Name: 植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶバキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞での植物分泌タンパク質の大量生産法。低コストで再組み換えタンパク質を結晶化用に調製し、構造生物学研究に貢献します。

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この作品は、Guozhou の徐のノースカロライナ州立大学から新しい学部スタートアップ資金によって支えられました。

注: 分泌植物蛋白発現および結晶化のための変更された表現のベクトルとバキュロ昆虫細胞システムが使用されます。
1. 植物タンパク質分泌発現の GP67 シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更
<ol><li>5' BglII 切断サイト13GP67 の分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 a) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。 注: BglII と病原が消化されるので同じ接着端で起因した DNA、焼なまし結紮順番 BglII と病原の両方のサイトは、劈開はシーケンスに変異が、一直線に並べられたベクトルが消化の DNA のフラグメントを縛ることができます。BglII または病原14。</li>
	<li>BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。<ol>
<li>摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。5-10 コロニーをピックアップし、220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地 2 mL の各植民地の成長します。</li>
	<li>DNA の miniprep キット17各プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。</li>
	<li>PCR 増幅シロイヌナズナTDR 遺伝子フラグメントのエンコーディング残 30-642 合成 TDR 遺伝子から構築 (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC、逆プライマー: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。<ol>
<li>PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、や 72 ° c 1 分、72 ° C、5 分で最後の拡張と拡張機能のための 55 の ° C で熱処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。</li>
</ol>2. 植物タンパク質分泌発現の昆虫ヘモリン シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更
<ol><li>5' BglII 切断サイト13、昆虫ヘモリン分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 b) とマルチ クローニング サイトを含む DNA 断片を合成します。</li>
	<li>BglII と XhoI、DNA のダイジェスト 4 μ g と病原と XhoI14発現ベクター DNA の 4 μ g。各制限酵素の 10 単位を混ぜて濃度反応バッファー (50 mM 酢酸カリウム、20 mM トリス酢酸、酢酸マグネシウム 10 mM、100 μ g/mL BSA、pH 7.9 25 ° C で) x 1 の DNA と 4 h の 37 ° C で混合物を孵化させなさい。<ol>
<li>摘出した DNA のフラグメントそして DNA ゲル抽出キット15によって一直線に並べられたベクトル DNA を浄化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファー (50 mM 10 mM DTT、1 mM ATP、10 mM MgCl2トリス塩酸 pH 7.5 25 ° c) および T4 DNA の 5 単位 × 1 を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物にリガーゼ。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>結紮の混合物の 5 μ L を DH5α 有能なセルの 100 μ L に変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート上のコロニーを選択します。5-10 コロニーをピックアップし、2 mL LB 培 220 rpm、16 h のため振動のインキュベーターで 37 ° C でアンピシリンの 100 μ g/mL の各植民地の成長します。</li>
