人間-iPSC 由来心筋細胞分離の収縮測定 384 ウェル プレートの温度制御の Ca 感受性蛍光色素

この方法は、心臓安全薬理学の分野で重要な質問に答えることができます。例えば、新しい人間の医学は、正常な心臓リズムを変更するリスクを運ぶのですか?この技術の主な利点は、大量の化合物を迅速かつ中程度のコストで評価できることです。

この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるカミーユ・フォーニーです。ヒト誘発多能性幹細胞由来心筋細胞、またはHIPSCCMの同期性の収縮の測定を準備するために、凍結細胞を含むCryoTubesを37°Cの水浴に2分間置くことから始める。解凍した細胞懸濁液全体を各チューブから1つの新鮮な50ミリリットル円錐形チューブに移します。

残った細胞を取り出すために、各チューブを摂氏37度前立てメッキ培地の1ミリリットルで洗浄し、解凍した細胞を含む50ミリリットルの円錐管にこの培地を加える。8ミリリットルの温かいめっき媒体をチューブに加え、慎重に懸濁液を混ぜます。ライブ細胞をカウントするためにトリパンブルー排除法とヘモサイトメーターを使用してください。

温めめっき培地を加えて、1ミリリットル当たり50,000細胞に濃度を調整する。2つの新しい384ウェル細胞培養プレートに細胞を分配するには、各ウェルに25マイクロリットルを加え、ウェルあたり約12,500個の細胞を得る。加湿雰囲気の384ウェルプレートで37°Cで細胞を5%の二酸化炭素で3〜4週間インキュベートします。

翌日、メッキ媒体を50マイクロリットルの温かい維持培地に交換する。その後、メンテナンスメディアの半分を2~3日ごとに交換します。7日目、14日、21日に、培地全体を交換します。

細胞が3〜4週間培養中に維持されると、それらは自発的に収縮する同期を形成し、これらの収縮に対する化合物の効果を測定することができる。アッセイの日には、測定のために、最初のセルプレートがプレートリーダーの内部に配置される少なくとも2時間前に、リーダーをオンにして、加熱システムを摂氏37度に設定します。化合物プレートを調製するために、室温に温める維持培地の40ミリリットルを1%体積ペニシリンストレプトマイシンを添加した。

培地がウォーミングアップしている間、試験化合物とコントロールを2つの384ウェル化合物プレートに分配し、井戸当たり1.5マイクロリットルのストック溶液を添加します。コンパウンドプレートを100Gで1分間遠心する。各ウェルに37マイクロリットルのメンテナンス媒体を加え、100 Gでプレートを1分間遠心分離します。

蛍光色素を調製するために、37°Cの水浴で1%体積ペニシリンストレプトマイシンを添加した維持培地の100ミリリットルを温める。次に、カルシウム感受性蛍光色素とクエンチャーの混合に10ミリリットルの加温した培地を加え、それらをストック蛍光培地として再構成する。プレートリーダーソフトウェアを起動します。

少なくとも10ヘルツの取得頻度でカルシウム波の2分のセグメントを記録するためにソフトウェアを準備します。各細胞板に蛍光培地を作るために、抗生物質で12ミリリットルの温かい維持培地で3ミリリットルのストック蛍光培地を希釈する。セルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの培地を30マイクロリットルの蛍光媒体に置き換え、1回上下にピペットで混合します。

その直後に、HIPSCCMを60分間リーダーの温度に調整できるように、プレートをプレートリーダーに入れます。次に、プレートリーダーソフトウェアを起動します。少なくとも10ヘルツの獲得頻度でカルシウム波の2分のセグメントを記録し、各井戸のベースラインの拍動率を定義します。

データ取得後にセルプレートがデバイスから転送されないようにすることが重要です。一部のソフトウェア バージョンでは、録音が完全に終了する前に、記録を停止する必要があります。プレートリーダーロボットを使用して、5マイクロリットルの試験をピペット化し、化合物を化合物プレートからセルプレートによく参照します。

その後、プレートリーダーソフトウェアでデータ取得を開始し、化合物添加後5分、15分、30分、45分、60分後からカルシウム波の2分のセグメントを記録します。データ分析を開始するには、プレートリーダーソフトウェアから各記録期間の生データを ASCII テキストファイルにエクスポートします。そして、それらをデータ分析ソフトウェアにインポートします。

データ解析ソフトウェアから、各記録期間の一次拍数をクリップボードコピーとしてエクスポートします。各ウェルと各時間ポイントのプライマリビート周波数を抽出します。最後に、貼り付けのクリップボードを使用して、ビート周波数をスプレッドシートソフトウェアにインポートし、テキストプロトコルで説明されているようにデータ分析を続行します。

1つの384ウェルプレートを横切るベースラインでのカルシウム波の記録は、ほとんどの場合、すべての井戸がプレート全体の変動がほとんどない定期的な拍動率を明らかにすることを示しています。心臓イオンチャネルのブロッカーが追加されると、心筋細胞のリズムに影響を与えます。アムロジピンは、遅いカルシウムチャネルのブロッカーであり、1マイクロモルまでの濃度依存的な方法で100%以上のリズムを加速する。

そして、その上に、アムロジピンは殴打を逮捕します。E-4031は、急速遅延整流カリウムチャネルのブロッカーは、最大10マイクロモルの濃度依存的な方法でリズムを約65〜70%減速させる。テトロドトキシンは、高速ナトリウムチャネルのブロッカーは、1〜30マイクロモルまで濃度依存的にリズムを約15%減速させるが、30マイクロモルを超えるテトロドトキシンは最初の5分以内に拍動を阻止する。

ベプリジル、心臓ナトリウム、カルシウム、カリウムチャネルの混合ブロッカーはまた、すべてまたは何も効果を生じ、ナトリウムチャネルブロックがベプリジルの主要な作用であることを示唆している。この手順を試みる間、細胞培養プレートでピペッティングする際には非常に穏やかであることを覚えておくことが重要です。これらの組織は非常に壊れやすく、ピペットに触れれば損傷しやすい。

ヒト細胞や活性薬物を使用することは危険であり、この手順を実行する間は、常に安全手袋や眼鏡を着用するなどの予防措置を講じるべきであることを忘れないでください。