Name: 効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶフィーダー細胞非依存法による角膜輪部上皮幹細胞の分化プロトコル。ヒト多能性幹細胞から臨床品質の細胞を効率的に生産し、角膜再生医療への応用を可能にする方法を解説します。

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調査は技術と革新のフィンランド (許可番号 297886) のアカデミー、フィンランド技術庁、フィンランドの資金配分機関の人間スペアパーツ プログラムによってサポートされたフィンランドの目およびティッシュ銀行財団とフィンランド文化財団。著者は、優秀なテクニカル サポートと細胞培養への貢献のために医学の技工 Outi Heikkilä エマ Vikstedt、ハンナ Pekkanen Outi Melin をありがとうございます。教授 Katriina アアルト Setälä は、蛍光イメージングのための機器を提供するため使用ことラインと BioMediTech イメージングの中核施設を提供するために認められています。

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このプロトコルの期待される結果は、約 3.5 週間以内 FF hPSC の単一細胞懸濁液から LESCs の成功で堅牢な世代です。表面の外胚葉29から角膜上皮が発展すると、プロトコルの最初のステップはこの系譜に向かって hPSCs のステアリングを目指しています。増殖因子 β (TGF-β) 拮抗薬、SB 505124 と bFGF の変換と短い 24 h 誘導、48 h 中胚葉性の BMP 4 キューへ表面の外胚葉細胞をプッシュする続いて外胚葉の分化を誘導するために使用されます。化学的に定義された分化培地とともにコル IV/LN-521 組み合わせ行列に次付着性の分化手順は、さらに LESCs への分化をガイドに使用されます。
原料 (FF hPSCs) の高品質差別化の成功にとって重要です。のみ FF hPSC 文化と合流点付近と画一的な表現型のほぼ 100% を使用してください。HPSCs 増殖と分化の利点30につながる核型異常に素因単一細胞継と、通常 hPSC karyotypi...

眼表面で透明な角膜、網膜に入力する光と目の屈折力の大半を提供できます。最も外側の層は、重層の角膜上皮は、輪部上皮幹細胞 (LESCs) によって継続的に再生成されます。LESCs はして角膜ジャンクション1,2輪部のニッチの基底層に存在します。LESCs は、同定推定マーカーの一連のより広範な分析が必要ですので、具体的かつユニークなマーカーを欠いています。上皮性転写因子 p63、特に N 末端切り捨てられた謄本 p63 のアルファのアイソ フォーム (ΔNp63α) は、関連する肯定的な LESC マーカー3,4として提案されています。LESCs の非対称分裂自己更新しますが、また centripetally と前方移行子孫を生成することができます。セルに向かって前進する角膜の表面に徐々 に自分の幹細胞性を失うし、最終的に末期患者が継続的に角膜の表面から失われる表層の扁平上皮細胞に区別するため。
重度の視覚障害につながることができますいずれかの角膜の層への損傷と角膜欠損を世界的な視野の損失の導く原因の 1 つ。輪部幹細胞 (LSCD) の欠乏症で、角膜が病気や conjunctivalization や角膜の混濁、ビジョン5,6のそれに続く損失につながる外傷によって破壊されました。自家および同種の輪部移植を用いた細胞補充療法は、LSCD4,7,8,9症例に対する治療戦略を提供しています。健康な眼に合併症のリスクを負う自家移植を収穫し、ドナー組織が不足します。ひと多能性幹細胞 (hPSCs)、ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、具体的には、臨床的に関連する細胞の種類、角膜上皮細胞を含む無制限のソースとして使用できます。したがって、hPSC から派生した LESCs (hPSC-LESCs) は、眼セル置換療法のための魅力的な新しい細胞ソースを表します。
伝統的に、未分化 hPSC 培養法とその微分のプロトコル LESCs に未定義のフィーダー細胞、動物血清、エアコンのメディア、または羊膜10、11,の使用に依存しています。12,13,14,15. 最近、細胞療法製品を安全への取り組みより標準化された、無料の異種文化および分化プロトコルの検索を求めています。その結果、画一的な hPSCs の長期培養定義、xeno 無料方法はいくつかは、市販16,17,18をされます。連続体、角膜上皮の運命に hPSCs を誘導する分子手掛かりに依存するプロトコルが最近されている分化紹介19,20,21,22、 23。まだこれらのプロトコルの多くは材料、または分化のための複雑な異種の成長因子カクテルを開始としてどちらかの未定義、フィーダー ベースの hPSCs を使用しました。
このプロトコルの目的は、信頼性の高い、最適化された、xeno を提供するために-hPSC のフィーダー フリー培養法と角膜 LESCs へのそれに続く分化。ラミニン 521 (LN-521) 行列 (具体的には不可欠な 8 フレックス) 定義、アルブミン無料 hPSC 中に多能性 hPSCs の単層培養により分化の均質な出発物質の迅速な生産ができます。その後、単純な 2 段階差別化戦略は懸濁液、LESCs に、付着性の分化に続く表面の外胚葉運命に向かって hPSCs をガイドします。> 65% が ΔNp63α を表現する細胞集団は 24 日以内に取得されます。Xeno とフィーダー フリー プロトコルは、セルの行の特定の最適化の必要はなく、いくつかの hPSC ライン (hESCs と hiPSCs の両方) のテストされています。週末無料メンテナンス、継、cryostoring、hPSC LESC フェノタイピングここで説明のためのプロトコルのための高品質 LESCs の大規模なバッチの生産を有効に臨床や研究の目的。