	<li>DNA の miniprep キット17プラスミド DNA を抽出し、AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG のプライマーと DNA の配列によってクローンを確認します。</li>
	<li>合成 PRK3 遺伝子構造から残 20-237 をエンコーディング花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3) PCR 増幅シロイヌナズナ遺伝子フラグメント (プライマーを転送: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC、逆プライマー: シージーシー GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTGTGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC)。30 サイクル 0.5 mM dNTP ミックス、0.2 μ M プライマー、テンプレート DNA の 0.1 μ g、0.4 mM MgCl2、および DNA ポリメラーゼの反応 1式を含む DNA ポリメラーゼ反応バッファー内の DNA を増幅します。<ol>
<li>PCR のサイクルのステップの設定初期変性 95 ° C、30 s、および 30 の変性 95 ° c、30 サイクル s、30 s、および 30 のための 72 ° C で拡張子 55 ° C で熱処理各サイクルと 72 ° C、5 分で最後の拡張内にある s。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR のフラグメントと制限の endonuclease 酵素ノッティと病原を変更されたベクトルを消化します。一直線に並べられたベクトルを持つ遺伝子のフラグメントを縛る。400 で一直線に並べられたベクトル DNA のミックス 100 ng ng の消化の DNA のフラグメント T4 DNA リガーゼ反応バッファーと T4 DNA リガーゼの 5 単位を含む 10 μ L ライゲーション反応混合物に。16 h 16 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>DH5α 有能なセルの標準的な変形のプロトコル、次の 100 μ L に結紮混合物の 5 μ L を変換し、アンピシリン LB 寒天培地プレート16結果植民地を選択します。DNA の配列によって正しいクローンを確認します。</li>
</ol>3. 生産とバキュロ ウイルスの増幅を構築組換え蛋白質発現カセットをかくまっています。
<ol><li>バキュロ ウイルス発現システム1のプロトコルに従う DH10Bac 有能なセルの 40 μ L を変換する構成体プラスミドの使用 100 ng。48 h の 37 ° C で変換プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>各変換プレートから 2 つの白いコロニーをピックアップし、各植民地を 50 μ g/mL カナマイシン、7 μ g/mL ゲンタマイシン 10 μ G/ml テトラサイクリンを含む LB 培地 2 mL に接種します。抽出し、DNA バクミドを確認するバキュロ ウイルス式システム1のプロトコルに従ってください。分注、それぞれ 20 μ L と 2 つの管で各 DNA、-20 ° C でチューブを格納 注: 次の手順では、無菌操作を必要があります。</li>
	<li>6 ウェル プレートで 80% 合流に 27 ° C で 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質 Sf9 細胞の単分子膜を成長します。組織培養プレートのカバーされている領域の割合に基づく合流点の割合を推定します。</li>
	<li>2 滅菌 1.5 mL 遠心チューブに以下のソリューションを準備します。<ol>
<li>チューブ 1: 各 transfection のため抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に DNA バクミドの 20 μ L を希釈します。管の側をフリックで希釈を優しく混ぜます。</li>
		<li>チューブ 2: 各 transfection のため、抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 100 μ L に脂質のトランスフェクション試薬の 8 μ L を希釈します。6 x の上下にピペッティングによる希釈を徹底的にミックスします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 つのソリューションを組み合わせて、3 x、上下にゆっくりとピペッティングで優しくそれらをミックスし、室温で 20 分間インキュベートするそれら。</li>
	<li>Sf9 単層の細胞 2 倍の抗生物質がない培 Sf9 細胞培養液 3 mL で洗う。各 transfection のため脂質 DNA の混合物を含む各チューブに培 Sf9 細胞培養液抗生物質なしの 0.8 mL を追加します。軽く 3 倍のアップとダウンゆっくりとピペッティングによるチューブの内容をミックスします。プレートから洗浄メディアを吸引し、トランスフェクション混合物サンプルを重ねてください。</li>
