Name: 限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ 限外ろ過遠心分離法を用いてマウスの気管支肺胞洗浄液から細胞外小胞を分離する手法。従来の超遠心法と比較して高純度・高回収率を実現し、小容量サンプルに適した効率的なプロトコルです。

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仕事をサポートするには、(PC) へ NHLBI/NIH 助成金 HL103868 と HL137076 (PC) へ、(PC の場合) にアメリカ心臓協会費と (パソコン) にサミュエル ・ オシン包括的がん研究所 (SOCCI) 肺がん研究賞を受賞。EV ナノ粒子追跡の分析のための Nanosight マシンを提供してくれますヒマラヤスギ シナイ医療センターで Smidt 心研究所に大感謝したいと思います。

動物の使用率および動物のすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイ医療センター (CSMC) でによって承認されました。
1. マウスの気管支肺胞洗浄液 (BALF) コレクションと準備
<ol><li>BALF コレクション<ol>
<li>ケタミン (300 mg/kg) と頚部転位によって腹腔内経路を介してキシラジン (30 mg/kg) のカクテルとマウスを安楽死させます。</li>
		<li>22 G 血管カテーテルを気管に挿入します。氷冷滅菌ダルベッコ リン酸バッファー生理食塩水 (DPBS) の 1 ミリリットル (mL) を含むインスリン注射器を接続し、血管カテーテルを通って両方の肺に DBP の 1 mL を植え付けます。</li>
		<li>BALF を取得し、50 mL の円錐管に、BALF を分注シリンジのプランジャーをゆっくりと撤回します。氷の上の BALF を維持します。</li>
		<li>1.1.2 と 1.1.3 の手順を繰り返します (各マウスの合計で 4 x) x 3。 注: 約 0.8 mL 注入の 1 ミリリットルあたり取得一般的に。また、個々 のマウス (すなわちBALF の 3 mL)、次の手順を実行することができますが、下流の実験で EVs の一貫性を保つのための大きなバッチの分離は、複数の BALF サンプルのプールします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BALF 準備<ol>
<li>25 マウスからの BALF のプール、2 つの等しいセット (因数あたり 〜 35 mL) に分割します。</li>
		<li>遠心分離機 400 × g、5 min のための 4 ° c で BALF の細胞と他の細胞の残骸を削除し、上清を収集します。</li>
		<li>1,500 × g、10 分、4 ° c で上清を遠心分離機、細胞の残骸を削除します。上清を収集し、EV の分離手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離
注: この研究では、2 台の EV 隔離技法には、すなわち UFC と浮力で遠心分離する使用 EVs BALF から。各メソッドの詳細なプロトコルを説明します。
<ol><li>
限外ろ過 (UFC) 遠心分離濃縮法 注: このメソッドは、前述のプロトコル10から変更されました。<ol>
<li>0.2 μ m の滅菌注射器フィルター ステップ 1.2.3 から上澄みをフィルター処理して、氷の上のフィルターの BALF。 注: これはサイズ排除ステップという 200 より小さい小胞だけ nm が収集されます。</li>
		<li>10 分 4 ° C で 10 分間遠心する 1,500 × g で遠心ユニット滅菌 DPBS 100 kDa MWCO 遠心ろ過ユニットを平衡、DPBS を破棄します。 注意: フィルター デバイスの膜は、DPBS と平衡に達したが、一度膜保たれなければならないウェット デバイスが使用されるまでのすべての時間で。</li>
		<li>2.1.1 のステップから BALF サンプル 15 mL でフィルター ユニットと 3,000 x g で 4 ° C で 30 分間遠心を埋めるフロースルー BALF は破棄されまたは別の標準的な管に集め、将来使用するため-80 ° C で保存することができます。</li>
		<li>残り 0.2 μ m フィルター BALF の 2.1.3 のステップを繰り返します。 注: 十分に 35 mL の開始元のボリュームから BALF EVs を集中する遠心の 3 つの繰り返しをかかった。これは 1-1.5 mL 未透過で起因しました。</li>
		<li>によって、繰り返しピペッティング優しく 14 ml 滅菌 DPBS の未透過を洗います。30 分、4 ° C での 3,000 x g でフィルター ユニットを遠心分離機、DPBS を削除し、EV 非透過を集中します。</li>
		<li>総回復を確保するため、サイド ・ ツー ・ サイド動きを使用してサンプルを出し入れフィルター デバイスの下部に、pipettor をすることにより、フィルター デバイスから集中 BALF 派生 EVs を収集します。</li>
		<li>因数 BALF 派生 EVs-80 ° C (手順 3. を参照) さらに粒子定量化及び評価のために格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
浮揚性の密度勾配遠心法 (DGC) で遠心 (UC) 注: 次のプロトコルは、前述のプロトコル24から変更されました。<ol>
<li>2.1.1 のステップから 37 mL 遠心チューブに上清を転送および超遠心機を使用しての 4 ° C で 30 分間、10,000 × g でサンプルを遠心分離します。清と 4 ° C, 60 分で、100,000 × g で遠心分離を収集します。EV のペレットは、遠心分離、ステップ 2.2.3 の浮揚性の密度勾配バッファー (表 1) の異なる濃度を準備します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、200 μ L の DPBS で EV ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>50 %iodixanol 作業ソリューション (表 1) の 300 μ L と EV の懸濁液を混合し、15 mL 遠心管にそれを転送します。50% iodixanol EV 混合サスペンション上に順番に層下部から上部への順序で次のバッファー ソリューション: 30 %iodixanol (4.5 mL) iodixanol (3 mL)、15 %iodixanol (2.5 mL)、および 5 %iodixanol (6 mL) の 25%。230 分の 4 ° C で、100,000 × g で遠心します。 注: 浮揚性の密度勾配が下部上部に最低濃度 (5%) に最高濃度 (50%) とスケーリング iodixanol の割合に基づいています。Iodixanol の異なる濃度を生成するには、実用的なソリューション (50 %iodixanol) 混ぜ均質媒体 (表 1) の様々 な量。</li>
		<li>15% と 25% の割合を収集し、15 mL にボリューム アップさせる滅菌 DPBS でそれらを希釈します。新しい小型超遠心機チューブと 60 分のための 4 ° C で、100,000 × g で遠心分離機に転送します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、さらに特性評価のための滅菌の DPBS の 50 μ L で EV ペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞小胞の定量化
注: BALF 派生 EVs 回復収量は 2 つの指標を量的に表わされます。
<ol><li>ナノ粒子追跡測定分析 (国税庁)<ol>
<li>1: 200 で EV サンプルを希釈-DPBS と負荷インスリン注射器にサンプルの 1 mL の 1: 500。サンプル シリンジをシリンジ ポンプに接続し、粒子数とサイズ (材料の表を参照) を測定し始めます。</li>
		<li>すべてのサンプルの測定を 1 14 と検出のしきい値でカメラのレベルを設定します。30 で 1,500 フレームの反復測定値 5 s は 20 の遅延で、各サンプルの記録された読み取りの間 s。組み合わせて、最終濃度とサイズの報告のデータを平均します。 注: 正確なすべての粒子をキャプチャするすべての粒子を視覚化し、同様の設定を使用して、各実験ではすべてのサンプル測定のために適切なカメラのレベルを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテインの定量 注: ビシンコニン酸 (BCA) の蛋白質の試金は BALF から派生した EVs のタンパク質濃度の測定に使用されました。<ol>