<table><tbody><tr><td>材料/試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS without Ca2+ and Mg2+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm cell culture</td><td>dish Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>接着性hPSC-LESC用の培養容器フォーマット分化</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>IFサンプル用培養容器フォーマット</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>IFサンプル用培養容器フォーマット</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート、超低付加</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>懸濁液中誘導用培養容器フォーマット培養</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗マウス Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>#A-21202</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ウサギ Ig Ig</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>#A-21206</td><td>IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗ヤギ Ig</td><td>Ig ThermoFisher Scientific</td> <td>#A-11057</td> IF <td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗マウス Ig</td><td>ThermoFisher Scientificの二次抗体</td><td>#A-10037</td><td>IF</td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF、ヒト)</td>に対する二次抗体(株)<td>ペプロテック</td><td>#AF-100-18B</td><td>アニマルフリー組換えヒトFGF-塩基性 (154 a.a.)</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>#554722</td><td>フローサイトメトリー用固定・透過化ソリューション</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>#554723</td><td>Washing buffer for flow cytometry</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>サイトケラチン12抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td> <td>#SC-17099</td><td>IF</td></tr><tr><td>サイトケラチン14抗体</td><td>R&D Systems</td> <td>#MAB3164</td><td>IF用一次抗体</td></tr><tr><td>サイトケラチン15抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td>#MS-1068-P</td><td>IF用一次抗体</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td> <td>#Cnt-30</td><td>接着性hPSC-LESC 分化用培地</td></tr><tr><td>コラーゲンIV型(ヒト)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#C5533</td><td>ヒトIV型プラセンタコラーゲン</td></tr><tr><td>CoolCell LX凍結容器</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure チューブ</td><td>Sarsted</td><td>#72.380</td><td>hPSC-LESC 凍結保存用 1.6 mL クライオチューブ</td></tr><tr><td>特定トリプシン阻害剤</td><td>Gibco</td> <td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 フレックス メディウム キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td> <td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン521</td>バイオ<td>ラミナ</td> <td>#Ln521</td><td>ヒト組換えラミニン521</td></tr><tr><td>&デルタ;NP63&アルファ;antibody</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>IF</td></tr><tr><td>OCT3/4</td>抗体用一次抗体 <td>R&D Systems</td> <td>#AF1759</td><td>一次抗体 for IF</td></tr><tr><td>p63&; antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td> <td>#ACI3066A</td><td>一次抗体 for IF</td></tr><tr><td>p63-&alpha;(D2K8X)XP Rabbit mAb (PE Conjugate)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#56687</td><td>p63-&alpha;フローサイトメトリー用PE標識抗体</td></tr><tr><td>PAX6抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#HPA030775</td><td>一次抗体 IF</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td> IF <td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>#P36931</td><td>DAPI Mountant for hardIF</td></tr><tr><td>PSC 凍結保存キット</td>用マウント <td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco'修正されたイーグル」中程度</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#T8787</td> IF VectaShield Vector Laboratories <td>用 透過化剤</td></tr><tr><td></td><td></td><td>#H-1200</td><td>I<F用液体埋込用DAPIマウンタント</td></tr> <tr><td>>名</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytocentrifuge, e.g. CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター、例: BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡、例:Olympus IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

