Name: 慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法を用いて慢性リンパ性白血病細胞におけるNFAT2の新規ターゲット遺伝子を識別する方法。転写因子とDNAの相互作用を検出し、発がんメカニズムの解明と治療戦略の開発に貢献します。

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この作品は、DFG によって支えられた MU 3340/1-1 およびドイツ Krebshilfe 付与 111134 (M.R.M. に授与の両方) を付与します。ありがとうエルケ Malenke 優れたテクニカル サポート)。

ひと由来の材料とすべての実験は、テュービンゲン大学の倫理委員会によって承認され、本研究のサンプルを貢献したすべての患者から文書によるインフォームド コンセントを得た。
1. 分離および刺激の Jurkat 細胞
注: プロトコルを最適化して、NFAT2 の高レベル表現に知られている Jurkat 細胞ラインを使用します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。
<ol><li>37 の ° C の水浴中に温暖化によって 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを RPMI 1640 の 50 mL を準備します。</li>
	<li>10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン約 2 × 10 の密度に6セル/mL 添加 RPMI 1640 20 mL に CO2を 37 ° C、5% で細胞培養用フラスコ 1 2 d の Jurkat 細胞の培養 (細胞はトリパン ブルーとカウント ブルー染色とノイバウアーは顕微鏡下で商工会議所) 200 x gで 5 分間遠心分離によってそれらを収穫。</li>
	<li>ピペットで上澄みを除去し、10 mL の 10% の FCS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 に細胞を再懸濁します。その後、従来トリパン ブルー染色と顕微鏡下でノイバウアー室セルをカウントします。</li>
	<li>手順 1.3 200 x gで 5 分間から細胞を遠心し、吸引により、上清を除去します。その後、ピペッティングにより 10 %fcs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと転送新しい従来の 5 mL の管に 1 mL を添加した RPMI 1640 年に 2 × 107細胞/ml の密度で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>32.4 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) およびイオノマイシン 1 μ M を追加することで、細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。</li>
</ol>2. 分離と人間の患者からプライマリ CLL 細胞の刺激
注: 患者サンプルに買収され前述7として刺激します。すべての手順は、層流フードの下で実行されます。
<ol><li>患者から採血し、密度勾配分離を実行して必要な機器を準備: 21 G 針、止血帯、NH4-ヘパリン-血のコレクション注射器 (例えば、S-monovettes)、PBS、密度勾配の中小 x 1 (密度 1.077 g/mL).</li>
	<li>、採血時に注射器に CLL 患者 (約 40 mL の血液患者あたり) からの血を引きます。50 mL の円錐管に血液を転送します。10 mL の PBS でシリンジを洗浄し、プールを (血の容積にチューブの数を調整) 50 mL チューブに血液 PBS サスペンション。</li>
	<li>新鮮な 50 mL の円錐管に密度勾配媒体の 15 mL を準備します。その後、レイヤー密度勾配媒体に慎重に血 PBS サスペンションの 35 mL。この目的のため平らな角度で管を保持し、ゆっくりピペット 50 mL の円錐管の下の壁に血 PBS サスペンション。50 mL の円錐管に血液 PBS 懸濁液のより多くが蓄積、直角まで管の角度を増加します。血液 PBS 懸濁液の量に応じてこの手順を繰り返します。</li>
	<li>(ブレーキ)、なし 20 分 560 × gで遠心分離を実行し、末梢血単核球 (PBMCs) を含んだ単核細胞の段階を抽出します。5 mL の血清ピペットと密度勾配分離の白の相間を収集し、新しい 50 mL の円錐管にそれを転送します。</li>
	<li>PBS と 360 x gで 5 分間遠心分離 50 mL に細胞懸濁液を入力します。吸引により上清を削除します。275 × gで 5 分間遠心分離でこの手順を繰り返します。その後、50 mL の円錐管に 5-10 mL の PBS で一人の患者の細胞をプールします。</li>
