シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループット ルシフェラーゼ アッセイ

この方法は、PCSK9のタンパク質分解機能に影響を与える薬剤や遺伝的変化など、PCSK9生化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、本質的に低周波の生化学的事象を迅速かつ増幅的に読み出すことができることです。この技術の意味は、PCSK9タンパク質分解機能が血清コレステロール値に対する最終的な効果に必要であるため、アテローム性動脈硬化性心疾患にまで及びます。

この方法はPCSK9自体についての洞察を提供することができますが、本質的に低いタンパク質分解活性を持つ他のプロテアーゼなどの他の生化学システムにも適用できます。まず、各HEK293 T細胞から培地を吸引します。PBSで洗浄し、0.5%トリプシン-EDTAの最小容量で処理します。.

そして、摂氏37度で2〜5分間インキュベートして、親フラスコから細胞を解離させます。10%FBSを添加した2容量のDMEMを追加して、トリプシンEDTAを不活性化します。次に、フラスコ内の液体を数回上下にピペットで動かし、付着細胞を取り外し、細胞を滅菌チューブに移します。

次に、細胞の小さなアリコートを取り除きます。等量のトリパンブルーで染色し、染色した細胞をスライドに移し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。チューブをGの500倍で5分間遠心分離し、細胞を回収します。

この後、培地を吸引し、細胞と培地を所望の濃度に再構成します。マルチチャンネルピペットと滅菌トラフを使用して、各ウェルの細胞100 μmを白い96ウェルプレートに移します。次に、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と24時間インキュベートします。

次に、プラスミドのプレートをトランスフェクション用の所望の濃度に調製し、ポジティブコントロールプラスミド、ネガティブコントロールプラスミド、およびプラスミドフリーバッファー用にそれぞれ4つのウェルを含めます。まず、希釈脂質トランスフェクション試薬のマスターミックスとDNAプレコンプレックス試薬のマスターミックスを調製します。次に、マルチチャンネルピペットと滅菌トラフを使用して、16.8マイクロリットルの希釈DNAプレコンプレックス試薬をディープウェルプレートの各ウェルに分注します。

この後、マルチチャンネルピペットを使用して、各プラスミドの3.2マイクロリットルをマスタープレートからディープウェルプレートの各ウェルに移します。次に、ピペットを使用して、20マイクロリットルの希釈脂質トランスフェクション試薬混合物をプレートの各ウェルに加え、十分に混合します。プレートを覆い、室温で10〜15分間放置して脂質DNA複合体を形成します。

この後、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートの293 T細胞から培地を静かに取り出します。次に、ミディアムを95マイクロリットルのDMEMに10%FBSを補充して交換します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、10マイクロリットルのトランスフェクション混合物を各適切なウェルに加えます。

次に、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と24時間インキュベートします。まず、PBS中の3モルアスコルビン酸ナトリウム、蒸留水中の5モル塩化ナトリウム、PBS中のBSA1ミリリットルあたり10ミリグラム、酸性化メタノール中の2ミリモルのセレンテラジンなど、倍強度のセレンテラジンアッセイ試薬の製造に必要なストック溶液を調製します。次に、ルシフェラーゼ読み出しに十分なセレンテラジン試薬を調製します。

培地中の細胞ごとに別々の試薬を使用します。次に、セレンテラジンに期待されるすべての試薬を混合します。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターで混合物をろ過します。

そして、ろ過後、セレンテラジンを加えます。トランスフェクションの24時間後にインキュベーターから細胞を取り出します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから50マイクロリットルのコンディショニングメディウムを新鮮な白い96ウェルプレートに移します。

マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルの倍強度非溶解性セレンテラジン試薬を、調整培地のみを含むプレートに追加します。その後、プレートを暗所で室温で5〜10分間静かに振ってください。次に、細胞を含むプレートにDouble-Strength Lytic Coelenterazine Reagentを添加して、この手順を繰り返します。

インキュベーション後、プレートリーダーで培地のみのプレートと細胞含有プレートの発光を測定します。最後に、プレートを破棄し、さらなるデータ分析のためにファイルを保存します。ルシフェラーゼ試薬を培地専用プレートと細胞含有プレートと同時間インキュベートすることは、これらのプレートのデータが直接比較されるため、重要です。

このプロトコールでは、基質部位P6からP6 PrimeにおけるPCSK9プロテアーゼの切断配列特異性をルシフェラーゼアッセイによって評価しました。P6およびP4からP1 Primeの位置における切断配列の変化は、プロテアーゼによる許容度が低いです。ただし、P5 と P2 Prime から P6 Prime までのポジションは、より柔軟に変更できます。

さらに、この結果は、最適な切断シーケンスが野生型シーケンスと基本的に同じであることを示しています。クリニックで見つかった誤送スニップのライブラリの相対的な切断活性を、野生型プロテアーゼと比較しました。評価された84のスニップのうち、半数以上が野生型プロテアーゼと比較して活性の有意な変化を示し、プロテアーゼ活性の変化が臨床集団で頻繁に観察されることを示唆しています。

この手順に続いて、フローサイトメトリーや肝細胞中のコレステロール取り込みアッセイなどの他の方法を実行して、LDL受容体に対するPCSK9のPCSK9の影響に対するPCSK9タンパク質分解能力の変化を評価することができます。