Name: プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶ プリミング多能性iPS細胞から13日間で人の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）を誘導する方法。胚様体形成と培養技術により、生殖細胞毒性とゲノム保全性の研究に応用できる。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々 は、初期の研究中の技術支援の塩見八幡とチエ Owa を認めます。本研究はだった補助金 NIEHS/NIH R01 ES023316 と TS に R21ES024861 によって JHH に乗務医療研究所 (FAMRI) の助成金でサポートされています。

<ol><li>Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+primordial+germ+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a primordial germ cell.</a> Development. 141 (2), Cambridge, England. 245-252 (2014).</li>
<li>Saitou, M., Yamaji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+germ+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Primordial germ cells in mice.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375(2012).</li>
<li>De Felici, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-0-85729-826-3_2">Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells.</a> Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).</li>
<li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+stem+cell+states%3A+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).</li>
<li>Gafni, O., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li>
<li>Irie, N., Weinberger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX17+is+a+critical+specifier+of+human+primordial+germ+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate.</a> Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).</li>
<li>von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+during+Human+and+Mouse+In+vitro+Primordial+Germ+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification.</a> Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).</li>
<li>Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+In+vitro+Induction+of+Human+Germ+Cell+Fate+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).</li>
<li>Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primordial+germ+cell+commitment+in+vitro+associates+with+a+unique+PRDM14+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile.</a> The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).</li>
<li>Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+iPSC-derived+human+PGC-like+cells+at+the+surface+of+embryoid+bodies+to+prechemotaxis+migrating+PGCs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).</li>
<li>Kojima, Y., Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+Distinctive+Transcriptional+and+Signaling+Programs+Drive+Human+Germ+Cell+Lineage+Specification+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).</li>
<li>Irie, N., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Induction+and+Isolation+of+Human+Primordial+Germ+Cell-Like+Cells+from+Competent+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), Clifton, N.J. 217-226 (2017).</li>
<li>Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripartite+transcription+factor+network+regulates+primordial+germ+cell+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).</li>
<li>Chen, D., Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+competency+of+human+embryonic+stem+cells+depends+on+eomesodermin%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin.</a> Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).</li>
<li>Saitou, M., Miyauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).</li>
<li>Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+mouse+germ+cell+specification+pathway+in+culture+by+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.</a> Cell. 146 (4), 519-532 (2011).</li>
