植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。
August 20th, 2018
ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。
この方法は、結晶学やクライオ電子顕微鏡によるタンパク質の構造決定など、分泌タンパク質の生化学および構造生物学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質構造決定のための比較的低コストで、大量の組換え分泌タンパク質を生成することです。まず、テキストプロトコルに概説されているように、マルチクローニング部位における目的の分泌シグナル配列である5つの主要なBglII切断部位を含むDNA断片を合成する。
次に、4マイクログラムのDNAをBglIIとX1で、4マイクログラムの発現ベクターDNAをBamH1とX1で消化します。各制限酵素10ユニットをDNAと1X濃度反応バッファーで混合します。摂氏37度で4時間インキュベートします。1X T4 DNAリガーゼ反応バッファーと5ユニットのT4 DNAリガーゼを含むライゲーション反応混合物10マイクロリットルを、新しい1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに加えます。
次に、100ナノグラムの直鎖状ベクターDNAと400ナノグラムの消化されたDNA断片を添加します。摂氏16度で16時間インキュベートします。5マイクロリットルのライゲーション混合物を100マイクロリットルのDH5アルファコンピテントセルに変換し、テキストプロトコルに概説されているように、アンピシリンLB寒天プレート上で得られたコロニーを選択します。
5〜10個のコロニーを選び、それぞれを1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを含む2ミリリットルのLB培地に移します。これらのコロニーを振盪インキュベーターで摂氏37度、220rpmで16時間成長させます。この後、DNA Miniprepキットを使用して各プラスミドDNAを抽出します。
テキストプロトコルに概説されているように、フォワードシーケンシングプライマーを使用したDNAシーケンシングによりクローンを確認します。100ナノグラムのコンストラクトプラスミドを使用して、テキストプロトコルに概説されているように、40マイクロリットルのDH10Bacコンピテントセルを形質転換します。形質転換プレートを摂氏37度で48時間インキュベートします。
各形質転換プレートから2つの白いコロニーをピックアップし、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンを含む2ミリリットルのLB培地で各コロニーに接種します。テキストプロトコルに概説されているように、bacmid DNAを抽出して検証します。各DNAを2本のチューブに分注し、20マイクロリットルを各チューブに移します。
次に、続行する準備ができるまで、チューブを摂氏マイナス20度で保管します。後続のすべてのステップは、無菌的に実行する必要があります。6ウェルプレートで、10%ウシ胎児血清と100μg/ミリリットルのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質を摂氏27度から80%のコンフルエンスで培養培地でSf9細胞の単層を増殖させます。
トランスフェクションごとに、抗生物質を含まない100マイクロリットルの未添加Sf9細胞培養培地を1.5ミリリットルの遠心チューブに加えます。20マイクロリットルのバクミドDNAを各チューブに希釈し、静かにフリックして混合します。次に、トランスフェクションごとに1.5ミリリットルのチューブに、抗生物質を含まない100マイクロリットルの無添加のSf9細胞培養培地を追加します。
各チューブに8マイクロリットルの脂質トランスフェクション試薬を希釈し、6回ピペッティングして完全に混合します。これら2つの溶液を組み合わせ、ゆっくりと3回ピペッティングして混合します。室温で20〜40分間インキュベートします。
各洗浄ごとに、抗生物質を含まない3ミリリットルの無添加Sf9培地を使用して、培養プレートの各ウェルを2回洗浄します。次に、抗生物質を含まない0.8ミリリットルの未添加のSf9細胞培養培地を、脂質DNA混合物を含む各チューブに加えます。ゆっくりと3回上下に動かして混ぜます。
プレートから洗浄媒体を吸引し、サンプルをトランスフェクション混合物で覆います。トランスフェクションしたプレートを摂氏27度で5時間インキュベートします。この後、トランスフェクション培地を、10%FBSと100マイクログラム/ミリリットルのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質を含む完全なSf9細胞培養培地と交換します。
摂氏27度で4日間インキュベートします。次に、上清を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に集めます。1,010倍gで5分間回転させ、細胞の破片を取り除きます。
ペレットを捨て、上清をきれいなチューブにデカントします。摂氏4度で最大1年間、または使用する準備ができるまで保管してください。各組換えウイルスを増幅するには、まず150mmプレート上でSf9細胞の単層を増殖させ、80%のコンフルエンスにします。
次に、培地を吸引し、各ウェルに2ミリリットルのP0ウイルスを加えます。摂氏27度のインキュベーターで1時間インキュベートし、15分ごとにプレートを揺さぶって培地を細胞と混合します。次に、10%FBSを含む25ミリリットルの完全なGrace's Mediaと、1ミリリットルあたり100マイクログラムのペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質を追加します。.
