裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア
July 28th, 2018
高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。
この方法は、脂肪組織のさまざまな成分が組織全体でどのように相互作用するかなど、脂肪組織生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、脂肪組織に保存された余分な脂質を完全に除去し、その3次元構造を維持することです。この方法は、脂肪組織のこれらの三次元組織についての洞察を提供することができますが、一般的には、記憶腺やリンパ節など、脂質含有量の高い他の組織にも適用できます。
この分析法の視覚的なデモンストレーションは、脱脂化と透明化のステップに十分なインキュベーション時間が必要であり、その決定が難しい場合があるため、非常に重要です。鈍い末端の鉗子を使用して、灌流したばかりの動物モデルから目的の脂肪パッドを解剖することから始めます。組織をつまんだり絞ったり、解剖した組織を毛皮で汚染したりせずに、流行のパッド全体を慎重に取り外します。
ファットパッドを15ミリリットルの円錐管に約10ミリリットルの固定液に入れ、摂氏4度で一晩固定します。サンプルをPBSで洗浄した翌日、解剖顕微鏡でサンプルから破片を静かに取り除きます。サンプルに付着した髪の毛、糸くず、またはその他の破片は、イメージング中に影の原因となります。
清浄なサンプルを、氷冷した20%メタノールB1Nバッファーを含むポリプロピレンチューブに移します。サンプルの入ったチューブをオービタルシェーカーに水平に置き、100RPMに設定し、サンプルのサイズに応じて30分から1時間振とうします。サンプルがチューブ内を自由に動くことができることを確認します。
B1Nバッファーに40%、60%、80%のメタノールを混合し、続いて100%のメタノールを段階的に抽出して、サンプルの脱水を続けます。キャリーオーバー ソリューションを最小限に抑えます。脱水後、100%メタノール溶液を100%ジクロロメタンまたはDCMに交換して、サンプルを脱脂します。
表2に記載されているインキュベーション時間に従って、洗浄を2回繰り返します。サンプルは、2回目と3回目のDCM洗浄の終わりにチューブの底に沈む必要があります。そうでない場合は、インキュベーション時間を延長して、完全な脱脂を確保します。
脱脂後、表2に示す時間、100%メタノールで2回洗浄します。逆メタノールB1Nバッファーシリーズでサンプルを表2に示す時間再水和します。再水和後、サンプルをPTXWHバッファーで室温で2時間洗浄します。
これで、サンプルは免疫染色の準備ができているか、摂氏4度のPTXWHバッファーに最大1年間保存できます。まず、一次抗体をPTXWHバッファーで推奨濃度に希釈します。次に、希釈した抗体溶液を2万Gで10分間遠心分離し、抗体沈殿物または凝集物の導入を防ぎます。
メタノールおよびDCM処理に適した適切な一次抗体を選択することが重要です。新しい抗体は、小片の組織またはメタノール処理した組織切片でバリデーションする必要があります。脱脂したサンプルを一次抗体溶液とインキュベートし、サンプルのサイズに応じて3〜5日間インキュベー
トします。一次インキュベーション後、PTXWHバッファーを数回交換してサンプルを洗浄します。翌日、二次抗体をPTXWHバッファーで推奨濃度に希釈します。希釈した抗体溶液を前回と同様に遠心分離します。
サンプルを二次抗体溶液とインキュベートし、サンプルのサイズに応じて3〜5日間インキュベートします。再度、前回と同様に一連のインキュベーションステップでサンプルをPTXWHバッファーで洗浄します。翌日、サンプルを1XPBSで5分間、10分間、次に30分間洗浄します。
脂肪組織をアガロースに埋め込むことで、ライトシート顕微鏡用のサンプルマウントが容易になります。まず、1XPBSに1%アガロースを含む包埋溶液を調製します。包埋液を摂氏約40度に冷却して、サンプルが過度の熱にさらされないようにします。
液体の持ち越しを避けながら、洗浄した組織サンプルを型に入れ、希望の位置に並べます。次に、気泡を避けながら、包埋溶液をサンプル上に静かに注ぎます。気泡は、アガロースが固まる前に周辺に移動させる必要があります。
アガロースが完全に固まったら、サンプルを含むブロックを切り取ります。サンプルを水中の25%メタノールに移し、光から保護し、表2に示す時間振とうしながらインキュベートします。メタノールグラジエントを通じてサンプルの脱水を続けます。
サンプルを100%DCMで1時間、振とうしながらインキュベートします。DCM Washedサンプルは空気中で乾燥しやすいため、サンプルの鮮明度に影響を与え、画像がぼやけます。乾燥を防ぐために、サンプルを新鮮な溶液にすばやく移すことが重要です。
サンプルは、各DCM洗浄の終了時にチューブの底に沈む必要があります。サンプルをジベンジルエーテルまたはDBEで一晩インキュベートし、軽度の振とうをして屈折率のマッチングを実現します。サンプルは最終的に透明で目に見えない光になります。
翌日、新鮮なDBEでサンプルを2時間軽く振とうした後、サンプルを室温の暗所で保存するか、直接イメージングに進みます。DBEに対応したライトシート顕微鏡で試料をイメージングするには、アガロースに包埋された試料をイメージング中の動きを防ぐことができるホルダーに取り付けます。逆共焦点顕微鏡または2光子顕微鏡でサンプルをイメージングするには、アガロースに埋め込まれたサンプルをガラス底のチャンバースライドに置きます。
低倍率のライトシート顕微鏡を使用して後部皮下脂肪パッドをスキャンすると、脂肪細胞の小葉組織が示されています。脂肪細胞のサイズなどのより詳細な情報は、関心領域を高倍率で拡大することで明らかにすることができます。交感神経系のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼで染色された後部皮下脂肪パッドを、ライトシート蛍光顕微鏡で画像化しました。
TH染色では、矢印で示すように大きな神経束として現れる構造が明らかになりました。組織実質における血管神経支配と密集した末端剥離もTH染色によって明らかになります。血小板内皮細胞接着分子またはPCAM1(CD31とも呼ばれる)を血管標識マーカーとして使用すると、すべての脂肪細胞が組織全体の毛細血管と接触していることが観察され、脂肪の効率的な栄養素と酸素交換に対する高い需要を支えています。
その開発後、この技術は、脂肪生物学の分野の研究者が、初期の組織形態形成や脂肪細胞前駆細胞の運命マッピングなどの追加の問題を探求する道を開きました。また、ヒト脂肪組織の組織学の研究にも適用できます。パラホルムアルデヒド、メタノール、ジクロロメタン、ジベンジルエーテルの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、ドラフトや個人用保護具の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この研究は、脂肪組織生物学における脂肪組織内の異なる成分間の相互作用に関する重要な問題に取り組んでいます。Adipo-Clear技術を利用して、研究者は脂肪組織の高解像度での可視化を三次元構造を保持しながら実現し、その組織と相互作用の洞察を可能にします。