<li>Kobayashi, T., Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+early+human+development+and+germ+cell+program+from+conserved+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems.</a> Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).</li>
<li>Choi, J., Huebner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Mek1%2F2+suppression+impairs+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).</li>
<li>Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erasure+of+DNA+methylation%2C+genomic+imprints%2C+and+epimutations+in+a+primordial+germ-cell+model+derived+from+mouse+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).</li>
<li>Shirane, K., Kurimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Landscape+and+Regulatory+Principles+of+DNA+Methylation+Reprogramming+for+Germ+Cell+Specification+by+Mouse+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells.</a> Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明されているプロトコルを使用して hPGCLCs の堅牢な生産は、正常の二倍体核型10人間 Ips の 3 つの独立したクローンが確認されました。これらの iPSC のクローンは、同じ人間の新生児皮膚皮膚線維芽細胞細胞文化10から派生しました。彼らは、リクエストに応じて、適切な材料移転契約と冷凍の生きている人間の細胞の配置を配送の下は捜査官にこの記事の著者によって提供されます。正常核型の私達のプロトコルまたは他の所で報告されたものを使用して堅牢な hPGCLC の生産のために必要かどうかについて現在知られているです。
必要な T ボックス転写因子 hiPSCs11または Esc14京都大学8の斎藤のグループによって記述されたプロトコルを使用してから hPGCLCs の生産が EOMESODERMIN の式に依存する最近の研究を示している、SOX17 の誘導。SOX176ひと多能性幹細胞の生殖細胞分化における転写因子を決定するマスターの系統として機能するようであります。EOMESODERMIN はEOMES遺伝子によってエンコードされたEOMESの CRISPR/Cas9 ノックアウト条件11の生産 hPGCLC の SOX17 誘導のほぼ完全な欠如の原因し、他の遺伝子の表現の同じパターンに従って、SOX17 null ノックアウト細胞。EOMESで誘導ベクトルから EOMESODERMIN の過剰発現-hPGCLC 誘導培養中の null ノックアウト細胞は効率的に SOX17 を含む生殖細胞系遺伝子の誘導と同様に堅牢な hPGCLC 生産を救出します。対照的に、誘導発現 SOX17 も堅牢な PGCLC 生産を救出したが、EOMES を引き起こすことがなく。したがって、EOMESODERMIN は、SOX17 の重要な上流インデューサ、ひと多能性幹細胞から誘導 hPGCLC で EOMESODERMIN の単一の最も重要な役割をこれ。私達のプロトコルは、hiPSCs10SOX17 を誘導するが、EOMESODERMINE 誘導への依存を決定する待っています。
このプロトコルでは、プライミング多能性人間 Ips は変更された素朴な人間の幹細胞培地 (NHSM)5中6、プログラムし直す 4 の 96 時間 mTeSR1 中 ERK に依存しない素朴な多能性維持に変換します。同じ人間の iPSC クローンから始まるが他の市販の人間 iPSC 成長媒体 hPGCLC 利回りが低いの度合いで起因した文化 4 媒体をプログラムし直す前に hPGCLCs を生成する我々 の試み。この観察が示唆しているが、他のメディアで長期的な適応の hPGCLC 生産向上かないまま未来の調査決定、大幅書き換え 4 前に人間 Ips のプライミング多能性の正確な状態4i 中 EB 形成と hPGCLC 培地で EB 分化に影響を与えます。
我々 のプロトコル、次 hiPSCs から hPGCLCs の生産は、堅牢で EBs の多数の効率的な生産を可能にするマイクロウェル プレートの使用により部分的、再現性の高い (~ 8,000 バッチごとの EBs) 制服サイズ (EB あたり 3,000 hiPSCs)。EBs は、容易に私たちのプロトコルを使用して実験の 1 つのバッチで生産数は通常 U 下部セル文化井戸を用いた方法よりもはるかに大きいかもしれません。HPGCLCs ちりばめられて一様に均等に大きさで分類された EBs の大規模な数の生産は、小分子活性化または PGC 仕様を阻む要因を識別する高スループット化学上映のユニークな機会を与えるかもしれません、エピジェネティックな再プログラム化など生物学的特性。このような EBs 生殖細胞毒性、環境汚染物質だけでなく化学療法のエージェントなども臨床的に処方薬を含む大量の毒性の評価に役立つ場合もあります。
提示プロトコルを使用して hPGCLCs の堅牢かつ再現性のある生産の重要な要因を含める (i) (ii) と厳密に指定されているセルの正確な数を接種する、細胞外マトリックス蛋白質の mTeSR1 の維持健康的な hiPSCs の使用中型の変更やサブカルチャー、(iii) 人間の組換え BMP4 と (iv) 揺動培養中に EBs の物理的な損害を最小限に抑えるための良い多くを選択するタイミングに従ってください。BMP4 試薬の他の多くの必要な 2 X または大きい線量に対し、BMP4 試薬の最高の多くが 100 ng/mL の濃度で働いていた私たちの経験です。その一方で、BMP4 の最高の多くではなく減少 BMP4 の高用量を用いた hPGCLCs 生産の収量 (例えば、 200 ng/mL)。組換えひと BMP4 試薬 hPGCLC 世代を支援でのパフォーマンスの複数のベンダーから得られるたくさんのいくつか異なるをテスト最高の多くの大規模な量を確保することをお勧めします。
HPGCLC プロトコルの特徴は、他のプロトコルはセルの集計6,8の途中で hPGCLCs を生成できるに対し、hPGCLCs が EBs10 (図 8) の表面最外層にローカライズされているです。胚様体は、コア、内殻、外殻表面など複数の明瞭な層を形成する傾向があるし、中核地域は、しばしばプロ存続提供される成長因子フォーム、文化と同様、栄養素、酸素の限られた供給のために壊死拡散20媒体。EBs センターに向かって限られた拡散のため可能な限り制限なし EBs の表面に hPGCLCs の局在は露出のため直接、時間と線量制御 hPGCLCs の薬物や有害物質のために有益であるかもしれない薬理学的または毒性学的研究。
7,19、20hPGCLCs でグローバル gDNA を脱メチル化の程度は、マウスよりも弱いようマウス PGCLCs を堅牢なゲノムワイドな DNA 脱メチル化刷り込みを含むコントロール領域を少なくとも部分的に対しPGCLCS または孵卵6,7。Transcriptomal プロファイルは、hPGCLCs 可能性がありますマウス PGCLCs10より胚始原生殖の早い段階のようにことをお勧めします。EBs hPGCLC 生産の条件の下での長期にわたる文化を引き起こした gDNA 脱メチル化7度の増加が報告されています。ただし、EBs のまたは隔離されたセルとして hPGCLCs の文化の延長期間が生殖細胞分化のより高度な段階を達成できるかどうか今後の研究によって決定される必要があります。

