5-メチルシトシンと開発の 5-ヒドロキシメチルシトシンの免疫組織化学的検出と後マウス網膜

この方法は、有糸分裂後の網膜における網膜発達中のクロマチンの変化など、DNAメチル化分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、同様のアプローチで処理される5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン分布を持つすべてのマウス網膜組織の任意の切片に堅牢に使用できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、凍結組織学的調製物を使用すると貴重な組織組織と元の組織が失われる可能性があるため、組織の調製と染色のステップを学ぶのが難しいため、非常に重要です。

残りの手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の研究員であるPablo Diazです。この手順を開始するには、29ゲージの1/2インチの針を使用して、目の背側にある首を切られた安楽死マウスの目に穴を開けます。アイカップを取得するには、細かい眼科用ハサミで強膜の周りを切って角膜と水晶体を切除することにより、すぐに目を摘出します。

アイカップとE16全眼を4%パラホルムアルデヒドまたはPFA、1xPBS pH 8.0のPFAに室温で20分間固定します。1ミリリットルの1xPBSで室温で10分間2回洗います。アイカップと目全体を凍結保護するには、1xPBS pH 8.0で10%スクロースと室温で1時間インキュベー

次に、20%スクロースを1xPBSで1時間。そして最後に、摂氏4度で1xPBSに30%スクロースを一晩で入れます。翌日、アイカップとアイをクライオモールドに最適な切断温度コンパウンド(OCT)に埋め込みます。

次に、ドライアイスエタノールバスでスナップ冷凍し、摂氏80度に保ちます。クライオ切片を開始する前に、アイカップと目が埋め込まれた型を摂氏80度から取り外します。それらをクライオスタットホルダーに入れ、摂氏20度まで1時間平衡化させます。

摂氏20度のクライオスタットを使用して、視神経乳頭を介して側頭鼻軸に平行な厚さ12マイクロメートルの網膜断面を切断します。切片を顕微鏡スライドに取り付け、摂氏80度で保管します。免疫染色を開始するには、疎水性バリアペンを使用して、スライドに取り付けられた網膜切片を取り囲みます。

切片を200マイクロリットルの1xPBSで10分間1回洗浄します。切片を200マイクロリットルのPBSTで室温で10分間透過処理します。次に、200マイクロリットルの新しく作られた新しく滴定された2つの正常塩酸でそれらを1xPBSで37°Cで45分間変性させ、5mCの信号を最適化します。

変性後、網膜切片に0.1 Tris-HCl pH 8.3の100マイクロリットルを加え、室温で10分間インキュベートして中和します。次に、500マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。そして、室温で1時間、湿度チャンバー内で切片をインキュベートします。

ブロッキング溶液で1〜500に希釈した適切な抗体を切片に加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、切片を0.1%PBSTでそれぞれ10〜15分間3回洗浄します。DAPI溶液を含むブロッキング溶液で1〜1000に希釈した適切な二次抗体を室温で1時間加えます。

次に、スライドを1ミリリットルの0.1%PBSTでそれぞれ10分間3回洗浄します。最後の洗浄後、水性封入剤を添加します。カバースリップで覆います。

その後、共焦点顕微鏡法に進みます。E16でのレチナール免疫染色後、5mCシグナルは細胞核の色素中心で強く、全細胞核でははるかに低いレベルで存在しました。5hmC染色は細胞核にのみ見られ、彩中心には存在しませんでした。

P0網膜では、5mCシグナルと5hmCシグナルの両方が外側の神経芽細胞層と内側の神経芽細胞層に存在し、5mCシグナルは細胞核の染色中心と核末梢で強く、細胞核の染色中心間で弱かった。

P15網膜では、外側の核層において、細胞核の染色中心と核末梢に5mCのシグナルが検出されました。一方、5hmCシグナルは、色中心を除く全細胞核にありました。内核および神経節細胞層では、5mCシグナルは細胞核の彩中心で強く、全細胞核で弱かった。

一方、5hmCシグナルは、色中心を除く全細胞核に見られました。成体の桿体視細胞では、5mCの信号は色中心と核末梢に限定されていましたが、5hmCの信号は核末梢に限定されていました。この手順を試みる際には、HClの最適な曝露である30分で組織切片を治療することを覚えておくことが重要です。

曝露が少なかったり多かったりすると、最適な結果を再現することはできません。この手順に続いて、5-メチルシトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシンの測定における変化の定量化などの追加の質問に答えるために、高圧液体クロマトグラフィー、質量分析などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、神経発生の分野の研究者がクロマチンのエピジェネティックな変化を探求する道を開きました。

HClおよびPFAの取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、適切な廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。