Name: 物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぼう、P1ファージ導入を用いて大腸菌の遺伝子欠失変異体を迅速かつ確実に作製する方法。このプロトコルは抗生物質耐性カセットを活用し、微生物学における遺伝子機能解析に有用です。

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慶應コレクション系統は、ナショナルバイオ リソース プロジェクト (遺伝研, 日本) から得られた:エシェリヒア属大腸菌。彼の継続サポートありがとうダーク リンケ (バイオ サイエンス学科、オスロ大学)。この作品は、ノルウェー若手研究者グラント 249793 (ジャック C. レオ) に研究評議会によって賄われていた。

1 系統とプラスミド
<ol><li>
細菌の緊張
	<ol>
<li>大腸菌株 BW251135JW4179 (BW25113 tamA::kan)7、BL21(DE3)20、および BL21ΔABCF21を使用します。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
バクテリオファージ
	<ol>
<li>一般的な伝達にバクテリオファージ P1virを使用します。クロロホルムを数滴の液体在庫としてバクテリオファージを格納 (手順 2.2 参照)。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プラスミド
	<ol>
<li>このプロトコルでは、次のプラスミドを使用: pCP2022、pIBA2 矢田23、および24pEibD10。制御プラスミドとして pASK IBA2 と pET22b (材料の表を参照) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
成長の条件
	<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB) 中25 37 ° C または BL21ΔABCF と pCP20 を含む系統の場合 30 ° C で活発な動揺 (180-200 rpm) の中の細菌に伝達します。</li>
		<li>43 ° C で硬化性プラスミドを実行します。</li>
		<li>固体培地の寒天 1% (w/v) ポンドを補足します。</li>
		<li>上の寒天の 0.7% 寒天と 10 mM CaCl2とオートクレーブ中で LB を補足します。エレクトロポレーション26後回復のため SOC 培地を使用します。</li>
		<li>抗生物質のため下記の濃度を使用: アンプと菅の 25 μ g/mL の 100 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ファージ Lysate を準備します。
<ol><li>
ドナー株の感染
	<ol>
<li>5 mL の LB 培 10 mM CaCl2とし、必要に応じて菅でドナー株 JW4197 を成長 (25 μ g/mL) 600 の光学濃度に 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を用いた OD600の値を測定します。</li>
		<li>LB 培地で既存の P1 バクテリオファージ株式の希釈系列を作る: 10-3 10-7~ 間の希釈を推奨します。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ライセート作製
	<ol>
<li>次の日は、バクテリオファージのプラクの半合流成長とプレートを選択します。半合流プレートの約半分の表面積プレートは明らか (図 3)。</li>
		<li>接種ループまたは同様のツールを使用してこのようなプレートから上の寒天層をこすり、遠心管中上の寒天を配置します。ヒューム フードの LB の 1-2 mL とクロロホルムと渦 ~ 1 分追加、クロロホルムは積極的にチューブのドロップを追加します。</li>
		<li>寒天と菌体ペレットへ 4,000 g以上で 15 分の管を遠心します。</li>
		<li>ペレットからの残骸の上に運ぶ回避する新鮮な遠心チューブに上清を移動します。クロロホルムの 2 滴を追加し、4-10 ° c. でライセートを格納ヒューム フードのクロロホルムを追加します。これは伝染性の粒子の数の大幅な削減になりますので、ライセートすぎるバクテリオファージは凍結しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶解液の力価を決定します。
	<ol>
<li>37 ° C で 10 mM CaCl2文化 〜 1.0 の外径 φ600まで添加した LB の BW25113 に成長します。</li>
		<li>LB (例えば、10-6– 10-9) の lysate のバクテリオファージの希釈系列を調製します。 注: 必ずピペット、サンプルを希釈するクロロホルムの転送を避けるために lysate の上から。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
		<li>次の日は、各プレートのプラーク (細菌のマットで明確な地域) の数をカウントし、次の数式を使用して、溶解液の力価を計算します。 <img alt="ウイルス力価式:力価(pfu/mL)=Σプラーク/Σ希釈×プレーティング係数。" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 例: 希釈 10-7, 10-810-9とプレートにあり 231、27、2 プラク、それぞれ。感染症の各希釈 100 μ L を用いてプラーク形成力価が表されるので、単位 (pfu)/mL、めっき因子は 10。これらの数値は、数式に入力されます。 <img alt="プラーク形成単位(pfu)、式、ウイルス学データ分析チャートを使用したウイルス力価計算。" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> したがって、力価は約 2 × 1010伝染性のバクテリオファージの粒子/mL です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 伝達
<ol><li>
受信者のセルの準備
	<ol>
<li>600 の光学濃度に添加した LB の受信者株 BL21ΔABCF を成長 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を使用して、外径 φ600の値を測定します。</li>
		<li>ライセートのバクテリオファージの感染 (MOI) 値が 0.5 の多様性を達成するために必要なボリュームを計算します。慣性モーメントを計算するには、文化の OD600に基づいて細菌の数を見積もる。外径600値 1.0 が 10 〜9 cfu/mL に対応することを想定してください。ライセートの知られている力価に基づいて必要な容量を計算します。 (2.3.6 の手順の後の例で計算力価に基づく) の例: <img alt="ファージ力価計算式V=(ファージ数)/(ライセート力価)μLへの変換。" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
