Name: 切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: 学ぶ、恒温槽を用いたパラフィン包埋切片法。マウス海馬組織やゼブラフィッシュ眼などの標本で、従来法より高品質な切片を短時間で得られる効率的な手法です。形態学的研究に有用です。

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この作品は中国の国家自然科学基金 (許可番号 31400936、31460260) によって支えられた、自然科学財団の江西省の中国 (20171BAB215020)。我々 はまた、この作業を支援する南昌大学とクイーン クイーンメアリー、ロンドン大学との共同プログラムを感謝します。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアと使用南昌大学委員会によって承認されています。
1. 機器をアセンブルし、ミクロトームを接続
<ol><li>要件 (補助図 1) あたりパラメーターを設計します。</li>
	<li>アクリル板を製造するローカル工場にパラメーターを送信します。</li>
	<li>シーケンスのすべての部品を組み立てる: クロロホルムを使用してタンクに 7 商業アクリル板を組み合わせてセクション チャネルと水お風呂 (図 1)。 注意: 光と酸素を満たしているとき、クロロホルムは有毒物質を生成します。ヒューム フードの装置を組み立てます。</li>
	<li>アクリル板 #1 (図 2 a,矢印) に穴を介して管状電気加熱要素をインストールします。</li>
	<li>温度コント ローラーをインストールするのには、電気ドリルを使用して #2 アクリル板に小さな穴を作成し、温度検出器 (図 2 a,矢印) をインストールします。タンク (図 2 a) にデジタル サーモスタットをインストールします。 注: 温度検出器は水面下 1 cm 以内にする必要があります。</li>
	<li>電源アクセスを提供するために、機器の電源を入れる前に 24 V 以下の電圧を調整します。</li>
	<li>ミクロトームから切片屑トレーを取り外します。</li>
	<li>中立的なシリコーン ・ シーラント (図 2 b) ミクロトーム ナイフ ホルダーを含むセクション チャネルにリンクします。 注: 刃の上の上の中立シリコーン ・ シーラント中傷されず古い刃は簡単に交換できるようにします。</li>
	<li>クロロホルムと固化する中立的なシリコン シール剤の時間を許可するために一晩乾燥させます。</li>
	<li>ブレード ホルダーに刃をインストールします。(図 2) 風呂の水に水を注ぐ。水表面だけブレード (図 2 D,アロー ・ ヘッド) の上部に触れる必要があります。</li>
</ol>2. パラフィン切片
注: 破片は、多くの場合ワックスのブロックと水の表面の上下端に蓄積します。この残骸は、定期的にクリアする必要があります。
<ol><li>
従来のパラフィン切片10を実行します。
	<ol>
<li>回転式ミクロトームのパラフィン包埋標本をクランプし、ブレード ホルダーにブレードを配置します。</li>
		<li>ハンド ホイールを切り、標本をセクションします。</li>
		<li>パラフィン切片のリボンを 38.5 ° C の温水浴に転送します。</li>
		<li>顕微鏡にセクションを展開した後の水面からスライドをピックアップします。</li>
		<li>42 ° C のオーブンでスライドを一晩乾かします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
改良されたパラフィン切片 (図 3)
	<ol>
<li>機器の電源を。</li>
		<li>温度検出スイッチでヒーターを開き、40.0 ° C 1 時間事前に水を暖めるために 38.0 ° C 間ターゲットの温度を設定します。</li>
		<li>パラフィン包埋にしたパラフィン ブロックを変更します。ミクロトームのカセット クランプにパラフィン ブロックを配置し、それをロックします。 注意: パラフィン ブロックの優れたと劣るボーダーは、円弧を形成し、狭いセクション チャネルを通過することができないからセクション リボンを防ぐために水平方向に変更ください。</li>
		<li>切断より厚いセクションでサンプルの迅速なアプローチします。</li>
		<li>適切なセクションの厚さ (成体マウスの脳、成体マウス腎臓、胎児マウスの脳に 10 μ m、ゼブラフィッシュの目 4 μ m) を調整します。ハンド ホイールを切り、セクションは、セクション チャネルと風呂に自動的に入力されます。</li>
		<li>ゆっくりと均一な切断ストローク (図 3 a) で標本をセクションします。 注: ハンド ホイールが数分間停止した後の最初のセクションが変更されます。セクションは連続した傷がある場合、替刃を置き換える必要があります。</li>
		<li>ライン (図 3 b、3 C) で浮かぶ風呂室にセクションをガイドします。 注: 場合は head セクションは、チャンバー壁に準拠して、浮いた状態を保つにブラシ ガイドを使用します。</li>
		<li>顕微鏡スライド上にセクションを遵守します。セクションの後完全に風呂の水、ピンセットで別のいくつかのセクションで展開します。顕微鏡のスライド (図 3 D) に風呂の水からそれらをピックアップします。 注: セクションする必要がありますピックアップする水のバスの後方からセクション チャネルと水お風呂の前のそれらがまだできないので完全に展開。</li>
		<li>一晩 42 ° C のオーブンでそれらを配置することによって、スライドを乾燥します。スライドは、無期限に室温で格納されることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色法の改良8の評価のために使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li>
<li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li>
<li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid-Cut%3A+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).</li>
<li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).</li>
</ol>