	<li>1.3 で説明したようのセルをカウントします。 注: 割合 CLL 細胞分離の PBMCs は、セルは、このプロシージャで直接使用する場合は B 細胞の分離が行われるが、例えば、磁気細胞分離 (MAC) 経由で異なります。B 細胞の分離はお勧めですが、CLL の細胞の割合 (フローサイトメトリーによって決まります) リンパ球の合計の 95% を超えている場合は省略できます。血の CLL 患者を固定して、製造元の指示に従って分離します。製造元の指示に従い CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色し、細胞をフローサイトメトリーで分析します。1 つの模範的な患者は、図 1CLL の細胞の割合は 89.03% に表示されます。したがって、この患者で実行される B 細胞分離がいます。生理学的な B 細胞の割合はごくわずか (例では 3.72%) です。</li>
	<li>10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム 50 mM β-メルカプトエタノール 200 x gで 5 分間と予め温めておいた (37 ° C) 添加 RPMI 1640 10 mL で細胞を洗浄し、吸引により、上清を除去します。</li>
	<li>2 x 107セル/ml 10 %fcs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、100 mM 非本質的なアミノ酸、1 mM ナトリウム ピルビン酸と 50 mM β-メルカプトエタノール (37 ° C) 塗りつぶし細胞懸濁液の 1 mL と 5 mL チューブに RPMI 1640 にセルを調整します。 注: β-メルカプトエタノールは酸化ストレスに対抗するため用いられます。</li>
	<li>32.4 nM PMA と 1 μ M イオノマイシンを追加することにより細胞を刺激します。オープン チューブのふた付きの 37 ° C および 5% の CO2で 16 時間細胞をインキュベーションして (汚染を避けるためには、空気を透過する封止フィルムが使用することができます)。 注: ストレスのレベルを減らすために細胞は刺激の 16 時間前にインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 1 時間休んだことができます。</li>
</ol>3. 固定、セル換散およびクロマチンせん断
注: 患者サンプルと Jurkat 細胞固定は、市販のチップ キット変更7を前述のように製造元の指示に従ってと分離します。固定は、層流フードの下で実行されます。
<ol><li>セルの固定のための 37% ホルムアルデヒド、1.25 M のグリシンの 1 mL と 1.5 mL チューブ、4 ml の 1x PBS の 5 mL チューブ、アイス ボックスの 1 mL と 1.5 mL チューブを準備します。</li>
	<li>1.5 または 2.9 の手順でそれぞれの培養時間の細胞の刺激後スピン 5 分 200 x gで 5 mL チューブ、5 mL チューブで 500 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>340 μ M ホルムアルデヒド (37% ホルムアルデヒドの 13.5 μ L) をセルに追加します。慎重に上下にピペッティングによる簡単な混合後懸濁液 2.5 分 (Jurkat 細胞) または室温で 5 分 (患者サンプル) を孵化させなさい。 注: 最適なせん断を保証する初代培養細胞用長期固定時間が必要です。</li>
	<li>固定を停止し、その後すぐに氷と 500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心する細胞を入れて別の 5 分間インキュベートする 125 mM グリシン (1.25 M のグリシンの 57 μ L) を追加します。吸引により上清を削除します。</li>
	<li>1 mL の 4 ° C で 5 分間 200 x gで氷冷 PBS で 2 回細胞を洗浄し、吸引により毎回清を除去します。 注: 固定後、プロトコルを一時停止することができます。固定セルは-80 ° C で保存する必要があります。テストして固定を介して次のプロトコルで使用する意図した抗体のエピトープはマスクされない場合、SDS ページのゲルの電気泳動、ウエスタンブロット解析の追加のサンプルを使用できます。これらの手順は、製造元の指示に従って蛋白質の 100 μ g で実行されます。すべての αNFAT2 抗体が 1: 1000、1:10000 の希釈で GAPDH 抗体の希釈に使用されます。適切と不適切な抗体 Jurkat 細胞から固定サンプルの模範的なイメージを図 2に示します。</li>