主要な研究構成要素
研究分野
- 脂肪組織生物学
- 組織クリアリング技術
- 生物学的組織の3Dイメージング
背景
- 脂肪組織は高い脂質含有量を含むため、可視化が困難です。
- 従来の組織学的方法はこのような組織には効果的ではありません。
- 組織の相互作用を理解するための堅牢なイメージング技術の必要性が重要です。
使用した方法
- Adipo-Clear組織クリアリング技術
- 正確なサンプル解剖のための新鮮な動物モデルの利用
- イメージングのためのライトシート顕微鏡
主な結果
- 構造的完全性を保持しながら脂肪組織を成功裏にクリアしました。
- 様々な一次抗体との互換性を示しました。
- 脂肪細胞とその相互作用の詳細な可視化を可能にしました。
結論
- この方法は脂肪組織構造の研究のための新しいアプローチを提供します。
- 他の高い脂質含有量組織の理解にも応用できる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Adipose tissue biology is central to metabolic disease research, yet lipid-rich composition limits comprehensive 3D visualization. Adipo-Clear enables whole-tissue imaging by removing lipids while preserving architecture, supporting mechanistic de-risking in target validation and phenotypic screening. This approach improves predictive confidence in adipose-resident cell interactions and stromal-vascular niche analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipose tissue architecture and cellular distribution for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides volumetric readouts that reduce sampling bias from traditional sectioning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, lipid-cleared tissue platforms compatible with immunostaining for biomarker co-localization.
- Operational Value: Supports reproducible sample preparation for high-content imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by visualizing adipocyte-immune, vascular, and nerve interactions in intact tissue.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of tissue remodeling in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
Adipo-Clear fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing 3D contextual data on adipose tissue composition and structure.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular organization and intercellular signaling in adipose tissue.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs for evaluating compound effects on tissue architecture.
- Analytics: Enables volumetric measurements of cell density, vessel density, and nerve innervation as decision-grade readouts.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via preserved tissue morphology and biomarker compatibility.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable clearing protocol for lipid-rich tissues across metabolic, immunology, and neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in adipose tissue studies through intact 3D visualization.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for multi-site reproducibility in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing off-target effects on adipose stroma or vasculature.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on adipose tissue engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, immunostaining, and clearing chemistry optimization.
- Depends on access to light sheet or compatible confocal microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of delipidation and refractive index matching steps across laboratories.
- Involves adaptation considerations for human versus murine adipose tissue due to lipid density differences.
- Involves practical limitations related to reagent hazards (DCM, DBE) requiring fume hood and PPE compliance.