<li>1 x 換散バッファーの EV サンプルを可溶化します。</li>
		<li>560 で吸光度を測定することにより比色検出を使用して BCA 標準プロトコルごと BALF から派生した EVs の蛋白質の量を定量化するプレート リーダーで nm。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. BALF 由来細胞の小胞の検出
注: 通称エキソソーム表面のマーカー蛋白質 (TSG101 や CD63、CD81、CD9) SDS ページとイムノブロットおよび流れの cytometry による EV のリカバリを確認する使用されました。
<ol><li>SDS-PAGE および免疫ブロット<ol>
<li>あぶらとり読み込みバッファー (リチウム dodecyl 硫酸塩) と 1.6 mL チューブの 50 mM ジチオトレイトール (DTT) で各サンプルの EV 蛋白質の同量を溶解します。70 ° c 10 分のサンプルを加熱します。</li>
		<li>4-12% に加えて、Bis トリス アクリルアミドゲル ステップイン 4.1.1 からサンプルをロードし、電気泳動の実行 (150 v、35 mA) 35 分。</li>
		<li>乾式転写法による硝酸セルロースの膜に蛋白質を転送します。</li>
		<li>60 分、常温 (RT) ロッキング 5% スキムミルクと膜をブロックします。</li>
		<li>5 %bsa でトリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20 (TBST) 一晩揺動、4 ° c で 1: 500 希釈で EV 表面タンパク質マーカー、腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101) への抗体と膜を孵化させなさい。</li>
		<li>次の日、洗って膜 3 x、10 分それぞれ TBST バッファーで洗うし、反ウサギ IgG、室温 60 分 1:5,000 希釈で、HRP リンク抗体とインキュベート</li>
		<li>3 膜を洗浄する x、10 分 TBST バッファーで、それぞれを洗います。化学発光 HRP 抗体検出試薬とイメージ (イメージング システムの材料の表を参照) を持つ膜を開発します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローサイトメトリー<ol>
<li>BALF から派生した EVs の能の両面染色バッファー (PBS + 5 mM EDTA + 0.5 %bsa、0.1 μ m のシリンジ フィルター膜濾過) 49 μ L で希釈します。</li>
		<li>それぞれの個々 のサンプルに次の抗体の各追加: 1) ラット抗マウス PE CD63 抗体 (100 ng の反応あたり);2) ラット抗マウス PE CD81 (500 ng);3) ラット抗マウス FITC CD9 (200 ng)。暗闇の中で 60 分間揺動、4 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>染色バッファー膜フィルターの能の両面の 450 μ L のサンプルを希釈し、フローサイトメトリー解析のサンプルを対象 (材料の表を参照)25。</li>
		<li>次のように流れの cytometer 設定を調整する: 1) ハイパー ログ (hlog); すべてのチャンネルを設定2) セット 4; で SSC のトリガー3) セカンダリ トリガーをオフにします。低速設定でサンプルを実行し、各サンプルの少なくとも 10,000 のイベントを取得します。</li>
		<li>解析ソフトウェアを使用して各サンプルの低フローサイトメトリー分析を実行 (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).</li>
<li>Kosaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+Mechanisms+and+Intercellular+Transfer+of+MicroRNAs+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+lung+microenvironment+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis.</a> Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Janowska-Wieczorek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+derived+from+activated+platelets+induce+metastasis+and+angiogenesis+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer.</a> International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).</li>
<li>Valadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+Secretion%2C+and+Intercellular+Interactions+of+Exosomes+and+Other+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).</li>
<li>Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. <a target="_blank" href="http://tcr.amegroups.com/article/view/16316/html">Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy.</a> Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).</li>
<li>Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+systems+for+exosome+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated systems for exosome investigation.</a> Methods. 87 (1), 31-45 (2015).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).</li>
<li>Inglis, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+improve+detection+and+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).</li>
<li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li>
<li>Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Exosome-Based+Therapeutics%3A+Isolation%2C+Heterogeneity%2C+and+Fit-for-Purpose+Potency%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Vergauwen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+of+ultrafiltration+and+protein+analysis+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).</li>