		<li>10 mm 受信者ひずみ文化に CaCl2を加え、混ぜます。文化伝達のための 1 mL を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
伝達を行う
	<ol>
<li>3.1.2 のステップで計算される (CaCl2 10 mm 含む) 受信者の文化の 1 mL に溶解バクテリオファージの適切なボリュームを追加、軽く混ぜます。 注: は、ミックスにクロロホルムを転送しないようにするライセートの上からサンプルをピペットように注意します。</li>
		<li>37 ° C で 20 分のミックスを静的にインキュベートします。</li>
		<li>100 mm pH 5.5、クエン酸ナトリウムを追加することによって感染を停止します。</li>
		<li>細菌 (5,000 × gを 2 分間) を遠心し、上清を除去、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>3.2.4 無料ファージとカルシウムの除去を確保するためのステップのようにさらに 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL 中の細菌を再懸濁します。30 ° C (&gt; 100 rpm) の揺れで 1 h で細菌を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離 (5,000 × gを 2 分間) によって細菌を収集し、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 の LB の ~ 100 μ L でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>25 μ g/mL と 10 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5、菅と補われる LB プレートに細菌を広げるし、植民地 (~ 24 h) が表示されるまでに、30 ° C でバクテリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
形質を選択します。
	<ol>
<li>植民地選択板で育った、単一コロニーのためポンド + 菅にそれらを restreak、シングル コロニーが表示されるまで、30 ° C で成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 常套菅カセット
<ol><li>
組換えのプラスミッドの変形
	<ol>
<li>菅耐性 BL21ΔABCF ひずみ electrocompetent を確認します。<ol>
<li>菅首相は補われる新鮮な LB (5 mL) の単一コロニーから株を成長 (25 μ g/mL) 30 ° c まで OD600 ~0.5 – 0.7。</li>
			<li>ここから、4 ° c または氷の上、次の手順を実行します。細菌 (5,000 × gで 10 分間) を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>2 回前の遠心分離のステップを繰り返すことによって冷たい蒸留水細胞ペレットを洗浄し、最後に、氷冷 10% グリセロールの 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>氷の上 1 mm エレクトロポレーション キュベットを冷やします。</li>
		<li>細胞懸濁液にプラスミド (pCP20) の 1 pg を追加、穏やか、懸濁液に混合し、冷却エレクトロポレーション キュベットに転送。</li>
		<li>本体を 1.8 に設定 kV および electroporate 細胞。</li>
		<li>SOC 培地 1 mL を追加し、30 ° C で 1 時間のそれらの成長によって変換されたセルを救出します。</li>
		<li>ポンド上のセルの 100 μ L をプレート + アンプ板し一晩 30 ° C で細胞を成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再結合の誘導
	<ol>
<li>LB + アンプからシングル コロニーをピックアップ プレートし、すべての抗生物質を省略する新鮮な LB を接種します。</li>
		<li>FLP リコンビナーゼの発現を誘導するために一晩の非寛容な温度 (43 ° C) でセルを育てなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants を選択します。
	<ol>
<li>シリアルの希薄を作ると非選択式ナンバー プレートに 105-106希釈の 50 μ L をプレートし、一晩 30 ° c. でそれを育てる</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 遺伝子欠失の検証
<ol><li>
成功した組換えプラスミドの損失の検証
	<ol>
<li>ストリーク プレート ステップ 4.3.1 LB + 菅、LB + アンプで準備からこの順序で、抗生物質がない LB プレート シングル コロニー。ストリー キングの支援するためコロニー グリッドを使用 (補足のファイル 1を参照してください)。植民地 (~ 24 h) が表示されるまで、30 ° C でプレートを成長します。</li>
		<li>非選択的プレート上に成長したが、さらに検証のための選択培地で成長に失敗しました 10-20 クローンを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コロニー PCR による追加検証
	<ol>
<li>並ぶ多摩コーディング配列のプライマーとコロニー PCR を実行 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>PCR のマスターの組合せを準備します。必要なミックスは、(表 1の例を参照してください) テストするコロニーの数によって異なります。氷の試薬を混ぜて、最後ポリメラーゼを追加します。</li>
		<li>PCR マスター ミックスを混和し、PCR ストリップのチューブに 20 μ L を分注します。少量の滅菌ピペット チップを使用して上映される各コロニーをピックアップし、それをチューブに追加します。比較のため、元の受信者ひずみを含めるようにしてください。必要に応じて、ドナーの負担があります。</li>
		<li>PCR の反作用を実行 (使用プログラムの表 2を参照)。</li>
		<li>1% の agarose のゲルを準備します。<ol>
<li>50 mL ゲルの agarose の 0.5 g を測定し、50 mL の TAE バッファー (40 mM トリス、20 mM 酢酸と 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を追加します。すべて agarose が溶けるまで電子レンジでの混合物を加熱します。</li>