始原生殖細胞 (PGCs) 男女ともにすべての生殖細胞の共通前駆体であります。哺乳類胚における始原生殖の開発に関する我々 の知識のほとんどが実験室マウス1,2を勉強を通じて得られました。マウス胚の胚日 6.0 6.5、PGC 前駆体の 6 または類似の小さな数字は、胚盤葉上層と 〜 40 PGCs が骨形成タンパク質 Bmp2 と隣接するから分泌される Bmp4 に依存した方法でそれらから誘導されるの創設の人口にあります。セルです。胚のところ識別される最も早い人間始原生殖は妊娠3週の終わりごろに卵黄嚢の内胚葉の壁にいた。これは、移行する PGCs がマウス胚の観察される同じ場所です、ので移行が創設の人口ではなくパスで観察された人間 PGCs がそうです。しかし、以前の段階をたどる研究始原生殖または PGC のヒト胎芽における前駆体が行方不明になっています。
人間の胚の始原生殖へのアクセスは、技術的および倫理的な障害のために挑戦です。これらのハードルを克服するには、PGC のような細胞モデルを最近ひと多能性幹細胞 (Psc) から生成されています。多能性は、生殖系列と 3 つの胚性胚葉4に分化する細胞機能です。細胞外マトリックス蛋白で被覆された料理に mTeSR1 培地 (プライミング多能性の状態で人間の Psc のメンテナンスのため策定する準備ができて、市販媒体) で維持される人間の Psc に対し準備万端状態多能性があります。4、2013 年にヤコブ ハンナの実験室は、ERK1/2、GSK3、JNK、ロック、暗号、蛋白質キナーゼを阻害剤を含む素朴な人間の幹細胞培地 (NHSM) に公開され、素朴な多能性の状態に発動を促された多能性細胞を変換できることを示したp38 MAPK と成長要因 LIF、TGF、bFGF5。素朴な多能性ひと Psc から 2015 年にハンナとアジム Surani が率いる研究グループは Psc6からひと PGC-Like 細胞 (hPGCLCs) の最初の堅牢な生産を実現しました。後、私たちを含めた、その他のいくつかの研究所は、わずかに異なるプロトコル7,8,9,10を使用して Psc から hPGCLCs の生成を報告しました。我々 の研究は、(私たちの以前に発行された研究10表 S1 にまとめます) 別のプロトコルを使用して生成された hPGCLCs の transcriptomally10を互いに類似を証拠を提供しました。入手可能な証拠は、世界的なエピジェネティックな消去7や遊走移行10前に早期人間胚始原生殖する人間 PGCLCs の類似性をサポートします。
研究マウス胚始原生殖、マウス PGCLCs および人間 PGCLCs (が唯一人間始原生殖への非常に限られたアクセス) マウスと人間1,6、PGC 仕様の分子機構が大幅に異なることを明らかにしました。 7,8,9,10、11,12,13,14,15,16 ,17。たとえば、Prdm14 マウス胚では、PGC 仕様で重要な役割を果たしているそう人間の PGC 仕様におけるその役割限られた1,15です。対照的に、EOMESODERMIN による SOX17 の誘導は、これら転写因子はマウス PGC 仕様15に不可欠なように見えるに対し PGC 仕様6,11,14、不可欠です。強く hPGCLCs を用いた研究のこれらの初期の成果は、人間の胚始原生殖の代理としてこの細胞培養モデルの重要性をサポートします。
最近発表された研究、ゲノム DNA のコピー数解析、評価、研究室のディープ シーケンスを含む素朴な多能性の状態で Psc の長期メンテナンスが染色体不安定性のリスクを大幅に増加を示していると構造の異常。この現象は、マウス18と人間19 Psc の両方で観察しました。少なくとも 2 週間64i 素朴な多能性媒体で維持される人間の Psc のハンナ/Surani によって報告された元の hPGCLC 生産のプロトコルが開発されました。人間の Psc と PGCLCs の正常の二倍体染色体を維持するために人間の Psc が唯一 72 時間用10, この記事で示される 4i 中にさらされている修正されたプロトコルを開発しました。人間 Ips (hiPSCs) は、下塗りの多能性の状態の下で保持されます。EB 形成する直前にセルは 4i の素朴なリプログラミング培地 (変更された NHSM 中) で 48 時間培養しました。セルは解離し、4i 中追加 24 時間フォーム EBs マイクロウェルにパックします。EBs は、hPGCLCs の最大の収率を取得する 8 日前までなし添付ファイルのカルチャの揺動条件の下で遺伝子組換えひと BMP4 の高濃度を含む hPGCLC 誘導培地で維持されます。8 日 EB 培養後 FACS 並べ替え可能な単一細胞懸濁液の収量に CD38 + ~ 40% 細胞として hPGCLCs を FACS による解離の EB 細胞から分離することができます。方法7,8,9, 私たちの変更の6、前に元のプロトコルを含む通常特定せず自発的に形作られる細胞凝集塊の hPGCLCs を生成その他が公開されたに対しローカリゼーションでは、我々 のプロトコルによって生成された hPGCLC は胚様体 (EBs) の表面で観察されます。