	<li>上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 1 で細胞ペレットを再懸濁します。シェーカーに氷の上、サンプルを配置し、揺れながら 10 分間インキュベートします。 注: 換散、前にセルすることができますが崩壊した 10 液体窒素で s。これは Jurkat 細胞のため便利ですが、プライマリ患者サンプルで避けるべきであります。崩壊、5 の 5 mL の管の場所特定のコンテナーに液体窒素の 5-10 mL の s。保護メガネ ・適切な安全手袋を着用します。</li>
	<li>その後、4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心分離、ピペットで上澄みを慎重に削除します。</li>
	<li>上下にピペットで 5 mL の市販の換散バッファー 2 のセルを均質化し、振りながら氷で 10 分間インキュベートします。4 ° C で 5 分間 500 x gでチューブを遠心し、ピペットで上澄みを慎重に削除します。</li>
	<li>500 μ L (Jurkat 細胞) の細胞ペレットを再懸濁しますまたはせん断の 140 μ L (患者サンプル) バッファー 1 プロテアーゼ阻害剤を含む 1 (5 μ L または 1.4 μ L、それぞれ) と氷で 10 分間混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>クロマチンはシャーリング、超音波発生装置のチューブ (空気の泡と繰り返しこの手順に応じてサンプル ボリュームのための生産を避けるため) にステップ 3.9 から細胞懸濁液の 140 μ L を転送します。超音波発生装置 200 500 bp の DNA のフラグメントを取得する 9.375 W の平均入射電力で 7 ° C とせん断 (セル線) 10 分または 7.5 分 (患者サンプル) の温度で焦点を当てた超にチューブを置きます。</li>
	<li>最後に、15700 x g小型遠心分離機で 4 ° C で 10 分間遠心し、新しい 1.5 mL チューブに上清を収集します。</li>
	<li>適切なフラグメントのサイズをテストするため、1.5% TBE agarose のゲルの電気泳動のゲルを介してせん断クロマチンの 20 μ L を分析します。良いと悪い品質の Jurkat 細胞からせん断クロマチンの模範的なイメージを図 3に示します。この時点で、プロトコルは潜在的休止できます。せん断クロマチンは-80 ° C で保存する必要があります。</li>
</ol>4. クロマチン免疫沈降
注: 変更7製造元の指示に従って市販チップ キットをクロマチン免疫沈降を行った。
<ol><li>Immunoprecipitations (70 μ L (Jurkat 細胞) またはせん断クロマチン プラス 1 つの抗体の 15 μ L (患者サンプル)) の数を計算し、タンパク質 A コーティング ビーズ 1.5 mL チューブの沈殿物ごとの 20 μ L を準備します。上下にピペッティングによる沈殿物ごとのバッファー内蔵の 1 × 1 の 40 μ L でビーズを洗う、ビーズ 1 分のマグネッ トラックの残りの部分し、ピペットで上澄みを除去できます。合計で 4 回のこの手順を実行します。最終的には、元のボリュームで 1 x チップ バッファー 1 でビーズを再懸濁します。</li>
	<li>自体免疫沈降にバインドされているターゲット シーケンス NFAT2 をキャプチャするのに αNFAT2 抗体 (7A6) 10 μ g を使用します。IgG コントロールとしてウサギ IgG 抗体 (DA1E) の 2.5 μ g を使用します。表 1に示されているように、新鮮な 1.5 mL チューブに反応を準備します。 注: このプロトコルの固定中にそのエピトープはマスクされません高親和性モノクローナル抗体を使用することが重要です。ポリクローナル抗体は、受信した結果を適切に解釈する著しく難しくバリエーションの追加レベルをご紹介します。</li>
	<li>6 rpm で回転ホイール上の 4 ° C で一晩手順 4.2 からの混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>次の日スピン チューブ 5、小型遠心分離機で 7,000 x gで s 1 分の磁気ラックにそれらをインキュベートし、清を吸引により除去します。1、2、3、4 種類の洗浄バッファーの各 1 回、ビーズを連続して洗ってください。</li>
	<li>350 μ L の洗浄バッファーのビードを再停止しなさいし、それら 6 rpm で回転ホイールに 4 ° C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>その後、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s。磁気ラックで 1 分間置いて、上澄みを除去し、次の洗浄バッファーを追加します。</li>