角膜輪部上皮幹細胞 (LESCs) は、角膜上皮を継続的に更新し、角膜の恒常性と映像の明瞭さを維持します。ひと多能性幹細胞 (hPSC)-派生 LESCs 角膜細胞補充療法の有望な細胞供給源を提供します。未定義、異種文化および分化条件は研究結果の変動を引き起こすし、hPSC から派生した治療の臨床の翻訳を妨げます。このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞由来無細胞の条件の下で hPSC LESC 分化の再現性と効率的な方法を提供します。まず、組換えラミニン 521 (LN-521) と定義されている hPSC の中で画一的な hPSC の単層培養分化の高品質原料の生産のための基盤として提供しています。第二に、簡易 hPSC LESC 微分法は、わずか 24 日間で LESC 集団を生成します。このメソッドには、定義された角膜上皮分化培地での IV 型コラーゲン LN-521/組み合わせで付着性文化相が続く、小分子と懸濁液中 4 日表層外胚葉誘導が含まれています。Cryostoring と拡張分化さらにセル人口を浄化し、細胞療法製品の大量に細胞の銀行を有効にします。結果として得られる高品質の hPSC LESCs は、輪部幹細胞欠乏症 (LSCD) を治療するために角膜の表面再構成のための潜在的な新規治療戦略を提供します。

HPSC LESCs に hPSCs から
FF hPSCs cryostoring hPSC LESCs への分化誘導から全体のプロセスは、約 3.5 週間をかかります。その主な手順を強調表示微分法の概要は、図 1 aにされます。図 1 bは、プロトコルの異なるフェーズでセル人口の典型的な形態を示しています。発表データは、Regea08/017 hESC ラインと UTA.04607.WT によるライン、派生し、26,27,28を前述のようにフィンランド、タンペレ大学の特徴の両方が得られます。
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このプロトコルは、xeno ・ フィーダー細胞フリー培養条件下でのひと多能性幹細胞から角膜輪部上皮幹細胞の差別化のための単純な 2 段階法を紹介します。ここで示した細胞培養法は、医療の質細胞、角膜上皮細胞療法の使用に適用される低コスト大量生産を有効にします。