<table><tbody><tr><td>Primed pluripotency hiPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>アリコート マトリゲルをメーカーが示す容量 (約 200 &mu;コールドチューブを使用してください。-80°Cで保管してください。C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21041-025</td><td>4°Cで保管</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>基礎培地に5倍サプリメントを添加して再構成します。再構成された媒体は4°Cで保存することができます。Cは、細胞培養性能に影響を与えることなく、最大 4週間使用できます。</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon</td><td>1683</td><td>Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 &mu;50 mM Y27632ストック溶液を調製するためのL水。ろ過による滅菌(0.22 &mu;アリコート 20 &mu;L /チューブx 15チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07930</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>革新的な細胞技術</td><td>AT104-500</td><td>細胞解離酵素; アリコート 40 mL/チューブ x 12 チューブ、-20°Cで保存。</td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>4i hiPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1286101</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>40 mL/チューブ x 12 チューブを分注し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓由来インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882-100MG</td> 水 <td>10mL に 0.1 mL の氷酢酸を加えます。ろ過(0.22 um)で滅菌します。100 mgのインスリン凍結乾燥粉末を冷たい10 mLの酸性水で希釈して、10 mg / mLのストック溶液を作ります。.アリコート 650 &mu;L /チューブx 15チューブで、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ヒト LIF</td><td>PeproTech</td><td>300-05</td><td>再構成 250 &mu;g ヒト LIF は 250 &mu;L水。750 &mu; を加算します。PBS(-)中の0.1%ウシ血清アルブミンのLで250&mu;g/mL ヒト LIF ストック溶液。この製品の特定活動量は>10,000ユニット/&μ;gです。40 ul /チューブ x 25 チューブを分注し、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ヒトFGF2</td><td>R&D Systems</td><td>4114-TC</td><td>1 mg のヒト FGF2 を 5 mL の PBS(-) で再構成して 200 &mu;g/mL ヒト FGF2 ストック溶液。アリコート 100 &mu;L /チューブx 50チューブで、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ヒトTGF-&β;1</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td>Reconstitite 50 &mu;g と 50 &mu;10 mMクエン酸(pH 3.0)のL。150 &mu; を加算します。PBS(-)中の0.1%ウシ血清アルブミンのLで250&mu;g / mLヒトTGF-&β;1つのストックソリューション。アリコート 4 &mu;L /チューブx 50チューブで、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>4i 基礎培地</td><td></td><td></td><td>次の試薬を混合して 4i 基礎培地を作ります. 500 mL ノックアウト DMEM 100 mL ノックアウト血清補充 6 mL ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100x) 6 mL MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x) 650 &micro;ウシ膵臓由来の10 mg / mLインスリンのL 40 &micro;250のL&マイクロ;g/mL ヒト LIF 20 & マイクロ;200のl&マイクロ;g/ml ヒト FGF2 4 &micro;250のl&マイクロ;g / mlヒトTGF-&β;1 アリコート 40 ml/チューブ、-80°Cで保存。</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon</td><td>1386</td> は <td>25 mg CHIR99021 (MW 465.34) を 1791 &mu;L DMSO で 30 mM CHIR99021ストック溶液を作製します。アリコート50 &mu;L /チューブ x 35 チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td> 5 <td>mg PD0325901 (MW 482.19) を 1037 &mu;L DMSOで10 mM PD0325901ストック溶液を作製します。アリコート50 &mu;L /チューブx 20チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>BIRB796</td><td>Axon</td><td>1358</td><td>10 mg BIRB796 (MW 527.66) を 948 &mu;L DMSO で 20 mM BIRB796 のストック溶液を作製します。アリコート50 &mu;L /チューブx 18チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>SP600125</td><td>Tocris</td><td>1496</td><td>10 mg SP600125 (MW220.23) を 908 &mu;L DMSOで50 mM SP600125ストック溶液を作製します。アリコート50 &mu;L /チューブx 18チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27845</td><td>マイクロウェルプレート</td></tr><tr><td>プルロニックF-127</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P2443</td> 5 <td>g プルロニックF-127を100mLの水に再構成して、5%(w/v)プルロニックF127ストック溶液を調製します。ろ過(0.22 um)で滅菌します。Aliqout 50 mL/チューブ x 2 チューブで保存</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>hPGCLC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow's MEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11710035</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (100x)</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>hPGCLC 基礎培地</td><td></td><td></td><td>以下の試薬を混合して hPGCLC 基礎培地を作ります。 500 mL of Glasgow'75 mL の MEM 75 mL のノックアウト血清補充 6 mL の MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x) 6 mL の 100 mM ピルビン酸ナトリウム 6 mL のペニシリン-ストレプトマイシン (x100) アリコート 40 mL/チューブで保存し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>希釈 350 &mu;L 2-メルカプトエタノール(14.3 M)を9.65 mL PBS(-)中に添加して、500 mM 2-メルカプトエタノールストック溶液を調製します。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>400 mg の L-アスコルビン酸を 20 mL の水で再構成し、20 mg/mL の L-アスコルビン酸ストック溶液を調製します。ろ過(0.22 um)で滅菌します。アリコート 500 &mu;L /チューブx 40チューブで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>組換えヒトBMP4</td><td>R&D Systems</td><td>314-BP</td><td>1 mg の組換えヒト BMP4 を 10 mL の 4mM HCl 水溶液で再構成して 100 &mu;g/mL 組換えヒト BMP4 ストック溶液。アリコート 250 &mu;L /チューブx 40チューブで、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ヒトSCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td>再構成 250 &mu;g ヒト SCF と 500 &mu;0.1%ウシ血清アルブミンのLをPBS(-)で500&mu;g/mLヒトSCFストック溶液。アリコート35 &mu;L /チューブx14チューブで、-80°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ヒトEGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td> 1 <td>mgのヒトEGFを1 mLの0.1%ウシ血清アルブミン含有PBS(-)で再構成し、1 mg/mLのヒトEGFストック溶液を調製します。アリコット 100 &mu;L /チューブ×10チューブ。100 &mu;1 mg/mL ヒト EGF ストック溶液の L と 300 &mu;PBS(-)中の0.1%ウシ血清アルブミンのLで250&mu;g/mL ヒト EGF ストック溶液。アリコート 20 &mu;L /チューブ×20チューブ。-80°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>コーニング</td><td>352340</td><td>細孔径 = 40 &mu;m.</td></tr><tr><td>50 mlポリプロピレン円錐管</td><td>コーニング</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>低アタッチメントプレート</td><td>コーニング</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>バリミックスプラットフォームロッカー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>M79735Q</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>免疫組織化学染色 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLOXALL ブロッキング溶液</td><td>ベクター</td><td>SP-6000</td><td></td></tr><tr><td>正常馬血清 ImmPRESS 試薬 抗ヤギ IgG</td><td>ベクター</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>OCT-3/4 抗体</td><td>サンタクルーズ</td><td>SC-8629</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB</td><td>VECTOR</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SP15-100</td><td>封入剤</td></tr><tr><td><強>名</強></td><td><強>企業名</強></td><td><強>カタログ番号</強></td><td><強>コメント</強/強<></td></tr><tr><td>強>隔離 hPGCLC</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胚体解離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-348</td><td></td></tr><tr>APC <td>abcam</td><td>ab134399</td><td></td><td>に結合した抗CD38抗体</td></tr></tbody></table>