著者は、このデバイスの特許を持っているし、競争の興味を宣言しません。

パラフィン セクション形態を改善し、従来のパラフィン切片中の無駄な時間の問題を解決するには、改良されたパラフィン切片作製法切削と展開を組み合わせたを作成しました。この改良法は、セクション チャネル、水浴と温度検出スイッチとヒーターで構成されるシンプルな機器に依存します。セクション リボン セクション チャネルを介して水の風呂に入るし、自動的に切削しながら展開します。したがって、このメソッドは、パラフィン切片作製の品質と効率性は、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、大人のゼブラフィッシュ目のパラフィン切片によって確認されたを向上します。
従来のパラフィン切片作製中にカーリングのセクションを避けるためには、多くの調整を行った組織表面を潤し、ワックスのブロックを冷却、湿度を増やすこと、セクショニング6,7を組み合わせることなど 8;ただし、これらの調整、パラフィン切片より退屈です。...

形態学的研究は、生物学の研究が重要です。新技術は、全体の組織または生物1,2,3、薄い部分に試料を切断から直接彼らの目標は続いて染色を観察する研究者を許可しているが、プライマリのまま法者は唯一組織形態も組織に直接ターゲット蛋白質。光学顕微鏡を使用して、3 つのセクション タイプ: パラフィン、冷凍、およびグリコールメタクリル。セクショニングは共通組織抗原性を保護するため、試料の準備は簡単です、保有組織形態が悪いと薄い断面4,5には不向き。パラフィン切片は、保存状態の良い形態を展示するため最もよく使用される方法です。標本は完全に脱水し、ワックスに埋め込まれた、パラフィン ブロックに無期限に格納できます。また、パラフィン切片さらに実験の生物学的プローブ アクセスを改善し、Z 方向に細胞層オーバーレイを削減する薄いセクションを生成します。
しかし、従来のパラフィン切片がかかり、オペレーターのスキルを要求します。パラフィン切片を固定、脱水、埋め込み、切り取り、およびフローティング受けます。重要なは、風呂の水にナイフ ホルダーからセクション リボンを転送するは、ジュニアのオペレーターのためには必要なは難しいです。乾いた空気で特にセクション リボン静電気によるねじれが、暖かい水面に展開しにくい。セクションを改善するために品質、氷の水でそれらを浸すことまたはミクロトーム近く加湿器で湿度を上げるワックス ブロックを冷却のミクロトーム刃パス間公開される組織表面を潤し、6、7をお勧めします.ハイブリッド パラフィン包埋、セクショニング8、および商業部門転送システム支援9パラフィン切片を改善するための新しいメソッドが含まれます。これらのメソッドは、部分的にパラフィンを向上させる彼らははるかに厄介な断面を作る、商務部搬送システムは高価なセクショニング速度と品質。
このプロトコルでは、簡単、安価で柔軟な装置ステップバイ ステップ、回転式ミクロトームのナイフ ホルダーに接続することができますを作成する方法を示します。この装置は、温度検出スイッチ付きのヒーター、水風呂セクション チャネルで構成されます。切断した後、セクションの数十はセクション チャネルに流れるし、風呂の水、直接このように自動的に展開を入力します。これはパラフィン切片の効率が向上し、この技術をより便利になります。このメソッドよりアダルト マウス海馬セクション、成体マウス腎臓セクション、胚 15.5 日齢 (E15.5) マウスの脳のセクション、およびセクションを短い時間で収穫し、形態学的によりそのまま残った大人ゼブラフィッシュ眼を使用します。このメソッドは、加速されたパラフィン セクション区別の喪失を回避しながら断面を必要とする他の組織サンプルの使用もできます。

<table><tbody><tr><td>インキュベーター</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.、蓋</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>キシレン&nbsp;</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、ふた</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>パラプラスト</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>熱されたパラフィンの埋め込みモジュール</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>商業アクリル板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、ふた</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>管状の電気発熱体(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度調節器(12V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム&nbsp;</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルシリコーンシーラント</td><td></td><td></td><td>水路をミクロトームナイフホルダーとリンク</td></tr><tr><td>電圧変圧器</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てブレード</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>エオシン&nbsp;</td><td>バソ・ダイアグノスティックス(株)</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライド</td><td>セイルブランド</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルバルサム</td><td>Sinopharm化学試薬株式会社、蓋</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ&nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カール ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン切片用ウォーターバス</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore アルカディア C&nbsp;- コールドプレート</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン撥水スプレー&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

