Name: 精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ マウス精巣上体におけるダイナミンの免疫蛍光局在化と分泌タンパク質の分離法。精子成熟と貯蔵の調節に関与するタンパク質標的を解明し、生殖生物学研究への応用可能性を示します。

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著者は、この作業をサポートするため国立保健医療研究評議会のオーストラリア プロジェクト助成金 APP1103176 を認識したいと思います。

動物組織のコレクションを含むすべての実験手順は、ニューカッスル大学の動物のケアと倫理委員会によって承認されました。
1. 蛍光染色パラフィン埋め込まれた精巣上体セクション (図 1 および 2)
<ol><li>CO2吸入 (スイス マウス、8 週間以上古い) 経由で成体の安楽死、直後に慎重に解剖 (外科はさみとピンセットを使用して) 精巣上体覆う結合組織や脂肪の無料、Bouin の定着剤に浸すソリューション (> 10 倍ボリューム/組織重量) 一晩固定用。</li>
	<li>2 日間 2 × 変更 70% エタノールをティッシュを毎日洗うし、浸潤およびパラフィン ブロックを埋め込むのための準備として傾斜エタノール (70%、95%、100%) を脱水します。</li>
	<li>4-6 μ m との免疫蛍光染色の準備のスライド マウントの厚さでパラフィン ブロックをセクションします。</li>
	<li>ヒューム フードの組織切片 (3 × 5 分たびに) を完全に没頭するスライドの瓶にキシレンの十分な量を追加することで精巣上体のパラフィン切片を dewax します。</li>
	<li>ティッシュ セクションを精製 H2O で希釈した傾斜のエタノール溶液に浸漬して水分補給 (100% エタノール 100% エタノール 90% エタノール エタノール 80%、70% のエタノールの 1 分 1 分 5 分 5 分 1 分、50% エタノール 1 分)。</li>
	<li>十分なリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 全体の組織切片を完全に没頭すると 5 分のために一度スライド jar ファイル内のセクションを洗う (すべての後続洗浄手順に従う)。</li>
	<li>適切な抗原検索ソリューションをデカント (すなわち。, 10 モル/L のクエン酸ナトリウム、50 ミリ モル/L トリス pH 10.5 または検出する抗原によって、代替抗原検索の解決法) スライド ラック、沸騰するまで電子レンジに。このソリューションにスライドの組織切片を対象 (表 1参照) 個々 の抗体のために最適化された熱による抗原検索条件。 注意: は、スライド、抗原検索プロセス中に抗原検索ソリューションに完全に浸すことを確認します。</li>
	<li>部屋の温度、電子レンジ、クールからスライド コンテナーを削除します。</li>
	<li>PBS でスライドをすすぎ、ティッシュ セクションまわりトレースする液体撥スライド マーカー ペンを使用します。</li>
	<li>(コンテナーの基地で湿らせたティッシュによって作成された)、加湿コンテナーにスライドを配置し、ブロック ソリューションを適用 (3 %bsa/PBS、以前フィルター 0.45 μ m のフィルターを通して) 37 ° C で 1 時間</li>
	<li>PBS で一度スライドをすすいでください。</li>
	<li>セクションをフィルター処理された 1% で実験的に最適化された濃度に希釈して適切な一次抗体とインキュベート BSA/PBS 一晩の 4 ° C で (アンチ DNM1、DNM2 と DNM3 の 1: 60 抗体; 抗 ATP6V1B1 抗体の 1: 100材料の表を参照してください抗体の詳細について)。 注: を区別する特定非特異抗体の結合からそれ含める必要は厳しい負 (すなわち。、二次抗体のみ、一次抗体ペプチドを免疫に対して preabsorbed) とポジティブ コントロール24。</li>
	<li>30 分間室温で配置することによって、スライドを rewarm します。</li>
	<li>10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。</li>
	<li>セクションを 1% で希釈した適切な二次抗体とインキュベート BSA/PBS (0.45 μ m フィルターで濾過) 1 h 37 ° C で (1: 400 すべての二次抗体の希釈は、抗体については、材料の表を参照)。 注意: この手順以降から暗闇の中スライド コンテナーを保持します。デュアル ラベルは、二次抗体の互換性のある組み合わせを選択 (すなわち。、二次抗体が異なる種で提起されている必要があります)。</li>
	<li>10 分間振動プラットホーム (60 rpm) の PBS でスライド 3 × を洗ってください。</li>
	<li>Propidium ヨウ化 (PI、7.48 μmol/L) または 4΄、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、4.37 μmol/L) 細胞核をラベルするために室温で 2 分間でセクションを counterstain します。</li>
	<li>5 分間振動プラットホーム (60 rpm) のスライドを PBS で 2 回洗います。</li>
	<li>10% Mowiol 4-88 は 0.2 mol/L トリス (pH 8.5) の 30% のグリセロールの解決の準備セクションをマウントおよび 2.5 %1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-オクタン。</li>