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

始原生殖細胞 (PGCs) すべての生殖細胞の共通前駆体であります。マウス胚 〜 40 孵卵創立人口多能性胚盤葉上層の細胞からサイトカイン産生、骨形成タンパク質 4 (Bmp4) を含む管弦楽に編曲された露出によって引き起こされます。ヒト胎芽における最古の PGCs が妊娠、3rd週の終わり頃の卵黄嚢の内胚葉の壁に識別されているが、人間の PGC 仕様および初期開発のプロセスについて知られている少し。人間の胚始原生殖を勉強の技術および倫理的な障壁を回避するためにサロゲート細胞モデルを最近多能性幹細胞から生成されています。ここでは、堅牢な生産 PGC-Like 細胞 (hPGCLCs) のための 13 日プロトコルについて述べる.ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) をプライミング多能性の状態で維持が培養 48 時間媒体をリプログラミング 4i の素朴な単一のセルに分離、マイクロウェルにパックします。素朴な多能性の状態で hiPSCs の長期のメンテナンスは重要な染色体異常を引き起こすし、避けるべきであります。低付着の高濃度を含む hPGCLC 誘導培地における揺動条件下で容器に追加されますフォーム胚様体 (EBs) 4i 中 24 時間培養の維持、マイクロウェルの hiPSCs組換えの人間 BMP4。EBs は、さらに hPGCLCs の最大収率を取得する揺動、非付着の状態で 8 日までの培養します。免疫組織化学は、hPGCLCs 容易に強く表面に専らほとんどすべて EBs で OCT4 を発現する細胞として検出されます。CD38 + 40-45% 細胞として EBs が酵素によって解離 FACS 濃縮を受けるとき hPGCLCs を集めることができるもたらします。

