蛋白質ベースのゲルを特徴付けるため力クランプ ワイヤ

この技術の主な利点は、タンパク質ハイドロゲルサンプルに制御力プロトコルを適用するための比例積分微分システムであるPIDを利用し、少量のサンプルを利用することです。フォースクランプのプロトコルは、データの簡単な解釈を可能にしますが、少量でしか入手できない生産が困難なタンパク質を扱う場合は、少量が重要です。この技術の意味は、タンパク質のダウンフォールディング、リフォールディング遷移特性を使用して、耐久性のある弾力性を持つ新しい生体認証材料の開発と特性評価にまで及びます。

この手法は、数十億のタンパク質分子を一度に測定し、生体組織特有の混雑した環境をシミュレートすることで、組織力学や生体材料力学の疑問に答えることができます。この手順は、テキストプロトコルに記載されている試薬溶液の調製から開始します。タンパク質ベースのハイドロゲルを合成するには、まず23ゲージの針を1ミリリットルのシリンジにプレスプランジャーで固定します。

次に、かみそりの刃を使用して10センチメートルのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブを切断します。針とシリンジをPTFEチューブの一方の端に取り付けます。チューブのもう一方の端をシラン溶液に挿入し、シリンジプランジャーを引っ込めてチューブを満たします。

チューブを約30分間放置します。次に、シラン溶液を取り出し、圧縮空気でチューブを乾燥させます。次に、タンパク質溶液をAPSおよび塩化トリス(ビピリジン)ルテニウム(II)クロリドと1.5ミリリットルチューブ内で一定の体積比で混合します。

光活性溶液が完全に混合されるまでボルテックスします。次に、混合物を最高速度で遠心分離して、溶液から気泡を取り除きます。ハイドロゲル光活性混合物をテフロンチューブに装填すると気泡が形成され、サンプルが損傷する可能性があります。

気泡の形成を防ぐために、ローディングプロセス中はテフロンチューブの端を溶液混合物に保ち、シリンジプランジャーをゆっくりと引っ込めます。処理したPTFEチューブの開放端を光活性混合物に挿入し、シリンジプランジャーを引っ込めて溶液をチューブに引き込みます。次に、負荷のかかったチューブを100ワットの水銀ランプから約10センチ離して置き、加熱を防ぎ、室温で最大30分間そのままにします。

チューブを針から取り外し、かみそりの刃でヒドロゲルの端の近くのチューブの端を切ります。次に、鈍い24ゲージの針を使用して、ヒドロゲルをトリス溶液に押し出します。押し出し中または気泡によって形成される可能性のある欠陥がないかゲルを目視検査し、欠陥のあるゲルを廃棄します。

機器制御プログラムを開始し、ボイスコイルモーターをオンにします。次に、コイルの位置を範囲の終わりに向かって値に設定します。フックをZ方向に変位させ、X方向の曲げで位置合わせします。

次に、X方向のマイクロメータネジの値を記録します。次に、縫合糸の端に緩いダブルオーバーハンドノットを結び、ループの直径が約4ミリメートルになるようにします。次に、ループをストランドから切断します。

これを繰り返して 2 番目のループを形成します。次に、力センサーに接続されたフックに2つのループを配置します。実験チャンバーにTrisバッファーを充填し、医療用ピンセットを使用してハイドロゲルサンプルを充填チャンバーに移します。

ボイスコイルとフォースセンサーのフックを溶液の表面の近くに配置して、フックをXYZポジショニングマニピュレーターと全方向に合わせます。医療用ピンセットを使用して、タンパク質ハイドロゲルサンプルの両側をボイスコイルと力センサーに接続されたフックに吊るします。典型的なエラーは、接着プロセス中にハイドロゲルサンプルの周りの縫合糸ループが過度に締め付けられることです。

これにより、ハイドロゲルサンプルのノッチ形成と切断が発生する可能性があります。縫合糸ループの両端を医療用ピンセットで保持し、同時に引っ張ることにより、ボイスコイルフック上のハイドロゲルサンプルの周りの1つの縫合糸ループを慎重に締めます。フォースセンサーに接続されたループに対してこの手順を繰り返します。