	<li>最後の洗浄工程後ピペットで上澄みを除去、溶出バッファー 1 の 100 μ L のビーズを取るし、6 rpm で回転ホイール上で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>チューブをすぐスピン (5 小型遠心分離機で 7000 x gで s) と 1 分の磁気ラックに置いて。</li>
	<li>上清を新しい 1.5 mL チューブに分注して転送し、溶出バッファー 2 の 4 μ L を追加します。</li>
	<li>99 μ L の溶出バッファー 2 溶出バッファー 1 と 4 μ L の入力コントロールを作成するミックスせん断クロマチンの 1 μ L (この設定では、患者 1 人あたりの 3 つの管: 1 つの入力コントロール、1 つの IgG コントロールおよび 1 つの αNFAT2 サンプル)。</li>
	<li>1.5 mL チューブ シェーカーで 1300 rpm 65 ° C で 4 時間のサンプルをインキュベートします。100% イソプロパノール、渦とスピンの 100 μ L を追加 5 サンプル小型遠心分離機で 7000 x gで s。</li>
	<li>徹底的にボルテックスによって利用可能な磁気ビーズを再懸濁します各サンプルにビーズの 10 μ L を追加し、6 rpm で回転ホイールに室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>、孵化後スピン 5 チューブ s 小 7000 x gで遠心し、磁気ラックで 1 分間置いて。吸引により上清を削除します。</li>
	<li>洗浄バッファー 1 の 100 μ L でビーズを再懸濁します。ミックス 6 rpm で回転ホイールに室温で 5 分間インキュベートしてチューブを反転します。</li>
	<li>スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間置いて、ピペットで上澄みを除去。洗浄バッファー 2 と 4.13 4.14 手順を繰り返します。</li>
	<li>その後、吸引洗浄バッファーを削除 55 μ L の溶出バッファーのビードを再停止しなさい、沈殿させた DNA を溶出する 6 rpm で回転している車輪に室温で 15 分間インキュベートします。最後に、スピン 5 チューブ小型遠心分離機で 7000 x gで s 磁気ラックで 1 分間配置し、新しい 1.5 mL チューブに上清を移します。 注: ここでプロトコル可能性があります一時停止できます。溶離された DNA、-20 ° C で保存します。</li>
</ol>5. NFAT CLL 細胞標的遺伝子を検出します。
<ol><li>表 2に示されているようにすべてのサンプルの重複で qRT PCR 反応を行います。 注: ターゲット遺伝子の検出のため量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) が行われる市販 qRT PCR ミックスを用いたリアルタイム PCR 装置。</li>
	<li>反応と RT-PCR の器に白 96 ウェル プレートを使用します。サイクリングの条件は次のとおりです: 95 ° C、30 s、[95 ° C、5 s、30 ° C、60 s] x 40 サイクル。 メモ: (原液または希釈 1:10、1: 100、1: 1000 ヌクレアーゼ フリー水で) 入力のシリアル希薄化は相対的な強化の計算に使用されます。Jurkat 細胞におけるIL-2は肯定的な制御32として使用されました。CD40L、B 細胞の NFAT2 の既知のターゲットは、CLL33,34NFAT2 の新規標的遺伝子の例として CLL 細胞の研究者が LCK肯定的な制御として使用されました。CD40L、 IL-2 、 LCKのプロモーター領域のためのプライマーは、特定の試薬や機器の表に示します。</li>
</ol>6. ノーマライゼーションとデータ分析
注: (IL-2、 CD40LやLCK) プロモーター領域の相対的な強化は、正規化の IgG コントロールを使用して計算されます。
<ol><li>まず、入力シリアル希釈、 IL-2、 CD40L qRT PCR のデータから評価版ソフトウェアを介してLCKプロモーター領域の Ct (しきい値サイクル) 値を決定します。</li>
	<li>入力のシリアル希釈によって濃度の標準曲線を定義します。この標準曲線とIL-2、CD40Lの濃度とすべてのサンプルの重複は、それぞれの研究者が LCKプロモーター領域を計算します。</li>
	<li>次に、重複の平均値を計算します。次に、参照として IgG 免疫沈降サンプルを設定します。1.0 としてこのサンプルの相対的な強化を定義し、この参照 (NFAT2 法) から他のサンプルと比較します。</li>
	<li>最後に、IgG 参照濃度によるサンプルの濃度で割って相対濃縮を計算します。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