ここで使用されるマイクロウェル プレート 24 ウェルの形式では、最大 1,200 の形成をサポート マイクロウェル シートを保持している 8 の井戸 EBs。約 2400 万 4i ナイーブ多能性細胞からこのマイクロウェル プレート通常生成します 〜 8,000 EBs EB あたり 3,000 〜 細胞から成る。EBs の定数ロッキング非付着性文化の中にそのまま EBs の数は徐々 に自発的な自己解体と 〜 3,000 による減少 EBs がプロトコルの日 13 日まで生き残る。EBs を存続するこれらのほとんどの表面に 50-200 hPGCLCs がある (OCT4 + EBs の連続切片の細胞の免疫組織化学的検出によって推定される;図 8を参照)、合計で 100,000 〜 OCT4 + hPGCLCs を降伏します。EBs の単一セルの消化酵素は、9,000 47,000 セルに FACS 濃縮 CD38 + hPGCLCs の収量を減らす、比較的非能率的なプロセスです。私たちの手で実験の六つの独立したが、連続したバッチの平均があった 14,038 ± 5,731 (± SEM を意味する)。CD38 負 EB 細胞 OCT4 (qPCR) mRNA や蛋白 (免疫組織化学) だけ非常に弱く、表現完全に欠席、すべての EB セル強くない場合、OCT4 蛋白を発現する、実質的に CD38 + hPGCLCs の全体の人口に相当します。
このプロトコルの重要なパラメーターには、細胞密度が含まれています。細胞が約 20-30% に達する 6 も細胞培養プレート (ウェルあたり 9.60 cm2成長分野) 2 mL Y27632 添加培地 (2.2.9) でのタンパク質被覆細胞外マトリックスの x 10 の5ヒト Ips 2.0 を接種すると、24 で合流(図 1) 接種後の時間。追加の mTeSR1 Y7632、セルの集計およびコロニーを形成の不在中に 24 時間文化後成長領域 (図 2) の 30% を占めています。セル、(2.3.2) 4i のリプログラミングの培地で培養されます。4i 培地、細胞はなる合流 (図 3) の文化の 24 時間。4i 中追加 24 時間培養細胞 (図 4) 高密度になります。中型の変更 (± 4 時間は 24 時間ごと)、細胞の密度の正確なタイミングは、EBs と hPGCLCs が正常に形成のために重要です。
4i 中で 48 時間培養後、細胞解離、井戸 400 μ m は、サイズ (2.4) マイクロウェル プレートに接種しました。この市販マイクロウェル プレートの塗装は「不要な細胞接着リスクを軽減するメーカー、新鮮な洗剤 (2.4.3) で再塗装による低接着面はお勧め。800 μ m マイクロウェルは、正しく分化の EB サイズの重要性を示唆している hPGCLCs の低収量で起因しました。4i 培地に接種した細胞は標準、倒立位相差顕微鏡 (図 5) を使用して観察することができます 24-30 時間でマイクロウェルの EBs を形成する.EBs の円形の輪郭が培養 24 時間後で明確に表示されます。(例えば接種後 16 時間) 以前に EBs を収穫ためそのような EBs 機構損害に対して脆弱であるし、簡単に解体の円形の輪郭を明確に表示する前にお勧めできません。正常である EBs は素朴な hiPSCs のかなりの量が組み込まれないことに注意してください。これらの非法人の細胞は低付着面上 (2.5.2) EBs の文化を揺動の開始前に流されます。また、プロトコル、EBs は 4i 素朴な多能性中 - hPGCLC の中ではなくで形成されているに注意してください。4i 中 hPGCLC 媒体への露出の前に固体の EBs の前の形成は、EBs の表面に hPGCLCs の分布にとって重要です。
EBs は、非付着培養条件集計または融合(図 6 および図 7) なしの球形の形を維持する hPGCLC、揺動中に保持されます。EB 集計と融合の弱い状態をロッキングの原因も、あまりにも過酷な条件は EBs を解体します。人間 PGCLCs は 8 日文化 (図 8) まで後、早ければ 5 日文化、hPGCLC 中、その数は増加の EBs の表面に OCT4 発現細胞として登場します。さらに潜伏 EBs の解体 EBs と hPGCLCs の損失の原因となります。酵素によって解離の EB 細胞から hPGCLC 培地における文化の 5-8 日後人間 PGCLCs を濃縮することができます CD38 + 細胞 (図 9) として FACS によって
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig1.jpg"> 図 1: Y27632 添加培地接種後 24 時間で人間の iPSC 細胞培養。細胞密度は、約 20-30% 合流。ROCK 阻害剤 Y27632 の存在下で細胞は長い、スパイクのような伸長とともに広がる傾向にあります。スケールバー = 100 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig2.jpg"> 図 2: 人間の iPSC 細胞培養 48 時間後に接種します。細胞コロニーを形成、成長分野の ~ 30% を占めるに集計。スケールバー = 100 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig3.jpg"> 図 3: 24 時間 4i リプログラミング培地で培養した人間 iPSC 細胞培養。細胞密度に到達します。スケールバー = 100 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig4.jpg"> 図 4: 48 時間 4i リプログラミング培地で培養した人間 iPSC 細胞培養。コンフルエントの細胞が密集します。スケールバー = 100 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig5.jpg"> 図 5: 媒体のリプログラミングは 4i で 24 時間培養後マイクロウェルに形成された EBs 人間 iPSC 。接種後 24-30 時間で EBs の円形の輪郭が見えるようになります。輪郭を位相差顕微鏡下で確認すると、EBs が揺動培養条件への転送準備ができています。スケール バー = 500 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig6.jpg"> 図 6: 人間 iPSC hPGCLC 培地で 24 時間培養した EBs 。EBs は、ほぼ球形の形を維持します。スケール バー = 500 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig7.jpg"> 図 7: 人間 iPSC hPGCLC 中 192 時間インキュベート EBs 。EBs が 24 時間培養で外見と比較して拡大されが、彼らはまだほとんど集計や融合なしで球面形状を維持します。スケール バー = 500 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig8.jpg"> 図 8: OCT4 を表現する人間の PGCLCs による hPGCLC 中の 192 時間インキュベート EBs の表面にローカライズされています。EBs が細胞外マトリックス蛋白に埋め込まれ、OCT4 の FFPE スライドの免疫組織化学的染色処理 (DAB 基質)。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58297/58297fig9.jpg"> 図 9: CD38 として FACS による酵素によって解離の EB 細胞からその人間 PGCLCs の濃縮、+のセル。5-8 日間 hPGCLC 培地で培養後 EBs は単一細胞懸濁液を準備するタンパク質分解酵素で解離することができます。CD38 として hPGCLCs を濃縮することができます+ FACS (赤い点) による細胞します。CD38 表現しない EB セル (青い点) はネガティブ コントロールとしても収集する必要があります。CD38 正と負で CD38 細胞の FACS ゲートは、細胞の種類ごとの汚染を避けるために大差 (緑の点) で区切る必要があります。上部と下部パネルは、FACS プロファイルなしまたは抗 CD38 抗体染色、それぞれを表示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58297/58297fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

