自動挿入機能を備えています。</li>
	<li>ナノポアが形成された後、挿入圧力の約1⁄2に背圧を下げる。複数のチャネルが観察される場合は、圧力を大幅に減らしてそれらを削除します。</li>
</ol>5. ナノポアにおける金属クラスターのパーティショニング
<ol><li>電極の不均衡を考慮して、適用電位がゼロに設定されている場合に測定電流が発生しないようなDCオフセット電圧を設定します。</li>
	<li>POMサンプルを追加する前に、制御実験を行い、貯留所に汚染物質(例えば、前の実験からPOMをトレースする)がないことを確認します。具体的には、任意のPOMがない場合に+120 mVから-120 mVの適用電位の下でイオン電流トレースを取得し、自発的な電流遮断が存在しないことを確認します。 注:αHLチャネル(図1)の非対称構造により、イオン電流のマグニテは正と負の印電位で異なります。この印加電圧を上回る測定電流の比率は、膜中のαHLナノポアの配向を示す。</li>
	<li>1~5mM濃度で金属クラスター溶液でリザーバを洗い流してPOMサンプルを追加します。あるいは、細胞集合の前にサンプルを毛細血管にロードし、αHLチャネルのもう一方の端へのPOMの分割を調べたい。</li>
	<li>製造元のソフトウェアを使用してイオン電流を記録し、個々のPOMをナノポアに仕切ることによって引き起こされる一時的な電流遮断を検出します。イオン電流遮断深さ、事象頻度、および封鎖の滞留時間分布から分子の物理的および化学的特性を推定する。</li>
</ol>6. イオンチャンネルの記録とデータ分析
<ol><li>高インピーダンス、低ノイズアンプ、データ集録システムを使用して、イオン電流時系列測定を取得します。各pHに対して-120 mV(チャネルシス側に対して)の印加電圧で測定を行います。</li>
	<li>ローパス100 kHzの8極ベッセルフィルタを信号に適用し、その後500kHz(2ミリ秒/ポイント)でデジタル化します。時系列からイベントを抽出し、MOSAIC ソフトウェア パッケージ32, 33の ADEPT アルゴリズムを使用してイベントを分析します。</li>
</ol>

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</ol>

そのアニオン電荷のために、POMは静電相互作用を通じて有機カチオンと関連する可能性が高い。したがって、POMとの複雑な形成を避けるためには、適切な溶液条件と適切な電解質環境(特に溶液中の陽イオン)を特定することが重要です。バッファーの選択には、特に注意が必要です。例えば、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよびクエン酸緩衝液を用いたPOMの捕捉率は、リン酸緩衝液のそれよりも有意に低い。ナノポアと強く相互作用する。また、NaCl電解質は、KCl(および他のアルカリ金属と同様に)の代わりに意図的に使用され、[PW11O 39]7-by K+の沈殿を回避した。
滞留時間分布の正確な測定に不可欠なのは、十分に高い帯域幅で電流を測定する能力です。例えば、指数関数的に分散した居住時間では、居住時間が長い場合よりもはるかに多くの封鎖があり、多くのデータを収集することで、居住時間分布の正確な推定が得られます(システムの電気容量が可能な帯域幅と同じ高さでそれを取得する)。ナノポア分光法でこの...