<li>Kesimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+exosome-like+vesicles+released+from+human+tracheobronchial+ciliated+epithelium%3A+a+possible+role+in+innate+defense%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense.</a> The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).</li>
<li>Torregrosa Paredes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+fluid+exosomes+contribute+to+cytokine+and+leukotriene+production+in+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma.</a> Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).</li>
<li>Alipoor, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Exosomal+miRNA+in+Respiratory+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases.</a> Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).</li>
<li>Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+Immunoregulation+of+Chronic+Lung+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases.</a> Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).</li>
<li>Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).</li>
<li>Minciacchi, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+Mediates+Large+Oncosome-Induced+Fibroblast+Reprogramming+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).</li>
<li>Koliha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Affects+the+Composition+of+Blood+Cell-Derived+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles.</a> Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+microvesicles%3A+extracellular+vesicles+for+genetic+information+transfer+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.</a> Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).</li>
<li>Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+it+out%3A+Regulation+of+exosome+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Sorting it out: Regulation of exosome loading.</a> Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527, 329-335 (2015).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exosome+Total+Isolation+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Exosome Total Isolation Chip.</a> ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+ExoSearch+Chip+for+Multiplexed+Exosome+Detection+Towards+Blood-based+Ovarian+Cancer+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+a+microfluidic+chip+for+immunocapture+and+quantification+of+circulating+exosomes+to+assist+breast+cancer+diagnosis+and+molecular+classification%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification.</a> PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).</li>
<li>Kornilov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+ultrafiltration-based+protocol+to+deplete+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell-derived+exosomes+prevent+cardiomyocytes+apoptosis+through+exosomal+miR-21+by+targeting+PDCD4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4.</a> Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).</li>
<li>Agarwal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental%2C+Systems+and+Computational+Approaches+to+Understanding+the+MicroRNA-Mediated+Reparative+Potential+of+Cardiac+Progenitor+Cell-Derived+Exosomes+From+Pediatric+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients.</a> Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).</li>
<li>Merchant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfiltration+isolation+of+human+urinary+exosomes+for+characterization+by+MS%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS.</a> PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).</li>
<li>Gouin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+method+for+identification+of+suitable+reference+genes+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).</li>
<li>Betsuyaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Granule+Proteins+in+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+from+Subjects+with+Subclinical+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).</li>
</ol>