	<li>爪ニス coverslip をシールし、将来の観測のための 4 ° C でスライドを保存します。 注意: 画像スライドのできるだけ早く実用的な蛍光の過剰な損失を避けるために準備の後を実行することをお勧めします。</li>
</ol>2 分離、マウス精巣上体頭 (図 3) から Epididymosomes の
<ol><li>CO2吸入 (スイス マウス生後 8 週間以上) 経由で成体の安楽死、直後に加温した PBS (37 ° c) 精巣組織の血液汚染を最小限に抑えることで、血管を灌流します。 注意: 血漿には epididymosomes25に同じようなサイズであるエクソソームの多様な集団が含まれています。精巣組織から血中滞留性をアクセスことができます、最初のセグメントの検査を介して高度に血管精巣上体セグメント位置頭セグメントに近位 (すなわち、ゾーン図 1Aの 1)。</li>
	<li>慎重に表面の任意の可能性を減らすために変更された結びつけること、ウィッテン、ウィッティンガムの媒体 (BWW; pH 7.4 では、300 ミリ モル/kg 水26,27の浸透圧) を覆う脂肪・結合組織、リンスの無料の精巣上体を解剖します。血液汚染。</li>
	<li>しみの余分なメディアを削除、精巣上体頭を解剖する精巣の組織 (すなわち。、ゾーン 2-5、図 1 a) と BWW 媒体を含んでいる新鮮なペトリ皿 (35 × 10 mm) に移転。培地の量が最終的な回復のために十分であることを確認します。 注: 6 頭 epididymides のお勧めは、均等に分割し (手順 2.9 参照) 2 の事前に用意されたグラデーションの上に適用される ~ 900 μ L の回復を可能に 1.1 mL の培地を使用します。</li>
	<li>かみそりの刃で頭組織に小切開の数を作る。組織をミンチし、過度のゾル性細胞質の内容とサンプルの汚染を避けるためにしません。内容をリリースする 30 分の 37 ° C で軽度の動揺と組織を含むプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>細胞の残骸を削除する 70 μ m の膜を通して得られた懸濁液をフィルター処理します。</li>
	<li>濾液を収集し、これを対象細胞残屑を除去するために速度を増加すると 4 ° C で連続遠心分離手順 (すなわち。、500 × g、2,000 × g、4,000 × g、8,000 × g、5 分ごと。17,000 × g 20 分と最後に 17,000 × gさらに 10 分間、または遠心分離後ペレットが形成されない)。 警告: 最小限の血液汚染があることを確認する最初の 500 × g遠心分離のステップ後ペレットの色を評価するために重要です。このペレットにピンクの着色が表示されます任意のサンプルを破棄します。</li>
	<li>0.25 mol/L ショ糖と 10 ミリ モル/L トリス (pH 7.5) の溶液で希釈 (60% (w/v) 水溶液 iodixanol から成る) 密度勾配媒体によって不連続 iodixanol の勾配 (層を構成する 40%、20%、10%、5%) を準備します。</li>
	<li>450 μ L (図 3) の各分画の超遠心機チューブ (11 × 35 mm)、グラデーションを準備します。精巣上体液サンプルをロードする前にそれぞれの層の間のインターフェイスが正常に形成されることを確保するため、各分画のアプリケーション後、グラデーションを目視で確認します。ただし、利用日に各グラデーションの新鮮なを準備、精巣上体管腔液サンプルを読み込み前に 2 h まで 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>精巣上体管腔流体サスペンション (3 epididymides の頭からの材料を収集に対応する) の上に単一勾配の 450 μ L を慎重に追加します。</li>
	<li>超遠心機 4 ° C、18 h で 160,000 × gでグラデーション。 注意: この遠心分離が行われるので非常に高速で、すべての超遠心機チューブ ペア、正確にバランスの取れた。チューブの整合性を損なう可能性がある目に見える傷がないことを確認するを確認します。</li>
	<li>12 の等しい分数 (それぞれ 185 μ L から成る) を慎重に取り外します最上部層から始まって、グラデーションの下の方へ進んでいます。該当する場合、各グラデーションから回復した同等の端数 (最大 2 つのグラデーション) をプールします。 Epididymosomes 最も高い分数 9 1122で濃縮されマウスの注意:図 4との議論を参照してください。</li>
	<li>回復および 9-11 の分数のプール後 100,000 × gで 3 h の 4 ° C (13 × 56 mm チューブ) ペレット、epididymosomes へのサンプルを 2 mL の PBS の超遠心機に希釈します。 注意: epididymosome ペレットを参照してくださいすることは困難にすることができます、のでとローターに配置されます epididymosome ペレットの妊娠中の位置を示す管をマーク指摘チューブの向きを確認します。各管に十分な量が含まれていることを確認 (すなわち。、その総容量の 50% を超える) 管の崩壊のリスクを排除します。</li>
	<li>慎重に吸引、epididymosome ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。</li>
	<li>Epididymosome 純度 (図 4) を評価します。</li>
	<li>下流のアプリケーションに応じて必要な媒体に epididymosome ペレットを再懸濁します。例えば、BWW 媒体は通常精子あるいは SDS ページ経由で精巣上体のプロテオームの解像度のための準備の適切な換散バッファーと共同の孵化にかかわる実験使用されます。</li>