			<li>Agarose が解散後約 50 ° C にソリューションを冷却し、DNA 染色色素の 5 μ L を追加します。ソリューションをよく混合し、鋳造の部屋でゲル トレイにそれを注ぐ。すべてのサンプルを分子量マーカーの十分な井戸があります、よく櫛の 1 つまたは複数の行を挿入します。30 分に設定するゲルを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR の実行が完了すると、各サンプルに 4 μ L の DNA 読み込み染料 × 6 を追加します。ゲルの電気泳動室にし、井戸が覆われているまでに TAE バッファーを追加します。</li>
		<li>10-15 μ L をゲルの井戸に各 PCR の反作用から適用されます。分子量マーカーの 5 μ L を追加もできます。その後、75 V で 30 分のためのゲルを実行します。</li>
		<li>実行が完了すると、青の光の撮像素子を使用してゲルをイメージします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. その他のテクニック
<ol><li>
蛋白質の表現 注: テスト蛋白質 (矢田・ EibD) の表情をしています23,24詳細他の場所で説明されています。これは、主な手順の概要です。<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ多摩 wi 番目に必要なプラスミド (pIBA2 矢田と pEibD10 と対応する制御プラスミド) を変換し、LB + アンプの形質転換体の選択。</li>
		<li>蛋白質の表現のため一晩培養変形中の 1 mL の LB 培地 + アンプの 100 mL を接種してその時点での中間ログ段階まで 30 ° C で栽培、(100 ng/mL) でいずれかの anhydrotetracycline を持つ蛋白質の生産を誘発するか(0.5 mM) でイソプロピル thiogalactoside。</li>
		<li>30 ° C で誘導の 2 h 文化の濁度を測定し、OD600で 50 mL に対応するセルの数を収集した後は、4,000 x gで 15 分間文化を遠心分離によって 1.0 を = します。餌を洗浄 1 x 10 mm HEPES、pH 7.4 では、し、いずれかは-20 ° C またはプロセス ステップ 6.2 のようにさらにそれでそれを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
外膜抽出 メモ: 外膜抽出は実行されますレオらによって詳細に説明されているよう27. 主な手順を以下に記載します。<ol>
<li>10 mm HEPES、pH 7.4 では、1 mL の細胞ペレットを再懸濁します補足 10 mM MgCl2と MnCl2リゾチーム (0.1 mg/mL)、DNase のピンチと私。</li>
		<li>(例えばビード ・ ビーターを使用して) 細胞を溶解させます。</li>
		<li>細胞の残骸を削除し、新鮮なチューブに上清を移動直後のセル (15,600 x gで 2 分) を遠心します。</li>
		<li>16,000 x gで 30 分間細胞を遠心分離後、1 %n ラウロイル サルコシン 10 mM HEPES、pH 7.4 の 400 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>その後、室温で 30 分間撹拌で細胞をインキュベート、上記として 30 分のそれらを遠心分離機します。</li>
		<li>洗って、半透明ペレットを 10 mM HEPES、pH 7.4 では、200 μ l 1 x 10 mM HEPES の 30 μ L でそれを再懸濁します、4 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 10 μ L を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
活性測定法 注: は、として記述されている28矢田と EibD の SDS-PAGE と活性アッセイを実行します。主な手順は以下のとおり。</li>
	<li>
SDS ページ
	<ol>
<li>5 分の 50 ° c のサンプルを加熱すると、タンパク質の変性を避けるために、ポリアクリルアミドのゲルにロードする前に。</li>
		<li>SDS ページの分離、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜に蛋白質を転送します。</li>
		<li>転送後、PBS で 2% 脱脂ミルク パウダーと膜をブロックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
矢田コラーゲン遠い西部のしみ方
	<ol>
<li>ブロック後、10 μ g/mL の濃度にブロック バッファーで希釈私牛由来のコラーゲンの種類を追加、1 h の膜を孵化させなさい。</li>
		<li>2 膜を洗浄する PBS + 0.05% Tween20 x (PBS-T)。</li>
		<li>ブロック バッファー内膜に一次抗体 (モノクローナル抗コラーゲン COL 1)、希薄化後の 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベート後ステップ 6.3.2.2 で述べたように 2 x を洗浄し、ブロック バッファーで希釈 1: 10,000、二次抗体 [ヤギ抗マウス IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役] を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS T で 2 倍製造元の指示に従って膜強化化学発光基質を追加し、CCD カメラを使用してバンドを検出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 結合の試金
	<ol>
<li>後に、ブロック (ヤギ抗うさぎ HRP)、二次抗体希釈バッファーの妨害に 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS で 2 倍。前述のステップ 6.3.2.5 化学ルミネセンスの検出を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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P1 伝達は、エシェリヒア属大腸菌の遺伝子の削除を生成するための高速、堅牢で、信頼性の高い方法です。BL21 由来の受信者に慶應義塾ドナーひずみから多摩失変異を伝達でここでこれを示します。伝達プロセスの主要な段階は、ライセートの生産、伝達自体、菅抵抗カセットの切除および PCR によるノック アウトの検証です。合計では、プロセスは約 1 週間ほどかかります、検証のため最終の PCR から離れて使用される分子生物学方法は必要ありません。したがって、P1 伝達赤組換え費やされる努力と λ との時間で競うことができる、伝統的なマーカー交換変異よりもはるかに高速です。
提案するプロトコルは、非常に堅牢な手順の多くの修正が可能します。ただし、いくつかの重要なパラメーターがあります。P1 の感染症、カルシウム イオンを媒体に追加する必要が。カルシウムは、細菌にバクテリオファージの吸着に必要な障害媒体に十分なカルシウムを追加するは、感染症の効率を大幅に削減します。いくつかの細菌株 BL21ΔABCF する傾向があるなど、CaCl2<sup...