始原生殖細胞 (PGCs) 精子と卵の両方の共通の前駆体であります。人間の胚の始原生殖は、サイトカインとの相互作用を通じて多能性胚盤葉上層の細胞から指定されます。ここでは、プライミング多能性誘導多能性幹細胞からの胚様体の表面で孵卵に似たひと細胞 transcriptomally を誘導する 13 日間プロトコルについて述べる。

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

この方法は、ヒト原始生殖細胞のゲノムの損傷がどのように作成または修復されるかなど、ヒト生殖細胞毒物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒト原始胚芽細胞が遺伝的背景の疾患素因を有するプライミング多能性iPS細胞から2週間で生成できることである。この技術の意味は、ヒト生殖細胞のゲノム障害の予防に及び、当社の細胞培養モデルは治療薬の生殖細胞毒性を低減するのに役立つからです。ヒト原始生殖細胞様細胞、またはヒトGCLCの生成から始めるため、テキストプロトコルに記載されているように、ヒトiPSCの細胞外マトリックスタンパク質被覆プレートおよび細胞懸濁液を調製する。Y-27632 Rhoキナーゼ阻害剤を含むmTeSR1培地中に、プライミング多能性ヒトiPSCの単細胞懸濁液を調製する。慎重に1ミリリットル当たり100,000細胞に細胞密度を調整します。6ウェルプレートをコーティングした細胞外マトリックスタンパク質の各ウェルにプライミングされたヒトiPSCの細胞懸濁液を2ミリリットル接種し、プレートを垂直および水平に振って細胞が均等に分配されるようにする。37°Cの三ガスCO2インキュベーターでプレートをインキュベートします。6ウェルプレートの各ウェルに正確に200,000個の細胞を接種することは非常に重要です。細胞の正確なカウントは非常に重要です。一時的な多能性への一時的な変換が完了した後、細胞は正常である過剰コンフルエントを見る必要があります。ヒトのPGCLCの高い時期と実験再現性を達成するには、中程度の変化の正確なタイミングが重要です。4i hiPSC培養の密度は、これらの条件下で高く、接種後48〜72時間で細胞がコンフルエントになることが期待される。接種後24時間、Y27632を使用せずにmTeSR1培地のウェル当たり2ミリリットルで培地を交換する。プライミング多能性状態ヒトiPSCを4iナイーブ多能性幹細胞に変換し始め、摂氏37度の水浴で4i完全培地50ミリリットルを15分間温める。接種後48時間および72時間後に、プレートをインキュベーターから取り出し、4i完全培地のウェルあたり2ミリリットルで培地を交換する。遠心分離剤は、室温で5分間1,000gのマイクロウェルプレートをコーティングした。逆の顕微鏡で井戸を点検し、気泡がないことを確認します。テキストプロトコルに記載されているようにウェルをすすい、遠心分離を繰り返します。すすがった井戸に4i完全な培地を加えます。プレートを室温で5分間1,000gで遠心し、再び井戸を点検します。マイクロウェルプレートに4i人のiPSCを接種するには、プロトコルに記載されているようにヒトiPSC細胞懸濁液を調製する。この細胞懸濁液を40マイクロメートルの孔径セルストレーナーでフィルターして、細胞凝集体を除去します。ストレーナーを1ミリリットルのプリ温めた4i完全培地で3回洗浄し、ストレーナーからすべての細胞を採取し、培養カウンターで細胞を数える。次に、この単一細胞懸濁液4i素数ヒトiPSCを、Y27632を含む9ミリリットルの4i完全培地で27〜3240万個の細胞に希釈する。トリガスインキュベーターから、4i完全培地1ミリリットルを含む以前に調製したマイクロウェルプレートを取り除きます。4iナイーブヒトiPSC懸濁液を1ミリリットルずつ各ウェルに接種し、ウェルあたり3.0〜360万個の細胞の濃度を達成した。ピペットを軽くして細胞を均等に分配する。プレートを室温で3分間100gで遠心します。プレートを三ガスCO2インキュベーターに入れ、マイクロウェルにペレット化された細胞を邪魔しないようにし、一晩のインキュベーションはタイトな胚体またはEBの形成には不十分であるため、24〜30時間インキュベートします。ヒトPGCLC基底媒体のプレウォーム5ミリリットルおよび37°Cの水浴で少なくとも5分間のヒトPGCLC完全培地の20ミリリットルは慎重に50ミリリットルのポリプロピレンコンニカルチューブの上に逆さまに40マイクロメートルの細孔サイズのセルストレーナーを置きます。マイクロウェルからEBを取り外すには、プレートの各ウェルを穏やかにピペットします。EBsに組み込まれていない細胞を除去するには、細胞ストレーナーを通してすべてのウェルの内容物をフィルタリングする。細胞ストレーナーの膜に保持されたEBを、あらかじめ温めたヒトPGCLC基底培地1ミリリットルで静かに洗浄し、洗浄を5回繰り返します。新鮮な50ミリリットルの円錐チューブを細胞ストレーナーに置き、セルストレーナーが新しいチューブの右側に配置されるようにします。新しいチューブで細胞ストレーナーを素早く反転させると、細胞ストレーナーの膜の下にEBが配置されます。あらかじめ温めたヒトPGCLC完全培地を細胞ストレーナーの膜に18ミリリットル加え、円錐管に脳を集める。その後、EBの懸濁液のウェルあたり3ミリリットルを低い取り付け6ウェルプレートの井戸にプレートします。プレートを3ガスインキュベーターのシーソームーブロッカーに置き、1分間に約20ターンのロッキング速度を慎重に設定します。実験の7日目から13日目に、毎日20ミリリットルのヒトPGCLC完全培地を新たに調製する。ロッカーからプレートを取り外すと、井戸の底にRBが沈みます。約0.2ミリリットルの古い培地が各井戸に残るように、IBを乾燥させることなく古い媒体を取り除きます。毎日古い培地を取り除いた後、新鮮なヒトPGCLC完全培地の井戸あたり3ミリリットルを追加します。ヒトPGCLCをOCT4陽性細胞として同定するために、EBを1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心分離管に収穫する。EBを室温で底に沈め、培地を捨てます。氷冷1X PBSでEJBをリンスします。PBSを取り除いた後、氷上のPBS中のアジドナトリウムの体積で1ミリリットルの氷冷1%重量で5分間培養します。EBを室温で底に沈めます。上清を捨て、氷冷PBSでEBをすすいだ。氷上の細胞外マトリックスタンパク質の200マイクロリットルを解凍します。タンパク質をEBを含むチューブに加えます。ゲルが固まり、そして、EBが埋め込まれるまで、ほぼ10分間、室温でチューブを放置します。EBを固定するには、PBSに4%ホルムアルデヒドを1ミリリットル加え、穏やかな揺れで15分間室温でインキュベートします。その後、ホルムアルデヒドを捨て、氷冷PBSで一度EJBをすすいだ。70%エタノールの1ミリリットルを加えます。摂氏4度で70%エタノールで1週間保存するか、標準のFFPEプロトコルで処理してください。細胞密度、各ウェル上の細胞の分布さえも重要です。6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのY27632補充培地におけるヒトIPSCは、24時間後に20〜30%の合流に達する。mTeSR1培地でのさらなる24時間培養後、Y27632の不在時に、細胞が凝集し、コロニーを形成し、成長面積の約30%を占める。4iリプログラミング培地で24時間培養した後、細胞は合流に達した。4i培地でさらに24時間培養した後、細胞はより密に詰まった。4iリプログラミング培地におけるマイクロウェルでの24時間のインキュベーションの後、細胞は接種後24〜30時間で円形の輪郭を見えるエブを形成した。ヒトPGCLC培地中に保管された脳は、非接着性の状態で、24時間後に凝集することなく球形を維持した。192時間後、同じ形態を維持して、より大きかった。5日後、細胞は、8日後に、その数を増加させる、EBの表面上の細胞を発現するOCT4として出現した。ヒトPGCLCの単細胞懸濁液からの細胞は、FACSによってCD38陽性細胞として濃縮された。CD38を発現しない細胞は陰性対照であった。汚染を避けるために、FACSゲートCD38陽性およびCD38陰性細胞を広いマージンで分離した。この手順を試みる間、その重要な正確なセルカウントと中程度の変化のタイミングに従う。1日でも培地変化を省略したり、任意のステップでその培地の体積を減らしたりすると、大量の細胞死を引き起こすことがある。胚体の揺れる培養の速度は慎重に最適化されなければならない。