</ol>3. 蛍光 mECap18 細胞の染色
<ol><li>(セル文化フードで行われる) に滅菌 coverslips の準備<ol>
<li>10 分の 70% エタノールに coverslips (12 × 12 mm) を浸漬し、エタノールのランプの上の高温乾燥で消毒します。</li>
		<li>10 の coverslip のクールな s 12 ウェル プレートに転送する前に。</li>
		<li>滅菌したポリ-L-リジン溶液、coverslip をカバーし、室温で 10 分間のために解決を適用します。</li>
		<li>ポリ-L-リジン液を捨て、洗浄滅菌 H2O coverslip または適切な媒体。</li>
	</ol>
</li>
	<li>準備 mECap18 セル<ol>
<li>2 × 105 mECap18 細胞、coverslips を含む 12 ウェル プレートの各ウェルの因数を通路します。</li>
		<li>MECap18 セル中程度 (1 %l-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシンと 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN DMEM) 含む 10% ウシ胎仔血清 (FBS 雰囲気 5% の下で 37 ° C の定温器で) の細胞を培養します。CO2一晩。</li>
		<li>セルは、coverslip に従う、培地を除去、PBS で 2 回細胞をすすいでください。</li>
		<li>全体 coverslip を浸し、15 分間室温でセルを修正する PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の十分な量を追加します。</li>
		<li>PFA 液を捨て、PBS で 2 回、coverslips をすすいでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫蛍光染色<ol>
<li>0.1% 浸漬によって mECap18 セルを permeabilize トリトン X-100 10 分 PBS で。</li>
		<li>PBS で coverslips をすすいでください。</li>
		<li>3 %bsa を用いた mECap18 細胞をブロックし、精巣組織のセクションで説明したのと同じプロトコルを利用した細胞の反応を続行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. エアコン細胞培養液からのタンパク質の単離
<ol><li>調節された細胞培養培地のコレクション<ol>
<li>6 の 4 × 105 mECap18 細胞の通路因数も 10% を添加した mECap18 細胞用培地板 24 h の FBS。</li>
		<li>残留 FBS および関連を削除する (FBS を使わず) mECap18 細胞用培地と mECap18 細胞を 3 回洗浄蛋白質の汚染物。</li>
		<li>各ウェルに mECap18 細胞用培地 (FBS を使わず) 1.5 mL を追加し、37 ° C の定温器 5% 未満で 12 h の mECap18 細胞と孵化 CO2。 注: このステップで mECap18 細胞は、実験デザインによると別のターゲット抗原を評価できます。</li>
		<li>12 時間培養後細胞培地とすべての細胞の破片を削除する 10 分間 2,000 × gで遠心分離を収集します。 注: 孵化の持続期間は実験デザイン/エンドポイント評価に従ってと応用治療細胞の耐性を考慮して変更することができます。最適な結果を達成していることを確認する特定の実験的レジメンに基づいて孵化のタイミングを調整することをお勧めします。</li>
		<li>標準トリパン ブルー色素排除試験28のアプリケーションを介して mECap18 セル実行可能性を評価します。細胞生存率が減った死亡または瀕死の細胞から放出されたタンパク質によって導入されたバイアスを除去するために 90% 以下すべての材料を破棄します。</li>
		<li>細胞用培地からの蛋白質を次のように分離または-80 ° C で媒体を維持</li>
	</ol>
</li>
	<li>(発煙のフードで行われる) に蛋白質の隔離<ol>
<li>80% ボリューム調節細胞用培地培養 mECap18 細胞から放出されたタンパク質を沈殿させるに冷蔵 100% トリクロロ酢酸量の 20% を追加します。一晩で定数混合 4 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>培養後、遠心分離によって沈殿したタンパク質をペレット (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。 注意: 蛋白質中に分泌され、期待の限定数量により、ペレットがないは遠心分離後も容易に視覚化することが可能は。したがって、遠心分離前にチューブをオリエンテーションし、上澄みの削除中に妊娠中のペレットの場所を邪魔しないように世話を正しくすることが不可欠です。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、再遠心分離前に冷やしたアセトンで 2 回餌を洗浄 (17, 000 × g, 10 min. の 4 ° C)。</li>
		<li>慎重に取り外し、ヒューム フード内の任意の残留アセトンを乾燥する前に上澄みを廃棄します。</li>
		<li>完全な分泌タンパク質プロファイルおよび/または個々 のターゲット蛋白質を検出するエンドポイント分析に備えて適切な抽出バッファーで蛋白ペレットを再懸濁します (e.g。、SDS-PAGE、イムノブロット)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