遺伝子の機能を検討する共通の最初のアプローチは、ノックアウト変異を実行し、結果の表現型を観察することです。これはまた逆遺伝学と呼ばれます。最後の 70 年間またはそう、その培養と遺伝子操作1こうして容易なため細菌エシェリヒア属大腸菌分子生物学の主力となっています。エシェリヒア属大腸菌、マーカー交換変異2,3と、最近では、λ 赤または Rac ET システム4,5を使用してジーンを含む遺伝子の削除を生成するいくつかの方法が開発されています。,6。
広く使われているシステムでは、個々 の遺伝子のコード配列が染色体5,7から後で摘出することができます抗生物質耐性カセットに置き換えられます。いずれかの側に flippase (FLP) 認識対象 (FRT) サイトが並ぶされているカナマイシン (菅) 抵抗カセットによって例えばコーディング シーケンスが置き換えられます。FRT サイトは菅カセットの削除につながる FRT サイト間の部位特異的組換えを媒介する FLP リコンビナーゼによって認識されます。この方法で、約 100 塩基対 (bp) (図 1) のシーケンスでのみ最小限の傷跡を残して、ある特定の遺伝子のコーディング シーケンスの完全な削除を実現できます。
わずか 10 年前、いわゆる慶應義塾コレクションが開発されました。ほぼすべての非本質的な遺伝子が λ 赤組換え7,8によって削除された個別に標準検査大腸菌K12 株に基づく細菌ライブラリです。このコレクションの各内のクローンは、物品税課税対象の菅抵抗カセットに置き換えられます 1 つのコーディング シーケンスを持っています。慶應コレクションは、多くのアプリケーション9便利なツールを証明しています。そのようなアプリケーションは、他の大腸菌の欠失変異株の生産です。特定削除クローンから菅カセットは、バクテリオファージ P110、11,12,13,14などを一般に伝達によって動員することができます。そのようなストレスから調製したファージ株式使用できます受信者、関心の大腸菌に感染する、低いが信頼性の高い周波数菅でカセットを含む地域に組み込むことが受信者のゲノムの相同組み換えによる(図 2)。菅含有培地で成長形質を選択できます。この後、抗生物質耐性カセットの除去が必要な場合、FLP リコンビナーゼはトランスで transductant 株に指定できます。抵抗、アンピシリン (Amp) のマーカーを運ぶ、FLP を含むプラスミドを硬化後、菅とアンプに敏感なクローンを上映するほか、正しい切除野生型のコーディング シーケンスと菅カセットはコロニー PCR によって確認されます。
ここでは、ノックアウト上記戦略に基づく大腸菌の菌株の生産のステップのそれぞれを記述する詳細なプロトコルが表示されます。例として、多摩遺伝子の削除が示されています。多摩は、アセンブリ モジュール (TAM)、特定の細胞蛋白質と線毛15,16,17の生合成に関与する輸送の一部である外膜 β バレル型タンパク質をエンコードします。このノックアウトのひずみを 2 つの三量体細胞アドヘシン (TAAs)、エルシニア双球菌矢田、エシェリヒア属大腸菌免疫グロブリン (Ig) の器官に多摩の削除の影響を調べる使用して-バインド TAA EibD18,19。