単一分子レベルでの生体分子検体の検出は、ナノポアを用いてイオン電流変調を測定することによって行うことができる。典型的には、ナノポアは、その製造に基づいて2つのカテゴリーに分けられます:生物学的(タンパク質またはDNA折り紙から自己組み立て)1、2、3、または固体(例えば、で製造された)半導体加工ツール)4,5.固体ナノポアは、潜在的により物理的に堅牢であると示唆され、溶液条件の広い範囲にわたって使用することができますが、タンパク質ナノポアは、これまでのところ、より大きな感度、ファウリングに対するより多くの耐性、より大きな帯域幅、より良い化学薬品を提供します選択性、およびノイズ比に大きな信号。
黄色ブドウ球菌α-ヘモリシン(αHL)によって形成されたタンパク質イオンチャネルの様々な、イオン(例えば、H+およびD+)2、3、ポリヌクレオチド(DNA)を含む単一分子を検出するために使用することができるおよびRNA)6,7,8, 損傷したDNA9, ポリペプチド10, タンパク質 (折り畳みおよび展開)11, ポリマー (ポリエチレングリコール他)12,13,14、金ナノ粒子15、16、17、18、19、および他の合成分子20。
我々は最近、αHLナノポアが単一分子レベルで金属クラスター、ポリオキソメタレート(POM)を容易に検出し、特徴付けできることを実証した。POMは、182621年に発見された離散ナノスケールのアニオン金属酸素クラスターであり、それ以来、より多くのタイプが合成されています。現在利用可能なポリオキソメタレ酸塩の異なるサイズ、構造、および元素組成物は、化学22、23、触媒24、材料科学25を含む特性と用途の広い範囲につながった ,26, および生物医学研究27,28,29.
POM合成は、典型的には、単量の単量の単量のモノメリック金属塩を混合して水中で行われる自己組織化プロセスである。一度形成されると、POMはサイズと形状の大きな多様性を示します。例えば、ケギンポリアニオン構造は、XM12O40q-が四重子を形成する4つの酸素で囲まれた1つのヘテロ原子(X)から構成され(qは電荷である)。ヘテロ原子は、12オクタヘドラルMO6単位(M=高酸化状態の遷移金属)によって形成されたケージ内に中央に位置し、隣接する共有酸素原子によって互いに連結される。タングステンポリオキソメタレーション構造は酸性条件下で安定であるが、水酸化物イオンは金属酸素(M-O)結合30の加水分解切断につながる。この複雑なプロセスは、1つ以上のMO6オクタヘドラルサブユニットの損失をもたらす,単空および三空種の形成につながり、最終的にはPOMの完全な分解につながる。ここでの議論は、pH 5.5および7.5における12-ホスホトン酸の部分分解産物に限定される。
このプロトコルの目的は、生物学的ナノポアベースの電子プラットフォームを使用して、単一分子限界で離散的な金属酸素クラスターを検出することです。この方法は、溶液中の金属クラスターの検出を可能にする。溶液中の複数の種は、従来の分析方法33よりも高い感度で判別することができる。それにより、POM構造の微妙な違いを解明することができ、NMR分光法に必要な濃度よりも著しく低い濃度で。重要なことに、このアプローチは、Na8HPW9O341の対方体形態の差別を可能にする。

<table><tbody><tr><td>Nanopatch DC System</td><td>Electronic Biosciences, Inc., EBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore LC-PAK</td><td>Millipore 真空フィルター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジフィタノイル-sn- グリセロ-3-ホスホコリン (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>Decane, ReagentPlus, &ge;99%、</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;HL</td><td>リスト 生物学研究所、カリフォルニア州キャンベル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag ワイヤー</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mm Ag/AgCl ディスク電極</td><td>In Vivo Metric</td><td>E202</td><td></td></tr><tr><td>高インピーダンス増幅器システム</td><td>Electronic Biosciences、カリフォルニア州</td><td></td><td></td>サンディエゴ</tr><tr><td>石英キャピラリー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カスタムポリカーボネートテストセル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ処理と分析 MOSAIC</td><td>https://pages.nist.gov/mosaic/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>リンタングステン酸水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455970</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr></tbody></table>

単一金属ナノ粒子の高解像度物理特性評価

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

個々の分子は、単一ナノメートルスケールの細孔を流れるイオン電流を減少させる程度を測定することによって検出され、特徴付けることができる。このシグナルは、分子の物理化学的性質と細孔との相互作用の特徴です。細菌タンパク質エキソトキシン黄色ブドウ球菌αヘモリシン(αHL)によって形成されたナノポアが、単一分子限界でポリオキソメタレート(POM、アニオン金属酸素クラスター)を検出できることを実証する。また、溶液中の12-ホスホトンスチン酸POM(PTA、H3PW12O40)の複数の分解産物を同時に測定する。ナノポア法の単一分子感度により、核磁気共鳴(NMR)分光法に必要な濃度よりも有意に低い濃度でPOMを特徴付けることができます。この技術は、ポリオキソメタレートや他の金属クラスターの分子特性を研究し、POM合成プロセスをよりよく理解し、その収率を向上させる化学者のための新しいツールとして役立つ可能性があります。仮定的には、所定の原子の位置、または分子内の断片の回転、および金属酸化状態をこの方法で調べることができる。さらに、この新しい技術は、溶液中の分子のリアルタイムモニタリングを可能にするという利点があります。