これらの研究には、パラフィン包埋、セクショニングの標準プロトコルにさらされていたブアン固定精巣組織の使用が組み込まれています。ブアン固定液には、具体的かつ相補的な機能を持つ各コンポーネントにホルムアルデヒド、ピクリン酸と酢酸の混合物が装備されています。したがって、タンパク質の架橋結合を形成する第一級アミンと反応してホルムアルデヒドが、ピクリン酸はゆっくりと塩を形成する組織を浸透し、それ故の基本的な蛋白質と逆に、酢酸凝固は急速に組織を浸透しの凝固を引き起こす核酸。これらの複合プロパティは、形態学的詳細の保存に最適な固定液として Bouin を奇形し、その使用が副睾丸の文献で広く報告されます。ただし、Bouin のソリューションはターゲット抗原を隠す可能性があります傾向定着性誘起蛍光性とホルムアルデヒドによる架橋を含む、制限なしではありません。
背景の蛍光性の可能性を要する厳しいマイナス コントロールを使用、一次抗体、二次抗体の省略の省略を含む私たちの研究と、試薬があります、一次抗体の使用そこから生成された免疫になるペプチドに対する preabsorbed。このようなコントロールのアプ...

すべての哺乳類の種の精子を取得前方の進歩的な運動を表示して精巣上体、可能性があります男性の精巣余分なダクト システムの専門性の高い領域での長期にわたる降下中に卵子を受精する可能性7-14 日 (種) によって移動するを取る1。父系クロマチンの極端な凝縮と精巣内精子の分化に伴う細胞質の多数の放出のための後続の機能的成熟はの相互作用によってのみ駆動します。精巣微小環境。この環境は、ライニング精巣上体相馬の分泌・吸収活動によって作成され、ターンでは、セグメント バリエーション1の例外的なレベルが表示されます。したがって、タンパク質の合成と分泌の面で最もアクティブなセグメント、精巣上体 (すなわち、頭とコーパス)2の近位部にあります。このアクティビティ ミラー機能の能力の特徴を表示する最初の細胞と精子の機能のプロファイル (すなわち、進歩的な運動とするソーナの酸可溶性糖タンパク質に結合する機能) 次の。3頭精巣上体を通過。これらの機能的な属性は精子射精のための準備で静止状態で格納される前記遠位精巣上体セグメント (バーニャカウダ) に到達、最適なレベルに達する前に開発し続けます。形成とこの精子の貯蔵貯蔵所の維持は、馬尾の強い吸収活動4,5によって支配される粘膜上皮とも密接に結びついて。このような地域ごとの分業が哺乳類の種の大半の間で共有される精巣上体の特徴的な表示されます解剖学的違いは、報告された6,7、8をされていますが、私たち自身の9,10を含む日付を検討した.確かに、それ臨床的観点からは、精巣機能障害男性因子不妊11、こうしてこの専門組織の規制を理解することの重要性を強調の病因に重要な貢献を作ることが知られています。
したがって、精巣上体の生理学の私達の理解と精子の成熟とこの組織内のストレージの連続相を調節するメカニズムが完全に解決するに残っているは残念です。貢献の要因の間で精巣上体の研究の進歩に制限は、この組織の全体的な複雑さとその内腔の微小環境を規制制御メカニズムの知識です。解剖学的, 我々 は知っている、頭、コーパスと馬尾のセグメントの区別を超えて精巣上体 (図 1 a) いくつかのゾーンに細分されることができます、各隔壁12で区切られた、遺伝子/タンパク質の離散分布によって特徴付けられる式13,14,15,16,17,18。確かに、詳細な精巣上体における分節遺伝子発現の転写プロファイリング、に基づいてできるだけ多く 6 と 9 の精巣上体ゾーンはマウスおよびラットのモデルは、それぞれ19,20で報告されています。このような複雑さはおそらく精巣上体の相馬、偽重層上皮を構成する多数の異なったセルタイプ。 の組成を反映しています。管の長さに沿って豊富、配布および分泌・吸収活動に関してはそれぞれ異なります。したがって、主細胞は、これまでで、最も豊富な精巣細胞型を構成するすべての上皮細胞の 80% 以上。したがって、主細胞、精巣上体のタンパク質生合成と分泌5の大半を担当。対照的に、精巣上体の相馬内で 2 番目の最も豊富なセル型としてランク付けする、明細胞の人口主に内腔のコンポーネントの選択的吸収と5本の微小環境の酸性化に関与しています。男性ホルモンおよび精巣の起源の他の lumicrine の要因を出す管に沿って自分の位置によってこれらの精巣細胞型の差動制御の複雑さの別の層を追加するには。
このような複雑さの制限にもかかわらず重要な侵害は精巣機能のメカニズムの基礎を解決するのに行われ続けます。これらの研究のキーは、これらの初期調査の中から選択した個々 のタンパク質の詳細な分析とタンデムで精巣上体のプロテオームの幅広く在庫を確立する高度な質量分析戦略のアプリケーションをされています。このアプローチの例が、そこマウス モデル21で mechanoenzymes 族の私たちの最近の評価。そこで我々 の初期の関心は、エキソおよびエンドサイトーシス プロセスのカップリングにそのデュアル アクションによって支えられていた。そこ (DNM1 - DNM3) の 3 つの標準的なアイソ フォームがマウス精巣上体で高発現し、タンパク質の分泌と吸収21 における調節的役割を果たすために適切に配置されていることを示すことができたこれらの観察結果を踏まえ、.また、できた明確に各細胞と細胞内局在、に基づいてそこにアイソ フォームを区別するために示唆精巣上皮21内の冗長、アクティビティではなく、相補的な所有しています。
ここでは、採用希望この情報が精巣上体、代替タンパク質の特性でより広いアプリケーションを見つけるに貢献するためにマウスの精巣上体におけるそこ発現の研究のため実験方法について述べる、男性の生殖管のこの重要な要素の機能を理解します。具体的には、堅牢な蛍光ラベリング パラフィン精巣切片の標的タンパク質と蛍光抗体法によってこれらの蛋白質の分布の後続の検出手法の開発について述べる顕微鏡検査。我々 はさらに私たち最近最適化されたプロトコルの22の単離と解析 epididymosomes; を文書化します。小さなエキソソームのような小胞精巣の分泌プロファイルの重要な要素を構成する、精子成熟23を促進する上で重要な役割を保持するために表示されます。補完的なアプローチとしても述べる不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出および精巣上体の規制を探索するためのモデルとしてこのリソースの使用分泌活動体外。