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過去数十年間、科学者は生体のホメオスタシスの EVs の意義を解明しています。EVs がその生理活性貨物分子1,21,22,26,27を近隣や遠くの細胞を調節することによって多くの病気プロセスに大きな役割を果すより重要なは、,28,29,30未来の開発し、この分野の進歩は深く信頼性に頼ると識別し分離だけでなく効果的な方法 EV 人口のサブセットを修正がまた下位アプリケーションにその生物学的機能を維持する。10,<sup class="xre...

エクソソームは、EVs を, 直径 50-200 nm の最小サブセット、シグナリング プロセス1,2,3,4、5の多様なアレイにまたがって複数の生物学的機能を持っています。彼らは主に脂質、蛋白質および核酸6,7,8,9 など貨物分子を介して細胞間コミュニケーションを促進することで細胞およびティッシュの恒常性を支配します。.EV 研究の 1 つの重要なステップは、分離プロセスです。差動遠心 (UC)、密度勾配遠心法 (DGC) の有無は金標準的なアプローチが、この方法には非効率的な EV 回収率と低いスケーラビリティ10などを含む、主要な制限事項,11,12、それは細胞培養上清または高エキソソーム生産試料などの大きなボリューム サンプルへ最高の利用を制限します。利点と限外ろ過、クロマトグラフィー、ビーズや、列ごとマイクロ流体、immunoaffinity 分離サイズ排除など、他の方法の不利な点はよく記述されているとする現代の補足的な手順が開発されて克服し、各アプローチ11,12,の13,14,15の技術的制限を最小限に抑えます。他は UC のメソッド16,17,18に匹敵する純度を提供する代替手法であるフィルター ユニットのナノポーラス膜の限外ろ過遠心分離 (UFC) 示されています。この手法は、代替の分離方法の一つとして考えられます。
気管支肺胞洗浄液 (BALF) では、さまざまな呼吸器の条件19,20,21,22に多数の生物学的機能を持つ EVs が含まれます。BALF 派生 EVs が伴います洗浄回収の限られた量と同様に、ヒトでは、気管支鏡検査手順の侵襲によるいくつかの課題を勉強しています。マウスなどの小型実験動物、数ミリリットルのみ正常肺条件で回復することができます、炎症や線維化肺23より。その結果、下流用差動遠心による BALF の EV の分離のための十分な量を収集できないことがあります。ただし、正しい EV 集団を分離は、EV の生物学的機能を研究するための重要な要因です。効率と効果の微妙なバランスは、よく確立された EV 分離方法に挑戦を続けています。
この現在の調査を示す 100 kDa 分子量カットオフ (MWCO) ナノ膜フィルター ユニットを利用した遠心限外濾過法アプローチは BALF など少量の生体試料に適している.この手法は、簡単に効率的と高純度および BALF 由来の電気自動車の研究をサポートするための拡張性を提供します。