過去20年間にわたり、膜結合タンパク質ナノメートルスケールの細孔は、汎用性の高い単一分子センサとして実証されてきました。ナノポアベースの測定は比較的簡単に実行できます。 電解質溶液で満たされた2つのチャンバーは、電気的に絶縁脂質膜に埋め込まれたナノポアによって分離される。パッチクランプアンプまたは外部電源は、電解質リザーバに浸漬されたAg/AgCl電極を介してナノポア全体に静電電位を提供します。電界は個々の荷電粒子を細孔に駆動し、粒子の大きさ、形状、電荷に依存するイオン電流の一時的な減少を生み出します。コンピュータプログラムは、印加電圧を制御し、リアルタイムで、分子が可逆的に細孔に仕切ることによって引き起こされるイオン電流遮断を制御します。電流は増幅され、低ノイズ、高インピーダンスフィールド効果トランジスタで電圧に変換され、データ集録カードを使用してデジタル化されます。
ここでは、生物学的ナノポアを用いてポリオキソメタレートを検出する...

ここでは、生物学的ナノポアベースの電子プラットフォームを用いて、単一分子限界で離散金属酸素クラスター、ポリオキソメタレート(POM)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、これらの分子の研究に使用される従来の分析化学ツールに対する補完的なアプローチを提供する。

Individual molecules can be detected and characterized by measuring the degree by which they reduce the ionic current flowing through a single ...

このナノポアベースの検出方法は、個々の分子を物理的に特徴付け、同定する可能性を実証しています。このビデオの目的であるメタロナノ粒子を扱うことは、測定の精度と精度を制限するものの理解に挑戦しています。この技術の主な利点は、この装置が従来の脂質二重層記憶設定よりも広い帯域幅を有し、ナノポアでより速い結果とより多くの反応を見ることができるということです。この技術は、1990年代初頭にタンパク質ナノポアの格子、すなわち異なる状態の切り替えが制御でき、分子が細孔壁に結合できることが示されたために可能になった。この技術は、最小限のサンプルを使用するため、商用のDNAシーケンシングアプリケーションのために開発されています。蛍光標識を必要とせず、従来の方法よりもはるかに長い読み取り長さを使用します。この技術は、ゲル電気泳動やクロマトグラフィーよりも精度と速度を高く、そのサイズに基づいてポリマーを区別するためにも開発されています。まず、500ミリリットルの塩化ナトリウム1モルと10ミリモルのリン酸ナトリウムを電解質として超純水に調製します。この特定のセットアップで新鮮なソリューションとサンプルを使用するのが最善です。また、膜の形成に成功するためには、高品質の脱イオン水が非常に重要であることがわかりました。次に、凍結乾燥した野生型モノメリックS.aureusアルファヘモリシン粉末の1ミリグラムを超純水1ミリリットルと組み合わせます。ステープルアウレウスアルファヘモリシン毒素タンパク質での作業は危険なことができますことを忘れないでください。この手順を実行する場合は、MSDS の注意事項に従ってください。次に、ガラスシンチレーションバイアルでエンデカインに1ミリリットルDPhyPCあたり5ミリグラムの4ミリリットルを調製する。バイアルにポリテトラフルオロエチレンの裏地付きキャップをキャップし、最大1ヶ月間摂氏4度で保管します。その後、57.6ミリグラムの12-ホスホタングスト酸水和物を電解質の10ミリリットルに溶解し、2ミリモルのポリオキソメタレート溶液を作ります。POM溶液を2つの5ミリリットルの部分に分けます。3モルの水酸化ナトリウムを使用して、1つのPOM溶液のpHを5.5に調整します。試験の準備を始めるには、平坦な脂質二重層電気生理学装置の試験細胞を組み立てる。まず、銀線を600グリットサンドペーパーでブラドし、市販の次亜塩素酸ナトリウムベースの漂白剤に10分間浸し、塩化銀銀線電極を作ります。ワイヤ電極をリンスして乾かしてから、装置の石英毛管に挿入します。電極を石英ナノポア膜(QNM)内に保管し、毛細管と貯留層を分離します。次に、リザーバーの銀線に取り付けられた円筒形の銀塩化銀ペレット電極を配置します。両方の電極をアンプ回路基板に接続します。次に、データ収集プログラムを開き