<table><tbody><tr><td>ダイナミン 1 抗体</td><td>アブカム</td><td>ab108458</td><td><ストロング>宿主種</ストロング>: ウサギ、<ストロング>アイソタイプ</ストロング>: IgG、<ストロング>クラス</ストロング>: ポリクローナル</td></tr><tr><td>ダイナミン 2 抗体</td><td>サンタクルス</td><td>sc-6400</td><td><ストロング>宿主種</ストロング>: ヤギ、<ストロング>アイソタイプ</ストロング>: IgG、<ストロング>クラス</ストロング>: ポリクローナル</td></tr><tr><td>ダイナミン 3 抗体</td><td>プロテインテック</td><td>14737-1-AP</td><td>宿主種: ウサギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル</td></tr><tr><td>ATP6V1B1抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>宿主種: ヤギ、Isotype: IgG、Class: ポリクローナル</td></tr><tr><td>CD9抗体</td><td>BDファーミンゲン</td><td>553758</td><td><強い>宿主種</強い>:ラット、<強い>同型</強い>:IgG、<強い>クラス</強い>:モノクローナル</td></tr><tr><td>フロチリン-1抗体</td><td>シグマ</td><td>F1180</td><td><強い>宿主種</強い>:ウサギ、<強い>同型</強い>:IgG、<強い>クラス</強い>: ポリクローナル</td></tr><tr><td>ALOX15抗体</td><td>アブカム</td><td>ab80221</td><td>宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>TUBB抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>宿主種:マウス、Isotype:IgG、Class: モノクローナル</td></tr><tr><td>PSMD7抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>宿主種:ウサギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ウサギ Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class: ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ヤギアレクサフロー488サー</td><td>モ</td><td>A11055</td><td><強い>宿主種</強い>:ロバ、<強い>同型</強い>:IgG、<強い>クラス</強い>:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ヤギアレクサフロー594</td>サー<td>モ</td><td>A11058</td><td><強い>宿主種</強い>:ロバ、<強い>同型</強い>: IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ラットAlexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ウサギHRP</td><td>ミリポア</td><td>DC03L</td><td>宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗ラットHRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>宿主種:ヤギ、Isotype:IgG、Class:ポリクローナル</td></tr><tr><td>抗マウスHRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>宿主種:ヤギ、Isotype: IgG、<ストロング>クラス</ストロング>:ポリクローナル</td></tr><tr><td>4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)</td><td>シグマ</td><td>D9564</td><td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ化プロピジウム(PI)</td><td>シグマ</td><td>P4170</td><td></td></tr>モ<tr><td>ビオール4-88</td>カル<td>バイオケム</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>ボボゲン</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモ</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモ</td><td>25030-081</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモ</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&α;-アンドロスタン-17&ベータ;-オール-3-oneC-IIIN</td><td>シグマ</td><td>A8380</td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>サーモ</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-エチレンジアミン四酢酸酸性(EDTA)</td><td>シグマ</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWRケミカルズ</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>VWRケミカルズ</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>シグマ</td><td>P4417</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>アストラル</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1、4-ジアザビシクロ-(2.2.2)-オクタン</td><td>シグマ</td><td>D2522</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>-L-ギジン</td><td>シグマ</td><td>P4832</td><td></td></tr>トリ<tr><td>トンX-100</td><td>シグマ</td><td>78787</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>シグマ</td><td>T6146</td><td></td></tr>トリ<tr><td>クロロ酢酸</td><td>シグマ</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマ</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>ポリ (ビニルアルコール)</td> <td>シグマ</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Ajax ファインケム</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep 密度勾配 ミディア</td>ム <td>シグマ</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ヘラセル</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>大型オービタルシェーカー</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>ラボ用 pHメーター</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>撥液スライドマーカー</td><td>大同産業</td><td>ミニ</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモ</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>マイクガラス</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & マイクロ;m フィルター</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes ダストフリーペーパー</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ (2.2 ml, 11 &times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ (3.2 ml, 13 &times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 & micro;メートル</td>ナイロン<td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿35 &times; カム付き10ミリメートル</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>ジャーTRAJAN#</td><td>23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