	<li>トランスフェクション混合物の付加の後で 27 ° C で 5 h 用 transfected プレートを孵化させなさい。トランスフェクション メディアを交換して 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む、完全な Sf9 細胞培養培地に抗生物質ペニシリン-ストレプトマイシン。4 d のための 27 ° c transfected プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>収穫し、組換えバキュロ ウイルスを増幅します。<ol>
<li>インキュベーションの 4 d の後滅菌 15 mL の円錐管に感染したプレート上澄みを収集します。1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分で上清をスピンします。ペレットを破棄し、クリーン チューブに上清をデカント 4 ° C で 1 年間保存します。 注: これは P0 ウイルスです。それは時間の長い期間のため避けようと-80 ° C で保存されますをすることができます。</li>
		<li>各遺伝子組換えウイルスを増幅するには、150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を 80% 合流に成長します。プレートからメディアを吸引 P0 ウイルスの 2 mL をプレートに付着性のセルに追加して、27 ° C の定温器で 1 時間版を孵化させなさい。細胞と培地を混合するプレート 15 分毎をロックします。<ol>
<li>25 ml 10 %fbs と 100 μ g/mL (またはリンパ) を含む完全な恵みのメディアのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質。P1 通路ウイルスを入手して 27 ° C の定温器で 3 d 版を孵化させなさい。</li>
		</ol>
</li>
		<li>滅菌 50 mL の円錐管と 1010 x g細胞の残骸を削除する 5 分でスピンで感染したプレート上澄みを収集します。クリーン チューブに上清をデカント、4 ° C で 1 年間保存できます。 注: P1 ウイルスは、時間の長い期間のため、避けようと-80 ° C で保存されますを使用できます。</li>
		<li>P1 から P2 通路にウイルスを増幅するには、90% 合流する 150 mm 板上 Sf9 細胞の単分子膜を成長、プレートのメディアを吸引、プレート、P1 ウイルスの 2 mL を追加、27 ° C の定温器で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>3.8.2 と 3.8.3 ウイルスの P2 と P3 の通路を取得する手順を繰り返します。2 ヶ月以上 P3 ウイルスを格納しないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 蛋白質の表現、NiNTA、および結晶化で精製
<ol><li>1 L 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で 2 × 106の密度を 100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の Hi5 昆虫細胞の文化します。570 x gで 5 分で細胞をスピン、上清をデカント、20 ml たて作り出された P3 ウイルスの細胞を再懸濁します、1 h. そっと振って 15 分毎 × 1 細胞を再懸濁しますスピン ボトルの部屋の温度でそれを維持します。</li>
	<li>100 μ g/mL (またはリンパ) 文化メディア ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質の 1 L にセルを転送、1,010 × gで 5 分で細胞を 72 h スピンの 27 ° C インキュベーター シェーカーで 100 rpm で細胞の培養上清を収集します。</li>
	<li>使用 pH インジケーター ストリップ 0.1 M HCl または 0.1 M NaOH を追加して 8.0 上澄みの pH を調整し、最終的な濃度、ph 8.0、100 mM の NaCl、Tris バッファーは 20 mM と 5 mM のイミダゾールを含む結合バッファーを追加します。表現彼タグ組換えタンパク質の推定収量に基づく NiNTA 樹脂 (10-40 mL)、一定の量を追加します。<ol>
<li>樹脂 1 h. 洗浄のための 4 ° C で低速で電磁攪拌のソリューションをミックスし、次の標準的な NiNTA の浄化のプロトコル18バインドされた蛋白質を溶離する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イオン交換精製タンパク質とゲル濾過クロマトグラフィーとして同質なサンプルを生成するための他の蛋白質の浄化方法。 注: TDR 外部ドメイン、20 mM トリス、pH 8、100 mM の NaCl はゲルろ過バッファーとして使用されました。PRK3 外部ドメイン、20 mM ビス-トリス、pH 6、100 mM の NaCl は最寄りのゲルろ過バッファーとして使用されました。</li>
</ol>