<table><tbody><tr><td>Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 BW25113</td><td>遺伝研</td><td>ME6092</td><td>慶應コレクションの野生型</td></tr><tr><td>株大腸菌 BL21(DE3)</td>メル<td>ク</td><td>69450-3</td><td>発現株</td></tr><tr><td>大腸菌 BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>BL21(DE3)から誘導</td></tr><tr><td>大腸菌 JW4179</td><td>遺伝学研究所</td><td>JW4179-KC</td><<td>em>tamA 欠失変異体</td></tr><tr><td>P1 vir</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>一般にバクテリオファージ</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>発現ベクター</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>EibD の産生用; プラスミドはご要望に応じて入手可能</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>発現ベクター</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>YadA の産生用; プラスミドはご要望に応じて</td></tr><tr><td>入手可能Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>BD バクト</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>アプリケム</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>アンヒドロテトラサイクリン</td><td>アブ</td><td>カム ab145350</td><td></td></tr><tr><td>抗コラーゲン I 型抗体 COL-1</td><td>シグマ</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>ウシ コラーゲン I 型</td><td>シグマ</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>102445</td><td></td></tr> リン酸<tr><td>水素</td>ナトリウム <td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA 色素</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA 分子サイズマーカー</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>シグマ</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTPミックス</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP基板</td>アド<td>バンスタ</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>アプリケーションケム</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>VWR</td><td>24388ヤ</td><td></td></tr><tr><td>ギ抗マウスIgG-HRP</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-2005</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギIgG-HRP</td><td>アグリセラ</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルチオガラクトシド</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>スキムミルク</td><td>粉乳 Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>tamA フォワードプライマー</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3'</td></tr><tr><td>tamA リバースプライマー</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>配列 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq</td></tr> <tr><td>DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>シグマ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>メルク</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動チャンバー</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>ビーズビーター</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションユニット</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージャー</td><td>日本ジェネティクス</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションシェーカー</td><td>インフォサーズ HT</td><td>ミニトロン</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>サムスン</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCRマシン</td><td>バイオメトラ</td><td>パーソナル</td><td></td></tr><tr><td>PCRストリップ</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG電気泳動チャンバー</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>ウェットトランスファーユニット</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット p1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