哺乳類の精巣上体は後精巣の成熟と精子のストレージをサポートするためにすべての内分泌腺の最も複雑な管腔内流体のいずれかを生成します。このような複雑さは、粘膜上皮細胞の結合分泌・吸収活動のため発生します。ここでは、ダイナミン (そこ) mechanoenzymes; のモデル蛋白質家族に焦点を当てた精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析手法について述べる大規模な低分子量 g 蛋白質双方向膜人身売買イベントを規制する可能性があります。精巣組織の蛋白質の表現の検討, 蛍光ラベリング パラフィン埋め込まれたセクションの標的タンパク質とを介してこれらのタンパク質の分布の後続の検出のための堅牢な方法論について説明します。蛍光顕微鏡検査。分離と小胞、成熟精子細胞と細胞間のコミュニケーションに参加する精巣の内腔に分泌する epididymosomes として知られているようなエキソソームの特性の最適化手法についても述べる。補完的なアプローチとして SV40 不死化マウス頭精巣上皮 (mECap18) の細胞ラインのターゲット蛋白質の蛍光検出について述べる。さらに、精巣の分泌活性の調節を探索するために適した体外モデルとして mECap18 細胞株の有用性について論じる。この目的のため培養 mECap18 細胞株およびその分泌タンパク質プロファイルに影響を与えることができる選択的薬理学的阻害療法の使用メンテナンス要件をについて説明します。後者は、SDS-PAGE および免疫ブロット経由で彼らの後の分析、トリクロロ酢酸/アセトンの沈殿物によって分泌された蛋白質の濃度条件培の収穫を使って容易に評価。我々 は、これらの結合方法が精子成熟および/またはストレージの機能的役割の決定へのプレリュードとして代わりとなる精巣上体蛋白質ターゲットの分析に適していると主張します。