成功したチップ試金の実行の重要なステップは、適切な抗体の選択とプロセス25をせん断クロマチンの最適化です。ΑNFAT2 抗体の選択は、このプロトコルの開発時に特に難しいことがわかった。市販のいくつかの αNFAT2 抗体と西部にしみが付くことの罰金これらの作品や他のアプリケーションの大半が、クローン 7A6 だったチップ7正常に使用できる唯一の抗体です。でもおそらく異なった製造業者からの同一 7A6 抗体チップでのパフォーマンスに関して有意差を出展しました。主要な挑戦は XChIP プロトコル25で使用される固定のプロセスによってターゲット蛋白質エピトープの潜在的な混乱です。
プロシージャをせん断クロマチンも XChIP で適切な結果を取得するため重要です。Agarose のゲルの電気泳動によって評価 200 500 bp のフラグメントのサイズは、この NFAT2 チップ議定書7に最適なこと...

CD5、CD23、CD19 の明確な蓄積を展示表現成熟 B 細胞1、慢性リンパ性白血病 (CLL) は、欧米の成人の最も一般的な白血病を表します。ほとんどの患者は、長年にわたり特定の治療を必要としない怠惰病コースを展示します。対照的に、何人かの患者は、免疫化学療法または他の目標とされた療法2,3で即時の治療的介入を必要とする急速な進行を示します。活性化 T 細胞 (NFAT) の核因子は様々 な発達を制御する転写因子と多数のセル型4,5,6活性化プロセスの家族です。我々 は最近怠惰病7患者の過剰発現と CLL 細胞における NFAT2 の憲法活性化を示した。ここでは、それはアネルギー7と呼ばれる B 細胞受容体刺激に応答していない状態を調節します。NFAT2 リンパ球特定の蛋白質のチロシンのキナーゼ (LCK) プロモーターに結合しを CLL 細胞特定のクロマチン免疫沈降分析におけるLCKの発現を調節することを示す (チップ) を開発、採用します。
チップは8遺伝子発現における転写因子の役割を調査するいくつかのテクニックのひとつです。遺伝子発現はしっかりと演出した非常に複雑な方法でいくつかの規制当局がこのプロセス9,10、11,12かけがえのない参加転写因子。多数種 (例えばの開発と分化)13,14,15、時空のコンテキストにおける遺伝子発現を調節する転写因子が同定されています。 16,17,18。転写因子が関与する複雑な制御機構でのエラーは、がん19,20を含む病理学的プロセスの様々 な可能性があります。したがって、転写因子とそのそれぞれのターゲットの同定は、新しい治療の道21,22を提供しています。チップ、ゲルシフトアッセイ (EMSA)、様々 な DNA プルダウン ・ アッセイ、レポーターの試金8,11,12,のようないくつかの方法がありますこの興味をそそられる分野を調査するには23,24。
特定の転写因子がゲノムの特定の地域と対話することを実証するには、生体内で、チップは理想的な手法25です。このため、DNA と細胞内タンパク質関連は紫外線照射またはホルムアルデヒド (架橋チップ、XChIP) を使用して架橋します。良い DNA とタンパク質の回収いわゆるネイティブ チップ (NChIP)26を取得するこの手順は省略されます。DNA 蛋白質の複合体はその後 200-500 の塩基対 (bp) および興味の転写調節因子に対する特異抗体を用いた細胞の残骸から沈澱の断片に sonication によって毛を刈る。関連付けられている DNA のフラグメントは精製し、PCR、分子クローニングおよび順序によって特徴付けられます。代替技術は、沈澱の DNA を分析するのに (チップ ・ オン ・ チップ) のマイクロ アレイや次世代シーケンス (チップ Seq) を使用します。
チップ ギルモア初と UV を使用時 1984 年に Lis クロスリンク DNA 共有結合する光し体内蛋白質をバインド細菌27。セル換散、細菌 RNA ポリメラーゼの免疫沈降の時に知られていた遺伝子の特定のプローブは体内分布と RNA ポリメラーゼの密度をマップする使用されました。メソッドは、熱ショック蛋白質遺伝子ショウジョウバエ28の真核生物の RNA ポリメラーゼ II の分布を分析する同じ捜査官によってその後使用されました。XChIP アッセイは、・ バーシャフ スキーと最初熱ショック蛋白質遺伝子29,30とヒストン H4 の関連を研究する架橋ホルムアルデヒドを使用した同僚によってさらに洗練されました。NChIP のアプローチは、自然そのままのエピトープによるより良い DNA および蛋白質の回復の利点を運ぶと、したがってより抗体の特異性は、最初 Hebbes と 1988年31同僚によって記述されていた。
DNA 蛋白質の相互作用を分析する他の技術と比較してチップの利点は、実際には、転写因子の実際の相互作用は調査生体内でないプローブすることができます、バッファーまたはゲルによって作成された人工の条件8、11,12を採用しました。次世代シーケンサーとチップを組み合わせて、複数のターゲットを同時に識別できます。
この技術の主要な制限は、そのまま生物25大規模の試金への限られた適用性です。差動遺伝子発現パターンの解析は、低レベルでのみまたは狭い時間帯にそれぞれの蛋白質を表現する場合、チップの技術を使用してやりがいのあることができます。別の可能性のある要因は、チップ11適して適切な抗体の可用性です。
定量的リアルタイム PCR (qRT PCR) による転写因子の標的遺伝子を生体内で識別するためここで示したチップ プロトコルを使用できます。具体的には、目標は、CLL の NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するためにだった。チップは、直接細胞 CLL 患者の自然な条件の下で別のターゲット遺伝子のプロモーター領域の NFAT2 結合を示す潜在性のために選ばれました。