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

薄い臓器や腫瘍組織で実行レーザー誘起ブレークダウン分光法は、成功したGd系ナノ粒子から発行された自然の要素と人工的に注入されたガドリニウム（Gd）を検出しました。化学元素の画像が100μmであり、定量的なサブミリ感度の解像度に達した。標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの相溶性が同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。...

レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

走査型透過型電子顕微鏡におけるエネルギー分散型X線トモグラフィーの使用が、単一のナノ粒子内の元素分布を3次元で特徴づけるために説明されています。...

個々のナノ粒子の3次元元素マッピングのためのエネルギー分散型X線トモグラフィー

そのため、パラジウム、金とコバルトの重要性と広範な使用の ハイテク機器における金属は、その回収・リサイクルは重要な産業の課題となっています。本明細書に記載の金属回収装置は、簡単​​、低コストで効果的な検出、除去、都市鉱山からこれらの金属を回収するための手段です。...

検出とパラジウムの回収は、都市鉱山からの金やコバルト金属は、ナノスケールワゴンホイール形の細孔を有する指定小説センサ/吸着剤を使用しました

スペクトルマッピングによる強化された暗視野顕微鏡法とハイパースペクトルイメージングにより、従来の方法よりも速度と精度が向上した組織学的サンプル中のナノスケール材料のスクリーニング、局在化、および同定が可能になります。この論文の目標は、組織学的サンプル中の金属酸化物ナノ粒子の暗視野イメージングとハイパースペクトルマッピングの方法を提供することです。...

強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定

可飽和散乱と逆可飽和散乱は、単離されたプラズモニック粒子で発見され、超解像顕微鏡における新しい非漂白コントラスト法として採用されました。ここでは、非線形散乱を検出して抽出する実験手順と、飽和励起顕微鏡を使用して分解能を向上させる方法について詳しく説明します。...

シングルプラズモニックナノ粒子からの散乱非線形性の測定

CdSまたはZnSの半導体シェルでコーティングされた均一な金ナノ粒子の合成が行われます。半導体コーティングは、最初に硫化銀シェルを堆積させ、銀カチオンを亜鉛またはカドミウムカチオンと交換することによって行われます。...

合成、キャラクタリゼーション、およびハイブリッドのAu / CdSのとAu / ZnSのコア/シェルナノ粒子の機能化

我々 は元素存在原体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in...

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

高貴な金属系ナノ複合材料の継続的かつスケーラブルな合成、新規光触媒反応の開発し、その構造、動作原理と製品品質の最適化戦略を説明しました。...

金属ナノ粒子の正確に制御された沈着量の連続的な流れの光触媒反応

本研究は、サンプル調製、測定、および結果の分析のためのH2020...

水性メディアにおけるナノ材料のUV-Vis分光学的特性解析

液体中での超高速レーザーアブレーションは、液体/空気環境でナノ材料(ナノ粒子[NP]およびナノ構造[NS])を合成するための正確で用途の広い技術です。レーザーアブレーションされたナノ材料は、ラマン活性分子で官能基化して、NS/NP上またはその近くに配置された分析種のラマンシグナルを増強することができます。...

表面増強ラマン散乱ベースのセンシングアプリケーションのための超高速レーザーアブレーションナノ粒子およびナノ構造

ここでは、金(Au)種子の合成について、トルコ法を用いて説明する。次に、これらのシードを使用して、調整可能なプラズモン特性を持つ金-スズ合金(Au-Sn)ナノ粒子を合成します。...

プラズモン金-錫合金ナノ粒子の水系合成

学ぶナノポア検出法によるポリオキソメタレートの単一分子レベルでの物理特性評価。従来法より高速かつ高精度な測定が可能で、DNAシーケンスへの応用も期待される革新的アプローチです。

単一金属ナノ粒子の高解像度物理特性評価

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