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

このプロトコルは、角膜四肢上皮幹細胞をヒト多能性幹細胞と区別するための定義済みのフィーダー細胞フリー法を導入した。四肢上皮幹細胞は、健康な眼における角膜上皮を更新する責任がある。これらの細胞への損傷は、四肢幹細胞欠乏症として知られている状態につながり、角膜の明瞭さの損失につながる。ここに示される細胞培養法は、将来の角膜細胞置換療法のための四肢上皮幹細胞の効率的な生産を可能にする。まず、テキストプロトコルに概説されているように、フィーダーフリーヒト多能性幹細胞培養を通過および維持する。分化の出発材料として、高品質のヒト多能性幹細胞のみを使用するようにしてください。胚の身体形成を誘発する準備ができたら、必要な材料および試薬のすべてを層流フードの室温まで温める。各ウェルに500マイクロリットルのゼノフリートリプシンEDTAを加えることによって、フリーヒト多能性幹細胞を送気に取り外します。5%CO2で摂氏37度でインキュベート。3分後、培養器から細胞を取り出し、細胞形態をチェックしてトリプシン除去に最適な相を決定します。細胞が切り上げられたが完全に剥離していない場合、細胞を注意深く観察して、キセノフリートライスピンEDTAを除去するのに最適な時間を決定します。最適なタイミングで、細胞からキセノフリートリプシンEDTAを除去する。定義されたトリプシン阻害剤を追加し、穏やかにピペットを使用して細胞を取り外します。50ミリリットルの遠心分離チューブに単一細胞懸濁液を回収します。300gで5分間遠心分離機。次いで、上清を取り除き、1ミリリットルの培養培地で細胞を再懸濁する。細胞を数えた後、5つのマイクロモルブレビスタチンを補った3ミリリットルの基底誘導培地で2〜300万個の細胞を低い付着6ウェルプレートの各ウェルに分配する。5%CO2で摂氏37度で一晩インキュベート。翌日、胚体の品質を顕微鏡で確認します。培地を取り除き、人間の基本的なグラスファイバー成長因子の1ミリリットル当たり10マイクロモルSB-505124および50ナノグラムを添加した基底誘導培地の3ミリリットルに置き換えます。5%CO2で摂氏37度でインキュベートを続けます。次の2日間、培地を取り出し、3ミリリットルの基底誘導培地に置き換え、骨形態形成タンパク質4の1ミリリットル当たり25ナノグラムを補う。次に、前の条件を使用してインキュベーションを継続する。4日目には、ラミニン-521の平方センチメートルあたり0.5マイクログラム、およびヒト胎盤コラーゲン4型の平方センチメートル当たり5マイクログラムの混合物を調製し、カルシウム2とマグネシウム2イオンを含むDPBSで希釈した。この混合物を使用して、1皿当たり5ミリリットルの総コーティング量で付着分化するために100ミリメートルの組織培養皿をコーティングする。プレートを密封し、一晩で摂氏4度で保管します。5日目には、必要な材料と試薬をすべてラミナーフローフードで室温まで温めます。この後、コーティング溶液を取り除き、各皿に10ミリリットルの事前温め分化培地を加えます。ピペットを使用して、胚体を2〜3個の組織培養皿全体で単一プレートウェルから移す。次に、各培養皿を穏やかに振って胚体を均等に分配する。次の2週間半から3週間は5%CO2で37°Cの付着培養で細胞を維持し、培地を週に3回10ミリリットルの新鮮な分化培地に置き換えることを確認します。位相コントラスト顕微鏡を使用して、細胞の正しい上皮形態の出現を定期的にチェックします。まず、凍結保存媒体を除いて、必要なすべての材料および試薬をラミナーフローフードで室温に予め温めます。次に、ヒト多能性幹細胞由来の四肢上皮幹細胞を、キノフリートリプシンEDTAを添加し、5%CO2で摂氏37度でインキュベートすることにより、単一細胞懸濁液に切断する。5分後、培養器から細胞を取り出し、細胞形態をチェックしてトリプシン除去に最適な相を決定します。細胞が切り上げられたが完全に剥離していない場合、細胞を注意深く観察して、キセノフリートリプシンEDTAを除去するのに最適な時間を決定します。最適なタイミングで、細胞からキセノフリートリプシンEDTAを取り出し、先に述べたように細胞を取り外します。細胞を数えた後、5分間300gで遠心分離する。培地を吸引し、予冷排他凍結保存培地で細胞を再懸濁する。ピペットを使用して、各凍結管が凍結保存培地の1ミリリットルに500,000から100万個の細胞を含むように、単一細胞懸濁液をクライオチューブに移します。チューブを凍結容器に入れます。5分以内に、一晩保管するためにマイナス80°Cの冷凍庫に移します。翌日、長期保存のためにチューブを液体窒素に移します。細胞を解凍する前に、必要なすべての皿とプレートウェルに、人間の胎盤コラーゲンタイプ4タイプ5マイクログラム、LM-521の平方センチメートルあたり0.5マイクログラムの混合物でコーティングし、必要なすべての材料と試薬を層状流れフードの室温に事前に温めます。次に、食器およびプレートウェルからコーティング溶液を取り出し、適切な量の事前温め分化培地を加えます。15ミリリットルの円錐管に事前に温めた分化培地を加えます。細胞を室温まで素早く解凍します。解凍したら、すぐに細胞懸濁液を円錐状遠心分離管に移す。300gで5分間遠心分離機。培地を吸引し、分化培地中の細胞ペレットを再懸濁して、凍結保存培地を除去する。40,000〜50,000個の細胞/平方センチメートルの密度で分化培地で予めコーティングされた皿に細胞をプレートします。細胞を摂氏37度の5%CO2に維持し、分化培地を週3回置き換えます。ラミニン-521では、未分化の高品質フィーダーフリーヒト多能性幹細胞は、最初に鋭いエッジを持つ別個のコロニーを形成し、合流時に均質な単層に結合する。基礎誘導培地で培養し、24時間の5つの微小臼歯ブレビスタチンを補い、典型的には様々な大きさのタイトで規則的な胚体の懸濁液を生じ、胚性体形態は懸濁液中の表面外胚誘導の間に劇的に変化してはならないが、発生体がコラーゲン型4型にメッキされた後すぐに現れるのが見られる。分化の21〜25日以内に、細胞は、多角形形態を有する、上皮細胞に典型的であるコンフルエント同種層を形成する。細胞は、生存率と形態が解凍後によく保存されるため、後で使用するために凍結保存され得る。分化の24日目に、大部分の細胞は、ペアドボックスタンパク質、PAX6、眼の発達の主要な調節因子、ならびにp63アルファ、広く認められたLESCマーカーを発現した。デルタNp63は、ほとんどのp63α陽性細胞で共発現し、最も角膜特異的なデルタNp63α陽性細胞表現型を確認する。他のマーカーは部分的に発現しているが、他のマーカーはこの時点では検出できないが、単一の四肢上皮前駆体に向かって分化が進んでいるが、成熟した角膜上皮細胞への末端分化はまだ起こっていない。平均して、各未分化フィーダー遊離ヒト多能性幹細胞は、25日目までに0.7細胞を生成する。少なくとも65%δ Np63アルファ陽性細胞集団は24日目までに期待できる。凍結保存は細胞集団をさらに浄化する。全体的に、ここで紹介する方法は比較的単純ですが、成功への重要なポイントがいくつかあります。出発材料の高品質は、一般的に穏やかで流暢な細胞培養技術と同様に不可欠です。このプロトコルは、臨床応用のためだけでなく、様々な研究目的のために、四肢上皮幹細胞を製造するための堅牢な手段を提供します。また、この方法は、網膜色素上皮細胞の分化のために容易に修飾することができる。

efficient-scalable-directed-differentiation-clinically-compatible

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。...

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効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

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