プレートを摂氏27度のインキュベーターで3日間インキュベートし、P1通過ウイルスを取得します。この後、上清を滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に集めます。1,010倍gで5分間回転させ、細胞の破片を取り除きます。
上清をきれいなチューブにデカントし、摂氏4度で最大1年間、または使用する準備ができるまで保管します。ウイルスをP1からP2への継代で増幅するには、まず150ミリメートルプレート上でSf9細胞の単層を増殖させ、90%のコンフルエンスにします。目的の合流点に達したら、培地を吸引します。
2ミリリットルのP1ウイルスを加え、摂氏27度のインキュベーターで1時間インキュベートします。増幅手順を繰り返して、ウイルスのP2およびP3継代を取得します。本研究では、2つの改変されたpFastBac1バキュロウイルス発現ベクターを用いて、標的遺伝子の内因性シグナル配列を置き換えることにより、分泌されたタンパク質をgp67またはヘモリンシグナル配列のいずれかで発現させます。
PBEC gp67は、a-thal-leano受容体TDRの細胞外ドメインを発現するためにうまく利用されています。一方、PBEC1ヘモリンは、細胞外ドメインPRK3を発現するためにうまく利用されています。次に、精製したタンパク質を5ミリグラム/ミリリットルに濃縮し、結晶化スクリーニングを行います。
各タンパク質の予備結晶を生じさせる条件は、20μメートルを超えるタンパク質結晶が観察されるまで最適化されます。この手順を試行する際、サイズ排除クロマトグラフィー、多角度光散乱、および組換えタンパク質の非凝集状態に関するその他のアッセイによってタンパク質の品質を調べることを覚えておくことが重要です。銀染色によってもタンパク質の純度を確認することを忘れないでください。
この手順に続いて、X線結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡などの他の方法を実行して、生成されたタンパク質の3次元構造などの追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、構造生物学の分野の研究者が植物や哺乳類から分泌されたタンパク質の構造的、機能的、生化学的特性を探求するための道を開きました。アガロースゲル上のDNAバンドを視覚化するために紫外線を使用することは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、UV保護、フェイスシールド、アイゴーグル、白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
また、緩衝液を作る際には、強酸や強塩基の取り扱いに注意してください。
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概要
この記事では、結晶化のための植物分泌タンパク質を大量生産するための昆虫細胞とバキュロウイルスタンパク質発現システムの使用プロトコルを紹介します。この方法は、低コストで組換えタンパク質を生産することに有利で、構造生物学研究を促進します。
主要な研究要素
科学の分野
- 生化学
- 構造生物学
- タンパク質結晶化
背景
- タンパク質発現のための昆虫細胞の利用。
- バキュロウイルス発現ベクターの改変。
- 構造研究における分泌タンパク質の重要性。
- 大規模タンパク質生産のための方法のコスト効率。
研究の目的
- 植物分泌タンパク質を生産するためのプロトコルを提供すること。
- 結晶学とクライオ電子顕微鏡法を通じたタンパク質構造決定を促進すること。
- 分泌タンパク質機能の理解を深めること。
使用された方法
- 特定の切断部位を持つDNAフラグメントの合成。
- 制限酵素によるDNAの消化。
- 発現ベクターへのDNAフラグメントの結合。
- 昆虫細胞への培養と形質転換。
主な結果
- 組換え分泌タンパク質の成功した生産。
- 低コストのタンパク質発現の証明。
- 構造分析に適した高収率の可能性。
- 研究環境での再現性を確認したプロトコル。
結論
- 昆虫細胞とバキュロウイルスシステムはタンパク質生産に効果的です。
- この方法は構造生物学の進歩を支えます。
- 将来の応用によりタンパク質機能の理解が深まる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method addresses the bottleneck in producing recombinant secretory proteins for structural and biochemical studies by enabling high-yield secretion in insect cells. It supports target validation and assay development by providing soluble, post-translationally modified plant receptor proteins suitable for crystallization and functional screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by generating biophysically characterized extracellular domains of membrane receptors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through production of secreted plant receptor extracellular domains for structural analysis.
- Operational Value: Supports biological de-risking by yielding soluble, glycosylated proteins with correct disulfide bond formation.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking via crystallization-ready proteins that enable atomic-level target insight.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated secreted protein systems for downstream binding and inhibition assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protein outputs essential for assay standardization and screening readiness.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation through homogeneous, monodisperse protein preparations verified by SEC-MALS and silver stain.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems using Arabidopsis thaliana receptor extracellular domains as models for kinase and signaling pathway studies.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical work by producing proteins amenable to biophysical characterization.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative quality control of recombinant protein batches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural elucidation and enabling lead identification via structure-guided design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing secreted receptor domains for functional and structural studies.
- Screening: Delivers assay-ready proteins with high solubility and homogeneity, enabling reliable screening campaign execution.
- Analytics: Generates quantitative biophysical readouts (SEC-MALS, silver stain) that inform protein quality and batch consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through production of structurally characterized extracellular domains relevant to signaling pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for secreted protein production across multiple targets using modular signal peptide swapping.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering structurally validated secreted proteins with correct post-translational modifications.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized baculovirus amplification and secretion into supernatant.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage failure risk via early structural and functional target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through high-yield, crystallizable protein production supporting structural genomics initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, baculovirus handling, and insect cell culture techniques.
- Dependent on restriction enzyme digestion, ligation, and transfection infrastructure for recombinant virus generation.
- Necessitates standardization across teams for signal peptide selection (GP67 vs. hemolin) and bacmid verification protocols.
- Involves adaptation considerations when extending the system to mammalian or other plant secretory proteins beyond Arabidopsis thaliana targets.
- Limited by the need for aseptic technique during transfection and virus amplification steps to prevent contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Modification of a Baculovirus Expression Vector with either the GP67 Signal Peptideor the Insect Hemolin Signal Peptidefor Plant Protein Secretion Expression
2:24
Production and Amplification of Baculovirus Constructs Harboring the Recombinant Protein Expression Cassette
7:02
Results: Analysis of Plant Proteins Secreted by Insect Cells
7:57
Conclusion