組織学や病理学のパラフィン包埋組織の断面が使用されています。ただし、それは面倒です。この方法を改善するためにいくつかの民間企業は、液体の水を使用して複雑な部分転送システムを考案しています。この技術を簡素化し、我々 はカットとシンプルな恒温室; 内フローティングを組み合わせた自家製の機器を使用して単純なメソッドを作成したがって、セクションは自動的に水表面における水の風呂を入力します。アダルト ゼブラフィッシュ目マウス萌芽期の脳、成体マウス腎臓成体マウス脳海馬は、比較のため従来のパラフィン切片と提案手法の両方を使用して切られました。統計分析は、我々 の改良法時間を保存したし、高い品質のセクションを示しています。さらに、短時間で全体の標本のパラフィン切片ジュニア演算子の簡単です。

改善方法は、そのままパラフィン セクションの数を高めた。成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、マウス萌芽期の脳、ゼブラフィッシュの目のこの新しいメソッドをテストしました。タンクに水を追加し、40.0 ° c. に 38.0 ° C 水の温度に維持されました。準備した後、順次組織サンプル、切断され、従来区分と比較しています。新しいメソッドは、断面欠損を回避し、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、成人ゼブラフィッシュ目 (図 4 a、4 C、4 e、4 G) でそのままセクションの割合を増加します。結論として、本手法は断面欠損を回避しよりそのままセクションごとに試料を採取して断面を改善しました。
法の改善には、1 試料当りの時間が減少しました。従来法と私たちの改良法の間に撮影時間を比較すると、全シリーズが成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15....

ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

この方法は、パラフィン切片などの形態学的分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、切断と折り畳み手順を最高潮にし、従来の方法で必要とされる転写プロセスを回避することです。まず、事前に製造されたすべての部品をドラフトに集めます。ここに示すように、クロロホルムを使用して7枚のアクリル板を組み合わせます。最終製品は、セクションチャネルとウォーターバスを備えたタンクになります。アクリル板番号2の穴を通して管状電気発熱体を取り付けます。電気ドリルを使用して、アクリル板の7番に小さな穴を開け、デジタルサーモスタットをタンクに取り付けて、タンクの黒い点で示されている目的の水面のレベルから少なくとも1センチメートル下にあることを確認します。巻を調整するtag機器の電源を入れる前に、24ボルト未満になるようにします。切片廃棄物トレイをミクロトームから取り外します。次に、中性シリコーンシーラントを使用して、セクションチャネルをミクロトームブレードホルダーにリンクし、ブレードの上部にシーラントが入らないようにします。セットアップを一晩乾燥させて、クロロホルムと中性シリコーンシーラントが固まる時間を与えます。翌日、ブレードをブレードホルダーに取り付けます。ウォーターバスに水を加え、水面がブレードの上部にちょうど触れていることを確認します。従来のパラフィン切片化を行った後、装置の電源を入れると、改善されたパラフィン切片化が開始されます。温度検出スイッチを使用してヒーターを開きます。目標温度を38°Cから40°Cの間で1時間設定し、お湯を温めます。パラフィン包埋によって取得されたパラフィンブロックをナイフで改変します。次に、ブロックをミクロトームのカセットクランプに置き、ロックします。厚い部分をカットして、サンプルにすばやく近づきます。サンプルに適したセクションの厚さに調整します。ハンドホイールを回すと、セクションが自動的にセクションチャネルとバスにロードされます。次に、ゆっくりと均一な切断ストロークで試験片を切片にします。セクションを浴槽に導き、一列に浮かぶようにします。ヘッド部がチャンバー壁に密着している場合は、ブラシガイドを使用して浮かせてください。切片がウォーターバスで完全に展開されたら、ピンセットを使用していくつかを分離し、顕微鏡スライドでそれらを拾います。スライドを摂氏42度に設定されたオーブンに移し、一晩乾かします。その後、スライドは分析の準備が整うまで無期限に室温で保存できます。分析の準備ができたら、ヘマトキシリン-エオシン染色を使用して、改良された方法を使用して切片を評価します。この研究では、改良された方法を使用して、成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、胚性マウス脳、およびゼブラフィッシュの眼のパラフィン切片を調製します。ここに示すように、新しい方法は切片の損失を回避し、検査された組織の各タイプにおける無傷の切片の割合を増加させます。全シリーズ切片化を行う場合、この方法により、試験したすべてのサンプルでパラフィン切片化の速度が加速することが確認されています。つまり、従来の方法よりも短時間で高品質なパラフィン切片化が可能となります。次に、ゼブラフィッシュの視神経網膜のシリーズ切片をヘマトキシリン-エオシン染色によって観察します。改良された方法から収穫された切片は、従来のパラフィン切片法から収穫されたものよりも優れた完全性を持っていることが分かります。これら2つの方法を比較すると、ほとんどの採取された切片の品質に大きな違いはありませんが、従来の方法で採取された一部の切片は比較的低い品質であることがわかります。クロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常にヒュームフードなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。この手順を試すときは、注意深く水を追加し、過剰に充填しないように注意することが重要です。

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

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