<table><tbody><tr><td>1 X PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブシェーカー Themomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>同様の機器で代用可能</td></tr><tr><td>10X Bolt サンプル還元剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0009</td><td></td></tr><tr><td>20X Bolt MES SDS Running Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0002</td><td></td></tr><tr><td>37 % Formaldehyde p.a., ACS</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>4X ボルト LDS サンプル緩衝液</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体</td><td>アレクシス</td><td>1008505</td><td>クローン 7A6</td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>8032S</td><td>クローン D15F1</td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体 ChIP グレード</td><td>Abcam</td><td>ab2796</td><td>クローン 7A6</td></tr><tr><td>大型遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804R</td><td>同様の機器で代用可能</td></tr><tr><td>CD19-FITCマウス 抗ヒト</td><td>BDバイオサイエンス 555412</td><td></td><td>クローン HIB19</td></tr><tr><td>CD5-PEマウス アンチヒトCD5</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555353</td><td>クローン UCHT2</td></tr><tr><td>密度勾配培地 バイオコール(密度1,077 g / ml)</td><td>メルク</td><td>L 6115</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBindチューブ1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>FBSスーペリア</td><td>Merck</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>類似の装置で代用可能</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IB23001 iDeal ChIp-seq キット Histones</td><td>Diagenode</td><td>C01010059</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin カルシウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT ロバ抗ウサギ IgG (H + L)、0.5 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68023</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG (H + L)、0.1 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR オデッセイ 赤外線イメージングシステム</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>B446</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 マルチウェルプレート 96、ホワイト</td><td>ロシュ</td><td>4729692001</td><td>異なるリアルタイムPCR装置で他のプレートと交換可能</td></tr><tr><td>Lysing Solution OptiLyse B</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1400</td><td></td></tr><tr><td>M220 AFAグレードの水</td><td>Covaris</td><td>520101</td><td></td></tr><tr><td>M220集束超音波装置</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>磁気ラック、DynaMag-15 マグネット</td><td>Thermo Scientific</td><td>12301D</td><td>同様の機器で代用可能</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 100X</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td>451200</td><td>同様の機器</td></tr><tr><td>で代用可能microTUBE AFA ファイバー プリスリット スナップキャップ 6x16mm</td><td>コバリス</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー改良型計数室</td><td>Karl Hecht GmbH &&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Co KG</td><td>40442012</td><td>同様の機器で代用可能</td></tr><tr><td>NH4 ヘパリンモノベット</td><td>Sarstedt</td><td>02.1064</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&reg;ブロッキングバッファー (TBS) 500 mL</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 100X</td><td>メルク</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR グリーン FastMix</td><td>クォンタム バイオ</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>プライマー CD40L プロモーター領域フォワード</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3'</td></tr><tr><td>プライマー CD40L プロモーター領域逆</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3'</td></tr><tr><td>プライマー IL-2 プロモーター領域フォワード</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-TCCAAAGAGTCATCAGAAGG-3'</td></tr><tr><td>プライマー IL-2 プロモーター領域逆</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3'</td></tr><tr><td>プライマー LCK プロモーター領域フォワード</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3'</td></tr><tr><td>プライマー LCK プロモーター領域逆</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td>5'-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3'</td></tr><tr><td>ウサギ mAb IgG XP アイソタイプコントロール</td><td>細胞シグナル伝達</td><td># 3900S</td><td>クローン DA1E</td></tr><tr><td>リアルタイムPCR装置</td><td>Roche</td><td>LightCycler 480</td><td>同様の機器で代用可能</td></tr><tr><td>ローラーミキサー</td><td>フェニックス機器</td><td>RS-TR 5</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム、グルタMAX サプリメント</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>セーフティ-マルチフライニードル 21G</td><td>Sarstedt</td><td>851638235</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 染色済みタンパク質標準液</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Duomax 1030</td><td>Heidolph Instruments</td><td>543-32205-00</td><td>類似の機器で代用可能</td></tr><tr><td>小型 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Fresco 17</td><td>類似の機器で代用可能</td></tr><tr><td>Pyruvate ナトリウム</td><td>ThermoScientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td><td>Thermo Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline (TBS-10X)</td><td>Cell Signaling</td><td>#12498</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性リンパ性白血病の新規 nfat2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