generation-human-primordial-germ-cell-like-cells-at-surface-embryoid

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

このビデオは、胚様体(EB)を神経上皮凝集体に分化させ、その後のニューロン細胞とグリア細胞への分裂のプロセスを示しています。この方法により、in...

ヒト人工多能性幹細胞由来胚様体からのニューロンおよびグリア細胞の生成

このビデオは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)の球状脳オルガノイドへの変換を示しています。特異的な阻害剤を用いることで、hPSCは神経細胞の系統に分化するように誘導され、神経外胚葉コロニーを形成します。その後、特別な成長因子が導入され、コロニーの自己組織化と増殖が促進され、最終的には球状の脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト多能性幹細胞からのスフェロイドの作製

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal...

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

効率的な一括、および急速な化学復帰従来系列プライミングひと多能性幹細胞 (hPSC) の epigenomically 安定した素朴な着床前胚盤葉上層のような多能性状態にするためのプロトコルを提案します。このメソッド結果減少系統プライミング遺伝子発現と分化多能でマーク付きの改善で従来の hPSC...

従来のひと多能性幹細胞の向上多能分化と素朴なような状態の復帰化学

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。...

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

学ぶ プリミング多能性iPS細胞から13日間で人の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）を誘導する方法。胚様体形成と培養技術により、生殖細胞毒性とゲノム保全性の研究に応用できる。

プライミング多能性胚様体の表面で人間の始原生殖細胞のような細胞の生成誘導多能性幹細胞

さらに動画を探す