切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法
2018年9月5日
ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。
この方法は、パラフィン切片などの形態学的分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、切断と折り畳み手順を最高潮にし、従来の方法で必要とされる転写プロセスを回避することです。まず、事前に製造されたすべての部品をドラフトに集めます。
ここに示すように、クロロホルムを使用して7枚のアクリル板を組み合わせます。最終製品は、セクションチャネルとウォーターバスを備えたタンクになります。アクリル板番号2の穴を通して管状電気発熱体を取り付けます。
電気ドリルを使用して、アクリル板の7番に小さな穴を開け、デジタルサーモスタットをタンクに取り付けて、タンクの黒い点で示されている目的の水面のレベルから少なくとも1センチメートル下にあることを確認します。巻を調整するtag機器の電源を入れる前に、24ボルト未満になるようにします。切片廃棄物トレイをミクロトームから取り外します。
次に、中性シリコーンシーラントを使用して、セクションチャネルをミクロトームブレードホルダーにリンクし、ブレードの上部にシーラントが入らないようにします。セットアップを一晩乾燥させて、クロロホルムと中性シリコーンシーラントが固まる時間を与えます。翌日、ブレードをブレードホルダーに取り付けます。
ウォーターバスに水を加え、水面がブレードの上部にちょうど触れていることを確認します。従来のパラフィン切片化を行った後、装置の電源を入れると、改善されたパラフィン切片化が開始されます。温度検出スイッチを使用してヒーターを開きます。
目標温度を38°Cから40°Cの間で1時間設定し、お湯を温めます。パラフィン包埋によって取得されたパラフィンブロックをナイフで改変します。次に、ブロックをミクロトームのカセットクランプに置き、ロックします。
厚い部分をカットして、サンプルにすばやく近づきます。サンプルに適したセクションの厚さに調整します。ハンドホイールを回すと、セクションが自動的にセクションチャネルとバスにロードされます。
次に、ゆっくりと均一な切断ストロークで試験片を切片にします。セクションを浴槽に導き、一列に浮かぶようにします。ヘッド部がチャンバー壁に密着している場合は、ブラシガイドを使用して浮かせてください。
切片がウォーターバスで完全に展開されたら、ピンセットを使用していくつかを分離し、顕微鏡スライドでそれらを拾います。スライドを摂氏42度に設定されたオーブンに移し、一晩乾かします。その後、スライドは分析の準備が整うまで無期限に室温で保存できます。
分析の準備ができたら、ヘマトキシリン-エオシン染色を使用して、改良された方法を使用して切片を評価します。この研究では、改良された方法を使用して、成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、胚性マウス脳、およびゼブラフィッシュの眼のパラフィン切片を調製します。ここに示すように、新しい方法は切片の損失を回避し、検査された組織の各タイプにおける無傷の切片の割合を増加させます。
全シリーズ切片化を行う場合、この方法により、試験したすべてのサンプルでパラフィン切片化の速度が加速することが確認されています。つまり、従来の方法よりも短時間で高品質なパラフィン切片化が可能となります。次に、ゼブラフィッシュの視神経網膜のシリーズ切片をヘマトキシリン-エオシン染色によって観察します。
改良された方法から収穫された切片は、従来のパラフィン切片法から収穫されたものよりも優れた完全性を持っていることが分かります。これら2つの方法を比較すると、ほとんどの採取された切片の品質に大きな違いはありませんが、従来の方法で採取された一部の切片は比較的低い品質であることがわかります。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常にヒュームフードなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
この手順を試すときは、注意深く水を追加し、過剰に充填しないように注意することが重要です。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、恒温室内での切断と浮遊を組み合わせることでパラフィン切片の品質を向上させるためのプロトコルについて説明しています。これにより従来の移動プロセスの必要性が排除されます。この修正により、パラフィン切片の効率と完全性が大幅に向上します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 組織学
- 神経科学
- パラフィン切片技術
背景
- 従来のパラフィン切片では、複数の移動ステップが必要で、しばしば切片の損失につながります。
- 新しい方法はプロセスを効率化し、完全な切片の収率を向上させます。
- 様々な生物学的組織の正確な形態学的分析には、改良された切片が不可欠です。
研究目的
- 完全なパラフィン切片の数を増やすプロトコルを提示すること。
- 生物学的研究におけるパラフィン切片に必要な時間を短縮すること。
- マウスとゼブラフィッシュの組織の分析を容易にすること。
使用した方法
- 記事では、切片用の恒温室を使用する方法について詳述しています。
- 成体マウスの海馬組織、腎臓、胚性マウスの脳、ゼブラフィッシュの眼のパラフィン包埋と切片が行われた。
- 温度設定と装置の具体的な設置手順が概説されています。
- 重要なステップには、加熱要素と切片手順の慎重なセットアップが含まれます。
- 切片はその後、評価のためにヘマトキシリン・エオジンで染色されます。
主な結果
- このプロトコルは、従来の方法と比較して、損失を減少させながらより高品質の切片を生成することが示されています。
- 様々な組織タイプ、特にゼブラフィッシュの視神経網膜とマウス組織で、切片の完全性が向上していることが観察されました。
- この方法は品質を維持しながら、パラフィン切片プロセスを加速します。
結論
- この研究は、組織サンプルの完全性を促進するより効率的なパラフィン切片プロトコルを提供します。
- より短い時間で高品質の成果を確保することで、形態学的研究を前進させます。
- 組織学的分析に正確な切片を必要とする研究者にとって、その影響は重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Paraffin sectioning remains a bottleneck in histology workflows, particularly for high-throughput target validation and phenotypic screening in discovery biology. This method improves section integrity and throughput, reducing technical variability that can confound downstream assay readouts and mechanistic de-risking efforts. By enabling reliable, reproducible tissue preparation, it supports predictive confidence in target engagement studies across neuroscience and oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through high-integrity tissue morphology for target localization and pathway analysis.
- Operational Value: Reduces section loss and manual transfer steps, increasing usable tissue yield per experiment.
- Predictive Value: Supports consistent histological readouts critical for target engagement and mechanism-of-action studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, intact sections suitable for immunohistochemistry and in situ hybridization assays.
- Operational Value: Streamlines sectioning workflow, allowing junior operators to maintain quality and consistency.
- Assay Readiness: Enables reliable compound evaluation by minimizing tissue artifacts that interfere with signal detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains morphological fidelity across disease-relevant systems, including murine and zebrafish tissues.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with reduced technical failure.
- Risk Mitigation: Lowers biological noise in longitudinal studies, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to lead optimization, where reliable histology informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via intact tissue sections for target validation and biomarker co-localization.
- Screening: Enhances assay reproducibility by delivering uniform sections for quantitative imaging and staining.
- Analytics: Generates high-quality morphological data enabling accurate comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Promotes preclinical continuity through consistent tissue preparation across species and developmental stages.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, low-cost capability applicable across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing section loss and improving morphological integrity.
- Operational Value: Standardizes sectioning through simplified equipment and reduced operator dependency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating histology workflows and reducing reagent waste from failed sections.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable histological data for target validation and safety pharmacology.
Implementation Considerations
- Requires basic histology expertise and familiarity with microtome operation and paraffin embedding.
- Needs standard laboratory equipment including microtome, oven, and staining reagents, plus custom acrylic chamber assembly.
- Demands cross-team standardization of section thickness, temperature control, and water bath preparation for reproducibility.
- Adaptation considerations include tissue-specific optimization of cutting speed and section thickness for varied sample densities.
- Practical limitations include safe handling of chloroform during assembly, necessitating fume hood use and proper ventilation.