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サイズおよび生物学的システムで現在の蛋白質の何千もの安定性の多様性を考えると、それは実証研究のためはしばしば特定の蛋白質の表現のために選択される異種発現システムを決定する室します。大腸菌発現系は多くの場合19をスケール アップする細菌は、低コストの文化、メディアおよび相対的な容易さの短いライフ サイクルのための蛋白質の表現のための最初の選択肢です。大腸菌を使用して、しかし、60 kDa 以上のサイズを持つ大規模な真核生物タンパク質の発現システムはしばしば封入体または集計20不溶性タンパク質の結果します。それらの困難なタンパク質発現および他から分泌されるタンパク質では、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系は大腸菌よりも有利かもしれません。特に分泌の真核生物の蛋白質を表現するとき、この変更されたバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系は好ましい選択にかもしれない。
分泌される分泌される植物蛋白質を含む真核生物のタンパク質には多くタンパク質折り畳みと分...

特に x 線結晶構造解析のための生化学的および生物物理学的特性の均質な組換えタンパク質の大量生産ができるように研究所が不可欠です。大腸菌酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞などそれらの間など定評の異種発現系が多い、バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、ほとんどの一つです。構造的に折り畳まれた大型真核生物に向けた組換えタンパク質タンパク質結晶化1の大量に生産するのに技術が使用されます。
バキュロ ウイルス発現系の表現のベクトルは、強い由来ポリヘドリン遺伝子または遺伝子組換え細胞内タンパク質2,3の高収率を生成する P10 プロモーターを含む設計されています。組換えバキュロ ウイルスをするためには、興味の遺伝子が違いによるとマルチ nucleopolyhedroviral ゲノム由来ポリヘドリン遺伝子 (polh) の軌跡を含む昆虫ベクトルに複製されます。結果としての構築は、シーケンシャルなその正しいオープンリーディング フレーム (ORF) が確認されます。正しいコンストラクト トランスフェクションのプロセスを介して宿主昆虫細胞に導入します。興味の遺伝子は相同組換えによってウイルスのゲノムに挿入されます。このイベントは、組換えウイルスのゲノムは、組み換え体を生成するが、複製が芽生えてウイルス粒子1の生産の結果します。
昆虫細胞発現系において最も一般的に使用される、Sf9 と高の 5 (Hi5) セルです。Sf9 細胞 Sf21、ハスモンヨトウの frugiperdaの蛹卵巣細胞由来のクローンの分離、Hi5 細胞クローン分離親Trichoplusia ni卵巣細胞ライン TN 3684,5から派生しました。Sf9 細胞の共同 transfections、ウイルスの増幅、およびプラクの試金を実施する Hi5 細胞が通常より高い組換えタンパク質6量を生成する選択されています。変異ウイルスを生成する傾向があるため、Hi5 細胞を世代ウイルス後代の増幅に適してない注目に値するです。従来は、25-30 ° C の温度範囲は、昆虫細胞の培養に適していると見なされます。ただし、27 ~ 28 ° C が昆虫の細胞の成長および感染症7,8の最適な温度であることが報告されています。
分泌されるタンパク質の高発現遺伝子の前強い信号系列の導入が必要です。効率的に信号シーケンスは翻訳された組換えタンパク質を小胞体タンパク質の分泌と適切な折り畳みと安定化3に必要な翻訳後修飾に導きます。信号ペプチド配列、バキュロ ウイルスを包む蛋白質 GP64/67、ミツバチ メリチンなどなどバキュロ ウイルスによる発現システム3分泌遺伝子組換え蛋白質の発現を促進するのに選択されています。GP67 のシグナルペプチドの導入は、ターゲット遺伝子9の内因性信号のペプチッドを使用と比較して、分泌の組換え蛋白質の表現の収量を改善するために示されています。ヘモリン細菌感染10時に誘起される巨大な絹蛾Hyalophora 丹野、皓三の体液蛋白質であります。誘導式の比較的高レベルによるバキュロ ウイルス昆虫細胞における組換えタンパク質の分泌発現を仲介する遺伝子の信号のペプチッド シーケンスを使用できます。
シロイヌナズナ管状要素分化抑制因子受容体 (TDR) と両方蛋白質11,12 の植物ロイシン豊富な繰り返し受容体様キナーゼ (LRR RLK) の家族に属している花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3).構造と植物受容体タンパク質も他の植物の分泌タンパク質の構造および生化学的解析が容易になるのこのファミリーの機能を研究するためにバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系に変更されています蛋白質の品質と生産の収量を向上させます。TDR と PRK3 の両方の細胞外ドメインは、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系の 2 つの変更された表現のベクトルを使用して正常に表現されています。TDR と PRK3 蛋白質の両方の細胞外ドメイン、結晶化されています。この記事は、GP67 またはプロモーターと複数クローン間ヘモリン信号シーケンスのいずれかを組み込むことによって式と 2 つの変更されたバキュロ ウイルス発現ベクターで遺伝子組換え分泌植物タンパク質の大量精製を報告します。サイト。