各フックの曲がり部にある縫合糸ループを締めて、滑りを防ぎます。これらのベンドを参照点として使用して、フック間のゼロ分離を見つけます。医療用ハサミを使用して縫合糸の余分な長さをカットします。

取り付けたハイドロゲルをZマニピュレータでZ軸に沿って実験チャンバーに向かって移動させ、実験溶液にハイドロゲルを浸します。マニピュレーターを使用して、ゲルがストレスを受けないようにYZでハイドロゲルサンプルを位置合わせします。力センサーをゼロにし、ゲルが力を受け始めるまでXマイクロメーターステージを使用して2つのフックを分離します。

これが発生した場合は、マイクロメータネジをX方向に少し戻します。ボイスコイルモーターとセンサーの両方のマニピュレーターの位置を記録します。次に、これらの値と以前に測定された値との差を使用して、実験開始時のテザリングフック間の正確な分離を計算します。

所望のローディング速度でフォースを増加させることによりフォースランプサイクルを実行するには、開始および最終フォース値、ならびにプロトコルの持続時間(反転Vとして表示される)を入力し、その後、タンパク質ドメインが次のサイクルの前に再フォールディングすることを可能にするために約200秒間一定の低いフォースが続く。30秒間低い力を加えることにより、コンスタントフォースプロトコルを実行します。次に、定義された時間、力を一定の力に増やし、その後、300秒以上同じ低い値に力を消光して、タンパク質ドメインが再活性化し、ゲルの弾力性が回復するのを待ちます。

最後に、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析を実行します。各測定は、スラックカーブから始まります。2本のラインをフィッティングすることで、センサーにかかるゼロ力と真のゲル長が決定されます。

真のゲル長は、はめあい部とマイクロメータネジの位置の交点から計算されます。フォースクランプレオメトリーシステムは、2つの異なるタイプのプロトコルを適用できます。フォースランプモードでは、ハイドロゲルサンプルは、逆力モード V.In 定力モードに似た時間とともに力変化プロトコルを経験し、加えられた応力はステップ状のパターンで変化します。

測定中、PIDシステムは、フォースプロトコルから事前に定義された設定値に従うようにコイルの位置を変更することにより、ヒドロゲルの伸びを調整します。次に、ひずみは、測定された伸長を真のゲル長で割ることによって計算されます。応力は、加えられた力をハイドロゲルサンプルの断面積に割ることによって決定されます。

フォース ランプ トレースは、応力対ひずみとして最もよく表されます。ヤング率は、荷重フェーズ中の傾きメジャーから計算できます。ヒステリシスは、タンパク質のアンフォールディングとリフォールディングから来るエネルギー散逸を与えます。

一定の力のトレースは、時間の関数として最もよく表されます。ひずみの変化は、二重指数をフィッティングすることにより、アンフォールディングとリフォールディングの速度を測定するために使用できます。この手順を試みる際には、タンパク質を添加する前にチューブからシランを乾燥させること、タンパク質ミックスを遠心分離して気泡を除去すること、チューブ内にタンパク質ミックスを注入した後に気泡を確認すること、チューブから押し出した後に機械的に損傷したハイドロゲルを廃棄することを覚えておくことが重要です。

一般に、この方法に不慣れな人は、ヒドロゲルサンプルに損傷を与えることなく、外科用縫合糸を使用してゲルをフックに取り付けるのに最初は苦労するでしょう。チューブからゲルを押し出すと、ハイドロゲルも損傷する可能性があります。この方法により、少量のハイドロゲルサンプルにコンスタントフォースプロトコールを適用することができます。

これらの実験により、弾性挙動と粘弾性挙動のデカップリングが可能になり、バルクアプローチでのタンパク質のアンフォールディングとフォールディングメカニズムの研究が可能になります。この技術の開発後、材料科学の分野の研究者は、組織工学の足場、薬物送達システム、3Dプリンティング用の生物学的インクとして機能する優れた可能性を秘めた人工ポリタンパク質ベースのハイドロゲルなどの新しいソフトバイオマテリアルを探求することができます。この方法は、タンパク質ベースのハイドロゲルのメカニズムに関する洞察を提供するだけでなく、筋線維の等尺性応答や皮膚などの組織の弾力性の測定など、他のシステムにも適用できます。