図 1と図 2は、マウスの精巣上体頭にそこの局在を蛍光抗体法の代表的な結果を示します。3 そこアイソ フォームの各表示異なるローカライズ プロファイルを検討した.したがって、DNM1 は、(図 2 a) 初期セグメントと頭の精巣上体全体で精巣の細胞の比較的控えめなびまん性ラベルが特徴です。対照的に、DNM2 のアイソ フォームが最初に見つかった最初のセグメント内のセルの反対の基底部および根尖部の国境付近隣接する下流頭セグメント内のセルの核上性ドメインに再配置されている前に (すなわち、。ゾーン 2-5) (図 1B、C)。特に、しかし、徐々 にラベル DNM2 の強度は本質的にこれらの精巣上体セグメント21</sup...

パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18) のためのプロトコルを説明するダイナミンの蛍光抗体法により局在を報告する.また精巣上体液やエアコン携帯メディアから分泌蛋白質の隔離のためのプロトコルについて述べる。

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

この複合マスターは、精子の成熟と貯蔵の調節にどのタンパク質標的が関与しているかなど、精巣上体研究の分野における重要な質問に答えることができます。精巣上体分離技術の主な利点は、異なる種間の表皮の他の領域から同様の集団を分離するためにも適用可能であることです。この手順を開始するには、精巣上体のパラフィン切片をヒュームフードに移します。.スライドジャーに十分なキシレンを追加して、組織切片を完全に浸します。テキストプロトコルで概説されているように、精製水で希釈された段階的なエチノール溶液に組織切片を浸すことにより、組織切片を再水和します。スライドジャーで切片を十分なPBSで5分間洗浄し、組織切片全体を完全に浸します。次に、適切な抗原賦活化溶液をスライドラックにデカントします。溶液が沸騰するまで電子レンジで加熱します。スライドを溶液に完全に浸し、組織切片を熱誘起抗原賦活化溶液にさらします。この後、スライド容器を電子レンジから取り出し、室温まで冷まします。PBSが入った瓶でスライドを5分間すすぎます。撥液加工を施したスライドマーカーペンで、ティッシュペーパー部分の周囲をなぞります。スライドを加湿容器に移します。ブロッキング液を摂氏37度で1時間塗布します。次に、スライドをPBSで一度すすぎます。適切な一次抗体を、ろ過した1%BSA PBSで実験的に最適化された濃度に希釈し、摂氏4度で一晩インキュベートします。スライドを室温に戻した後、スライドをPBSで60RPMの振とうプラットフォームで10分間洗浄します。この洗浄をさらに2回繰り返します。ろ過した1%BSA PBSで希釈した適切な二次抗体を摂氏37度で1時間インキュベートします。ここから先は、スライドを暗闇に置いてください。スライドをPBSで60RPMの振とう台で3回、1回の洗浄につき10分間洗浄します。次に、テキストプロトコルで概説されているように、サンプルを染色、マウント、およびシールします。成体マウスを安楽死させた直後に、精巣上体の血液汚染を最小限に抑えるために、摂氏37度に予熱したPBSで血管系をふんだんに使用します。精巣上体を慎重に解剖し、脂肪や結合組織を覆っていないようにし、改質されたBWW培地ですすいで、表面の血液汚染の可能性を減らします。精巣上体組織を吸い取り、余分な培地を取り除き、頭蓋骨精巣上体を解剖します。次に、解剖した頭蓋精巣上体をBWW培地を含む新鮮なシャーレに移し、培地の量が最終的な回復に十分であることを確認します。かみそりの刃を使用して、頭蓋組織にいくつかの小さな切開を行います。ティッシュをミンチにしないでください。摂氏37度でインキュベートし、軽度の攪拌で30分間インキュベートし、管腔内容物を放出します。70マイクロメートルのメンブレンを使用して、得られた懸濁液をろ過し、細胞の破片を取り除きます。懸濁液を回収し、細胞の破片を除去するために、速度を上げながら摂氏4度で連続的な遠心分離ステップにかけます。次に、テキストプロトコルで概説されているように、不連続なiodixanol勾配を調製します。450マイクロリットルの各画分を使用して、超遠心チューブでグラジエントを調製します。各フラクションが適用された後、勾配を視覚的に検査して、各レイヤー間でインターフェースが正常に形成されていることを確認します。単一のグラデーションの上に450マイクロリットルの精巣上体管液懸濁液を慎重に追加します。160, 000倍のgおよび4°Cで18時間18時間グラジエントを超遠心分離します。遠心分離したグラジエントから、最上層からグラジエントの最下層に向かって進行する12個の等しいフラクションを静かに除去します。該当する場合は、各グラジエントから回収した同等の画分をプールします。9から11までのフラクションを回収してプールした後、それらを2ミリリットルのPBSに希釈します。