細菌の未知遺伝子の機能を勉強する最初のアプローチは、この遺伝子のノックアウトを作成することです。ここでは、バクテリオファージ P1 と一般化伝達を使用して別に 1 つのエシェリヒア属大腸菌の緊張から遺伝子欠失変異体を転送するための堅牢で高速なプロトコルについて述べる。このメソッドは、変異が選択可能な (例えば、抗生物質のカセット挿入を使用して遺伝子破壊に基づく) にする必要があります。このような抗生物質のカセット ドナーひずみから動員できる興味の受信者にすばやく導入し、遺伝子失変異を簡単に生成します。抗生物質のカセットは、ゲノムのシーケンスでのみ 〜 100 ベース ペア長い傷跡きれいなノックアウトを生成するサイト固有のリコンビナーゼによってカセットの切除ができる flippase の認識部位を含むように設計できます。プロトコルを示す細胞の生合成に関与するアセンブリ因子多摩遺伝子をノックアウトし、器官にこのノックアウトの効果と 2 つの三量体細胞アドヘシンの機能をテストします。P1 伝達によって遺伝子の欠失は、その制限があります、使いやすさとその実装の速度は、遺伝子欠失の他の方法に代わる。

BL21ΔABCF のノックアウトから多摩の生成:
上記の戦略は、BL21(DE3) で、外膜タンパク質の生産用に最適化され、BL21ΔABCF21と呼ばれるタンパク質の生産に使用される標準的な実験室ひずみのデリバティブ歪みを生成する以前使用されています。この株は、豊富な外膜蛋白質のために符号化する 4 つの遺伝子を欠いているし、その結果、野生型株よりもクローンより表現の外膜蛋白質を作り出すことが。TAM は、TAA の生合成に関与しているかどうかをテストするため多摩遺伝子はこのような背景から削除されました。
ライセートの P1 は、慶應義塾コレクションひずみ JW4179、ここ多摩の遺伝子 (以前呼ばれるyftM) シ...

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1 ファージ伝達を使用して受信者負担の対応する軌跡に挿入することができます。