慢性リンパ性白血病 (CLL) と悪性 B 細胞のクローンの拡張によって特徴付けられる欧米で最も一般的な白血病を表します。CLL の患者の大半は病気の怠惰なコースだけでなく、白血病細胞アネルギーの表現型を表示し、B 細胞受容体の外部刺激に応答を参照します。我々 は最近、CLL のアネルギーの重要な調節因子である転写因子 NFAT2 を示しています。さまざまな病気における転写因子の役割の解析における主要な課題は、その特定のターゲット遺伝子の id です。これは発病メカニズムと潜在的な治療上の介在の解明にとって重要なのです。クロマチン免疫沈降 (チップ) 蛋白質 DNA の相互作用を示すための古典的な手法は、したがって、哺乳類細胞における転写因子の標的遺伝子を識別するために使用できる、.ここでは、チップは、CLL 細胞における NFAT2 の直接の標的遺伝子としてLCKを識別するために使用されました。DNA と関連するタンパク質架橋ホルムアルデヒドを使用して、その後約 200-500 塩基対 (bp) の DNA 断片に超音波処理によるせん断。NFAT2 に関連付けられた架橋の DNA のフラグメントが、選択的に αNFAT2 抗体を用いた細胞の残骸から沈澱。浄化後関連付けられている DNA のフラグメントは量的なリアルタイム PCR (qRT PCR) によって検出されます。明らか濃縮 DNA シーケンスは、生体内でNFAT2 がターゲットにしているゲノムの領域を表しています。DNA と必要な抗体の選択の適切な剪断がこのメソッドの成功のアプリケーションのため特に重要です。このプロトコルは NFAT2 の標的遺伝子との直接相互作用のデモに最適です。その主要な制限は、そのまま生物における複数の転写因子のターゲット遺伝子を分析大規模な試金でチップを採用するが困難です。