精巣上体をペレット化するために、100、000倍のgと摂氏4度で3時間サンプルを超遠心分離します。次に、精巣上体ペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に吸引して廃棄します。下流のアプリケーションを行う前に、精巣上体の純度を評価することが不可欠です。滅菌カバースリップを調製した後、カバースリップを含む12ウェルプレートの各ウェルに200,000mEcapの18細胞の通過アリコート。テキストプロトコルに概説されているように細胞を培養します。細胞がカバーガラスに付着したら、培地を廃棄し、PBSで細胞を2回すすぎます。カバーガラス全体を浸漬するのに十分な量の4%パラホルムアルデヒドを加え、細胞を室温で15分間固定します。次に、パラホルムアルデヒド溶液を廃棄し、カバーガラスをPBSで2回すすぎます。すすぎたカバーガラスを0.1 Triton X-100のPBSに10分間浸漬し、細胞を透過食いします。テキストプロトコルに概説されているように、細胞をすすぎ、ブロックし、免疫標識します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、mEcap 18細胞のアリコートを6ウェルプレートに継代します。接着したら、FBSフリーのmEcap 18細胞培地で細胞を3回洗浄し、残留FBSおよび関連するタンパク質汚染物質を除去します。次に、1.5 mLのFBSフリーmEcap 18細胞培地を各ウェルに加えます。摂氏37度のインキュベーターで5%co2の雰囲気下で12時間インキュベートします。この後、細胞培地を収集し、2, 000倍gで10分間遠心分離して、すべての細胞破片を除去します。標準的なトリパンブルー排除アッセイを使用して、mEcap細胞の生存率を評価します。20%容量の冷却した100%トリクロロ酢酸を80%容量の条件細胞培地に加えて、培養mEcap 18細胞から放出されたタンパク質を沈殿させます。摂氏4度で一晩インキュベートし、絶えず混合します。次に、17,000倍のgと摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、タンパク質ペレットを冷やしたアセトンで2回洗います。次に、17, 000倍のgと摂氏4度で10分間再度遠心分離します。上清をもう一度慎重に取り除き、廃棄します。次に、ドラフト内でサンプルを風乾して、残留アセトンを除去します。調査した各DNMIアイソフォームは、異なる免疫蛍光ローカリゼーションプロファイルを示しています。DNMIは、最初のセグメント全体にわたる精巣上体細胞の比較的控えめなびまん性標識と、精巣上体を引き起こすことを特徴としています。DNM2アイソフォームは、最初に最初のセグメントの細胞の対向する基底境界と頂端境界の近くで検出され、その後、隣接する下流の頭蓋セグメント内の細胞の核上ドメインに再配置されます。この標識の強度は、頭蓋骨上体のゾーン2と5の間で徐々に減少し、これは本質的にこれらの精巣上体セグメントの分泌活性を反映しています。その後、DNM2の核上標識は、頭蓋細胞内のゴルジ装置の分布に対応することが見られる。DNM3アイソフォームは、主に少数の頭蓋上皮細胞の頂端ドメインで検出され、認識された明細胞マーカー ATP6V1B1と共標識することにより、明細胞亜集団に対応することが見られます。次に、不死化したmEcap 18細胞株をin vitroモデルとして利用し、精巣上体細胞の分泌活性を研究します。分布パターンは、頭蓋骨精巣上体組織切片に見られるものと一致していると考えられており、DNM1はmEcap 18細胞の細胞質全体で検出され、DNM2はこれらの細胞の核上に集中し、DNM3は小さな亜集団数内の膜染色の個別の病巣によって特徴付けられます。免疫蛍光検出を試みる際には、各抗原の条件を最適化することを忘れないでください。精巣上体集団の分離されたものは、精子との共インキュベーションやファイリングごとのオカルゴ分析など、下流のアプリケーションでの使用に容易に適しており、どちらも精巣上体の精子成熟の調節における精巣上体の役割についての理解を深めるための強力なアプローチです。

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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工場ポリソームプロファイリングのための簡単​​な方法

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病原体関連分子パターンによる精巣上体炎のマウスモデル

学ぶ マウス精巣上体におけるダイナミンの免疫蛍光局在化と分泌タンパク質の分離法。精子成熟と貯蔵の調節に関与するタンパク質標的を解明し、生殖生物学研究への応用可能性を示します。

精巣上体のタンパク質合成と分泌の解析

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