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

この手法は、特定の遺伝子の機能を調べるなど、微生物学の分野で有用です。この方法の主な利点は、大腸菌のノックアウト変異体を生成するための高速で信頼性の高い方法であることです。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるThomas Trunkです。切除可能な抗生物質カセットに基づく遺伝子欠失を含むドナー株に感染させるには、まず、5ミリリットルのリゾジェニーブロス(LB)で細菌を10ミリモルの塩化カルシウムで増殖させ、オプションで1ミリリットルあたり25マイクログラムのカナマイシンで、光学密度600ナノメートルで約1.0まで増殖させます。LB培地で既存のP1ファージストックの希釈シリーズを作成し、200マイクロリットルの細菌懸濁液を各100マイクロリットルのファージ希釈液と個々の15ミリリットルの遠心分離チューブで混合します。チューブを37°Cで20分間静的にインキュベートします。インキュベーションの終わりに、チューブに10ミリモルの塩化カルシウムを補充した約3ミリリットルの溶融トップ寒天を追加します。内容物をボルテックスで混合し、事前に温めたLBプレートに混合物を注ぎ、均一な層を作ります。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、ファージプラークが半コンフルエントに増殖しているプレートを選択し、接種ループを使用して上部の寒天層を遠心分離チューブにこすり落とします。ヒュームフードの下で、1〜2ミリリットルのLBとクロロホルムをチューブに加え、チューブを1分間激しく渦巻きます。寒天細胞と細菌細胞を遠心分離してペレット化し、上清を微量遠心チューブに移して、ペレットからの破片を避けます。次に、クロロホルムを2滴加え、ライセートを摂氏4〜10度で保存します。P1形質導入のためには、LB中のレシピエント株を600ナノメートルで1の光学密度まで成長させ、レシピエント株の培養物に塩化カルシウムを10ミリモルまで混合して添加します。次に、サンプルの上部から適切な量のファージライセートを添加して、クロロホルムを1ミリリットルのレシピエント培養物に移して感染の多様性が0.5になるのを防ぎ、混合物を摂氏37度で20分間静的にインキュベートします。インキュベーションの終了時に、クエン酸ナトリウムを1リットルあたり100ミリモルに添加して感染を止め、形質導入細菌を遠心分離します。形質導入後にクエン酸ナトリウムを添加することは、野生型細菌ファージによるさらなる感染を防ぐため、重要なステップです。100ミリモルのクエン酸ナトリウムを添加した新鮮なLB1ミリリットルにペレットを再懸濁し、細胞をさらに2回洗浄して、遊離ファージとカルシウムを確実に除去します。最後の洗浄後、100ミリモルのクエン酸ナトリウムを補充した1ミリリットルの新鮮なLBに細菌を再懸濁し、摂氏30度、100RPMで1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細菌を回収し、100ミリモルのクエン酸ナトリウムを補充した約100マイクロリットルのLBにペレットを再懸濁します。次に、1ミリリットルあたり25マイクログラムのカナマイシンと10ミリモルのクエン酸ナトリウムを補充したLBプレートに細菌を広げ、コロニーが現れるまで摂氏30度で細菌を増殖させます。形質導入剤を選択するには、コロニーを新しいLBプラスカナマイシンプレートに再取り付けて、単一のコロニーが現れるまで摂氏30度で単一のコロニーを成長させます。カナマイシンカセットを切除するには、カナマイシン耐性レシピエント株をエレクトロコンピテンシーにします。.リコンビナーゼをコードするpCP20血漿DNAの1ピコグラムを細胞懸濁液に加えます。懸濁液を穏やかに混合し、冷却した1mmエレクトロポレーションキュベットに移します。エレクトロポレーターを1.8キロボルトに設定して細胞をエレクトロポレーションし、形質転換した細胞を1ミリリットルのSOC培地で摂氏30度で1時間レスキューします。次に、LBとアンピシリンプレートに細胞の100マイクロリットルをプレート化し、摂氏30度で一晩培養します。翌朝、抗生物質を使用せずに新鮮なLBで接種するための単一のコロニーを選択し、摂氏43度の非許容温度で細胞を一晩成長させて、フリッパーゼリコンビナーゼの発現を誘導します。次に、非選択的プレート上に50マイクロリットルの段階希釈液をプレート化し、摂氏30度で一晩培養し、抗生物質耐性カセットを失ったクローンをスクリーニングします。P1形質導入とカナマイシンカセット切除後、アンピシリンとカナマイシンの両方に感受性のあるいくつかのクローンを得ることができ、クローン内のtamA遺伝子の正常な欠失をコロニーPCRによって確認することができる。タンパク質産生を誘導した後、発現培養物の外膜画分をSDS-PAGEで単離し、分析することができます。親株とtamAノックアウトレシピエント株の発現レベルとの間に大きな差は観察されませんが、YadAはノックアウト株ではやや低いレベルで産生されるようです。EibDではその逆が当てはまるようです。tamAの欠乏がタンパク質の正しいフォールディングまたは輸送に影響を与える可能性があるかどうかを調べるために、タンパク質がリガンに結合する能力をコラーゲンファーウェスタンブロットでテストできます。この代表的な実験では、YadA結合コラーゲンが親株とノックアウト株の両方で同程度のレベルで検出され、タンパク質が正しく折り畳まれ、機能していることが示されました。同様に、2つの株におけるEibDのIgG結合活性はタンパク質の発現と相関しており、tamAの欠失が三量体自己トランスポーターアドヘシン生合成に有意な影響を与えないことを示しました。この手順を試みるときは、優れた無菌技術を使用し、pCP20を含む細菌を30度以下で増殖させることを忘れないでください。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、ドラフトでの作業や耐薬品性の手袋や白衣の着用による個人の保護などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されている...

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

出典:バレンタイン、ME、他。Pseudomonas aeruginosaにおけるインフレーム遺伝子欠失変異株の作製と感染の単純なマウスモデルにおける病原性減衰の試験J. Vis. 経験。 (2020)。このビデオでは、プラスミドベースの遺伝子欠失戦略を使用した緑 膿...

標的遺伝子欠失のための緑 膿菌 の二重クロスオーバー組換え体の生成

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。...

の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

抗生物質耐性の進化でマルチコピー...

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

ここでは、市販品に対する米国食品医薬品局(FDA)承認の大腸菌と比較して、緑膿菌の遺伝子組み換え株の減衰を評価する感染のマウスモデルの簡単かつ再現性の高いプロトコルについて説明する。...

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。...

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

学ぼう、P1ファージ導入を用いて大腸菌の遺伝子欠失変異体を迅速かつ確実に作製する方法。このプロトコルは抗生物質耐性カセットを活用し、微生物学における遺伝子機能解析に有用です。

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

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