図 1は、CD19 FITC と PE CD5 抗体で染色後実行 CLL 患者の模範的な流れフローサイトメトリー解析を示しています。図 1a CLL の患者の血液中の細胞の大半を表す、リンパ球のゲートを示しています。図 1 bは、CD19 の割合を示しています+/CD5+ CLL 細胞は、この例ではリンパ球の 89.03% を表します。CD19 の割合+/CD5- B 細胞はそれぞれ患者の 3.72%。
図 2では、期間ごとに SDS のページおよび西部のしみにより評価した固定 Jurkat 細胞抗体パフォーマンスの例を示します。...

慢性リンパ性白血病 (CLL) は西部の世界で最も一般的な白血病です。NFAT 転写因子は、開発と様々 な細胞タイプにおける活性化の重要なレギュレータです。NFAT2 の新規標的遺伝子を識別するために CLL 細胞のクロマチン免疫沈降 (チップ) の使用のためのプロトコルを紹介します。

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

この方法は、推定標的遺伝子の同定や病原性メカニズムなどの腫瘍学の分野における重要な情報を提供し、潜在的な治療介入を開発するのに役立ちます。この技術の主な利点は、NFAT2および他の転写因子と既知および新規の標的遺伝子との相互作用を検出できることである。一般的に、この方法に新しい個人は、最適な固定と剪断条件を確立することが困難であるため、苦労します。1.5ミリリットルのチューブを1ミリリットル37%ホルムアルデヒドで満たします。その後、別の1.5ミリリットルチューブに1.25モルグリシンの1ミリリットルを5ミリリットルのチューブに4ミリリットルのPBSで充填します。次に、細胞の刺激がテキストプロトコルに従って細胞を回転させ、500マイクロリットルのPBSで細胞を再懸濁し、氷で満たされた箱にチューブを入れた。細胞に37%ホルムアルデヒドの13.5マイクロリットルを加え、上下にピペットで混ぜます。その後、懸濁液を室温でインキュベートする。この後、57マイクロリットルの1.25モルグリシンを加えて固定を止める。そして、懸濁液を室温で5分間インキュベートする。インキュベーション期間の直後に細胞を氷の上に置き、細胞を摂氏4度で5分間5分間Gの500倍に遠心します。その後、上清を吸引します。次に、200倍Gの氷冷PBSを1ミリリットルで摂氏4度で5分間洗浄し、上清を取り除きます。細胞ペレットを5ミリリットルのリシスバッファー1つに再懸濁し、上下にピペット処理します。その後、氷の上にサンプルを置き、10分間振ってそれらをインキュベートします。この後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心する。その後、慎重に上清を除去するためにピペットを使用しています。5ミリリットルのリシスバッファー2とピペットを上下に均質化して混合します。その後、氷の上の細胞を揺れで10分間インキュベートします。インキュベーション期間の後、チューブを500倍Gで摂氏4度で5分間遠心し、上清を慎重に取り除きます。次に、1Xプロテアーゼ阻害剤を有する剪断緩衝液中の細胞ペレットを再懸濁する。その後、氷上の細胞懸濁液を10分間インキュベートする。気泡を形成しないように注意を払って、細胞懸濁液の140マイクロリットルを超音波管に移します。チューブを摂氏7度の焦点を合わせ、10~7分と1/2分間せん断します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。試料を摂氏4度で10分間10分間15、700倍Gで遠心分離し、新しいチューブに上清を集める。まず、1つの1.5ミリリットルチューブの各沈殿物に対して20マイクロリットルのタンパク質Aコーティングビーズを調製します。ビーズを磁気ラックに1分間落ち着かせ、上清を取り外します。次に、40マイクロリットルの1Xチップバッファーでビーズを10マイクロリットルで洗浄し、

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このプロトコルは、クロマチン免疫沈降（ChIP）はシグナル伝達経路によって誘導される転写を調節するクロマチンテンプレートに動的な変化を研究するために使用される方法について説明します。...

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

クロマチン剪断法:酵素消化法を用いてクロマチンフラグメントを生成する方法

このビデオでは、タンパク質-DNA相互作用を実証する古典的な手法であるクロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイのプロトコールについて説明しています。この技術は、ヒト慢性リンパ性白血病細胞の標的遺伝子を同定するために使用されます。...

クロマチン免疫沈降アッセイ:細胞内のタンパク質-DNA相互作用を研究する技術

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

&gt;jove_content&lt;ここで説明するプロトコールは、異なる条件下で培養された慢性リンパ性白血病(CLL)細胞のプリン代謝を測定するために、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を使用する簡単で再現性のある方法を表しています。...

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。...

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

低細胞クロマチン免疫沈降 (チップ) を実行することによってゲノム内でバインド オリゴデンドロ サイトのトランスクリプション要因 2 の (Olig2) 鋭く精製脳オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) を分析するように設計されたプロトコルを紹介します。、ライブラリの準備、高スループット シーケンスおよびバイオインフォマティクス...

PDGFRα + 低細胞クロマチン免疫沈降塩基配列解析法による細胞を精製した急性の転写因子 Olig2 ゲノム結合部位の特定

このプロトコルは、原発性慢性リンパ球性白血病細胞からの核および細胞質画分の最適化およびその後の効率的な生成を可能にする。これらのサンプルは、タンパク質の局在化と、細胞刺激および薬物治療時に核と細胞質区画の間で起こるタンパク質の密売の変化を決定するために使用されます。...

核/細胞質タンパク質の密売を監視する原発性慢性リンパ球性白血病細胞の細胞分画

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

学ぶクロマチン免疫沈降法を用いて慢性リンパ性白血病細胞におけるNFAT2の新規ターゲット遺伝子を識別する方法。転写因子とDNAの相互作用を検出し、発がんメカニズムの解明と治療戦略の開発に貢献します。

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

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