<table><tbody><tr><td>インキュベーターシェーカー</td><td>VWR</td><td>Model Excella E25</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>VWR</td><td>Model 2005</td><td>27 oC</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>BECKMAN</td><td>モデル J-6</td><td>スイングバケットローター付き</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td> DNAサーマルサイクラー<td></td></tr><tr><td></td><td>のPCR増幅用BIO-RAD</td><td>モデル C1000 タッチ</td> DNA<td></td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカー</td>のPCR増幅用 <td>ニューブランズウィック科学</td><td>モデルI 24</td><td>成長するバセリア培養用</td></tr><tr><td>顧客DNA合成</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td> <td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R3136S</td><td>制限 エンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>BglII</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0144S</td><td>制限 エンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Restriction Endonuclease</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA ligation</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>DNA purification from Agorase gel</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>細菌培養からのプラスミドDNA精製</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15510-019</td><td>DNAゲル電気フェロシス</td></tr><tr><td>用 MAX 効率 DH5&α; 競合細胞</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>DNAライゲーション混合物の形質転換用</td></tr><tr><td>Lennox L LB Broth</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>細菌培養物を作るため</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11593-019</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15160-054</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>64-75-5</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15710-064</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>MAX 効率 DH10Bac コンピテントセル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10361-012</td><td>バクミド DNA</td></tr><tr><td>S.O.C. ミディアム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15544-034</td><td>DNA 形質転換用</td></tr><tr><td>CellFECTIN II 試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10362-101</td><td>昆虫細胞トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 発現システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10359-016</td><td>バキュロウイルス昆虫細胞発現キット</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15519-028</td><td>バクミドDNA</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15529-019</td><td>バクミドDNA</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエンティフィック 10360014</td><td>バキュロリルス発現ベクター</td></tr><tr><td>Sf9細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11496015</td><td>Sf9単層細胞</td></tr><tr><td>Hi5細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>B85502</td><td>ハイファイブ昆虫細胞</td></tr><tr><td>グレースS 昆虫培地、無添加</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 細胞トランスフェクション最小培地</td></tr><tr><td>Grace'Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Scientific 11605102</td><td>Sf9単層細胞培養完全培地</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10902104</td><td>Sf9懸濁細胞培養培地(FBS</td></tr><tr><td>Express Five Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5細胞培養培地</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td>100 ml (10,000 I.U./ml)</td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>FBS認証</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-772-1B</td><td>平底</td></tr><tr><td>150 mmプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエンティフィック 353025</td><td>100/ケース</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>500 tubes/bag</td></tr><tr><td>15 ml 円錐スクリューキャップ遠心分離管</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>25 tubes/bag</td></tr><tr><td>50 ml 円錐スクリューキャップ遠心分離管</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>25 tubes/bag</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA 樹脂</td></tr><tr><td>pH インジケーターストリップ</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

真核生物遺伝子組換え分泌蛋白質構造および生化学的研究を表現する科学者のための挑戦だった。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、いくつかの翻訳後修飾遺伝子組換えの真核生物の分泌蛋白質を表現するために使用するシステムの一つです。分泌タンパク質は、タンパク質の糖鎖修飾、ジスルフィド結合の形成および他のポスト翻訳の修正の分泌経路を介してルーティングされる必要があります。既存昆虫細胞分泌植物タンパク質発現を高めるためには、バキュロ ウイルス発現ベクターは GP67 のいずれかの追加またはプロモーターと多重クローニング サイトの間ヘモリン信号のペプチッド シーケンスによって変更されます。この新設計変更されたベクトル システムは、シロイヌナズナの可溶性組換え分泌植物受容体タンパク質の高収率に成功しました。X 線結晶学的研究 2 発現植物タンパク質、シロイヌナズナ TDR と PRK3 の細胞膜受容体の細胞外ドメインの結晶化しました。変更されたベクトル システムは動物の王国と同様に組換え分泌蛋白質の表現の可能性のある使用できる改良されたツールです。

図 1に示すように、GP67 またはヘモリン信号シーケンスのいずれかの標的遺伝子の組み込み信号シーケンスに置き換えると分泌された蛋白質を表現する 2 つの変更された pFastBac1 バキュロ ウイルス発現ベクターが使用されました。ウイルス GP67 と昆虫ヘモリン遺伝子は、細胞の高い分泌発現レベルに実証されています。これらの 2 つの信号シーケンスのいずれかが付いている融合蛋白質が分泌発現レベルが大幅に向上する予定です。同一複数クローニング サイト (MCS) は、これらの 2 つの変更されたベクトルで設計されました。東北大学からのサイトは、東北大学からの他の多くの制限のサイトで現在最も一般的な 6 ヌクレオチド シーケンスではなく 8 塩基を持っているので意図的に最も 5' 側 mcs に置かれました。など、東北大学からのサイトは以下の制限の消化力と使用制限の他のサイトと比較してより現実的なほとんどのターゲット遺伝子のクローニングを行う他のほとんどの制限サイトよりターゲット遺伝子の存在です。ノッティと下位制...

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

It has been a challenge for scientists to express recombinant secretory eukaryotic proteins for structural and biochemical studies. The ...

この方法は、結晶学やクライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造決定など、分泌タンパク質の生化学および構造生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質構造決定のための比較的低コストで、大量の組換え分泌タンパク質を生成することです。まず、テキストプロトコルに概説されているように、マルチクローニング部位における目的の分泌シグナル配列である5つの主要なBglII切断部位を含むDNA断片を合成する。次に、4マイクログラムのDNAをBglIIとX1で、4マイクログラムの発現ベクターDNAをBamH1とX1で消化します。各制限酵素10ユニットをDNAと1X濃度反応バッファーで混合します。摂氏37度で4時間インキュベートします。1X T4 DNAリガーゼ反応バッファーと5ユニットのT4 DNAリガーゼを含むライゲーション反応混合物10マイクロリットルを、新しい1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに加えます。次に、100ナノグラムの直鎖状ベクターDNAと400ナノグラムの消化されたDNA断片を添加します。摂氏16度で16時間インキュベートします。5マイクロリットルのライゲーション混合物を100マイクロリットルのDH5アルファコンピテントセルに変換し、テキストプロトコルに概説されているように、アンピシリンLB寒天プレート上で得られたコロニーを選択します。5〜10個のコロニーを選び、それぞれを1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを含む2ミリリットルのLB培地に移します。これらのコロニーを振盪インキュベーターで摂氏37度、220rpmで16時間成長させます。この後、DNA Miniprepキットを使用して各プラスミドDNAを抽出します。テキストプロトコルに概説されているように、フォワードシーケンシングプライマーを使用したDNAシーケンシングによりクローンを確認します。100ナノグラムのコンストラクトプラスミドを使用して、テキストプロトコルに概説されているように、40マイクロリットルのDH10Bacコンピテントセルを形質転換します。形質転換プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。各形質転換プレートから2つの白いコロニーをピックアップし、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンを含む2ミリリットルのLB培地で各コロニーに接種します。テキストプロトコルに概説されているように、bacmid DNAを抽出して検証します。各DNAを2本のチューブに分注し、20マイクロリットルを各チューブに移します。次に、続行する準備ができるまで、チューブを摂氏マイナス20度で保管します。後続のすべてのステップは、無菌的に実行する必要があります。6ウェルプレートで、10%ウシ胎児血清と100μg/ミリリットルのペニシリン-ストレプト

modifying-baculovirus-expression-vectors-to-produce-secreted-plant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。...

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

植物は現在の式のパラダイムより、スケーラブルでコスト効率の高い、安全である商業規模で医薬品タンパク質の生産のための新たなシステムを提供しています。本研究では、我々を含む、標的遺伝子を導入するための簡単​​で便利な、まだスケーラブルなアプローチを報告...

組換えタンパク質の高レベルの一過性発現のための植物の効率的なアグロ

ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。...

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。...

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Kindlinsは、インテグリンを介して細胞間接着の基本であるが、それらの研究では、細菌宿主において組換えそれらを発現で遭遇する困難によって妨げられてきた。ここでは、バキュロウイルス感染昆虫細胞での効率的な生産のための方法を記載している。...

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

Nonlytic昆虫細胞発現系は、生産、細胞輸送/ローカリゼーション、および組換えタンパク質機能解析のために十分に活用されています。ここでは、市販の鱗翅目の細胞株で発現ベクターおよびそれに続く一過性のタンパク質発現を生成する方法について説明します。細胞内蛍光マーカータンパク質とタバココナジラミのアクアポリンの共局在も提示されています。...

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

このプロトコルを記述する外国蛋白質を表現するまたは潜在的な外国蛋白質とその切り捨てられたのアミノ酸の抗アポトーシス活性を評価に使用することができます熱衝撃によるタンパク質発現システム (pDHsp/V5-彼/sf9...

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ...

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2...

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生化学的、生物物理学的、および構造研究に使用されるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼ(PRMT)の発現スクリーニングおよび生産のための堅牢なプラットフォームです。物質のミリグラム量は、真核生物発現プラットフォームを必要とする関心のあるPRMTおよび他のタンパク質の大部分のために製造することができる。...

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

学ぶバキュロウイルス発現ベクターを用いた昆虫細胞での植物分泌タンパク質の大量生産法。低コストで再組み換えタンパク質を結晶化用に調製し、構造生物学研究に貢献します。

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロウイルス発現ベクターを変更します。

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