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15遠心フィルターUltracel-100K</td><td>シグマミリポア、セントルイス、ミズーリ州</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>コーニングセルグロ、マナッサス、VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマミリポア、セントルイス、ミズーリ</td>州<td>EMD8550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Research Products International、Prospect、IL</td><td>75277-39-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning Cellgro、Manassas、VA</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Millipore、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>Sigma-Millipore、セントルイス、ミズーリ</td>州 <td>MKCD9753</td><td>密度勾配中ケ</td></tr><tr><td>タミン</td><td>VetOne、ボイジー、ID</td><td>13985-702-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health, Lake Forest, IL</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 1 mL</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter 20 G</td><td>BD Syringe, Franklin Lakes, NJ</td><td>381703</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 15 mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 50 mL</td><td>Corning Cellgro, Manassas, VA</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>ビシンコン酸(BCA)タンパク質アッセイ</td><td>Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody</td><td>AbCam, Cambridge, MA</td><td>AB125011</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウスPE-CD63</td>抗体<td>Biolegend, San Diego, CA</td><td>143904</td><td></td></tr><tr><td>CD81</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Reducing agent (Bolt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Lysis buffer (Bolt)</td><td>Cell Signaling Technology, Danvers, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>NW04120</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>IB23002</td><td></td></tr><tr><td>化学発光HRP抗体検出試薬 HyGLO</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA</td><td>E2400</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ 17 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ 38.5 mL</td><td>Beckman Coulter, Pasadena, CA</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Corning SFCA シリンジフィルター 0.2 &micro;m pore</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>09-754-13</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg,</td> <td>Germany-Ultracentrifuge</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Beckman Coulter, Pasadena,</td> <td>CA-Nanosight</td><td></td></tr> <tr><td>(NS300)</td><td>Malvern, Worcestershire, UK-</td><td></td><td>粒度分布を測定するため粒子濃度</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 フローサイトメーター</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,</td> <td>Germany-iBlot</td><td></td></tr> <tr><td>Transfer Apparatus</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ChemiDoc MP Imaging System</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v. 10</td><td></td><td></td><td>解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

細胞小胞 (Ev) は、通知機能を生理学的および病理学的状態の間に多くの生物学的に重要な役割を果たす新たに発見された細胞レベル下のコンポーネントです。EVs の分離は、各テクニックに固有の制限のため、この分野で主要な挑戦を続けています。密度勾配遠心法で差動遠心は一般的に使用されるアプローチと EV 分離のゴールド スタンダード プロシージャと見なされます。ただし、この手順は、時間のかかる、労働集約的で、一般的に気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルが適さない場合があります低レベルの拡張性の結果します。限外ろ過遠心分離法は簡単な時間と労働効率の良い高回収率と純度をまだ提供して示す.この分離方法は特に少量試料のための EV 分離に適している方法でされる可能性を提案します。

マウス BALF から EV 分離を行った同じ日に UFC と UC DGC の分離方法を使用して。UFC メソッドは、UC DGC テクニック必要な処理時間の 8 時間に対し、約 2.5-3 h を必要しました。これはバッファーと試薬の準備時間を含んでいませんでした。遠心分離の長い期間の間にいくつか他のタスクを実行できる可能性がありますをそれに留意されたいです。それにもかかわらず、全体の手順は、ほぼ UC DGC 分離技術の全体の日続いた。
UFC 法による分離された通常のマウスからの EVs の BALF の派生には、小さいサイズと UC DGC EVs (176.7 ± 7.8 nM、図 1 b) と比較して、均一サイズ分布 (148.8 ± 1.1 nM、図 1 a) が表示されます。UFC テクニックあった深遠な 65-fo...

ここでは、2 つ小胞細胞の隔離のプロトコル、遠心限外濾過とマウスの気管支肺胞洗浄液のサンプルから細胞小胞を分離する密度勾配遠心法と遠心をについて説明します。両法によりマウスの気管支肺胞洗浄液由来細胞の小胞は定量化され、特徴付けられます。

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

この方法は、限外濾過遠心分離アプローチを用いて、気管支肺胞溶岩液由来の気管支肺胞溶岩液の効率、回収収率、純度に関する質問に対処するのに役立ちます。この技術を超遠心化と密度勾配精製技術と直接比較した。この技術の主な利点は、それが簡単で効率的で、マウス気管支肺胞洗浄液などの少量サンプルに適していることです。さらに重要なのは、超遠心分離法に比べて高純度で拡張性が著しく高くなることです。この手順を実証することは、私の研究室の研究員であるノーマン・ギャレット3世です。まず、安楽死させたマウスの気管に22ゲージの血管カテーテルを挿入します。1ミリリットルの氷冷滅菌DPBSでインスリン注射器を取り付け、両方の肺に1ミリリットルを植え付けます。気管支肺胞洗浄液、またはBAL液を取り出すためにゆっくりと注射器プランジャーを引き出します。そして、氷の上の円錐管にBAL流体を分配します。この後、25匹のマウスからBAL液を引き出し、2つの等しいセットに分けます。400倍GでBAL液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を集め、摂氏4度で15,000倍Gで10分間遠心分離します。その後、上清を収集し、すぐにEV分離手順に進みます。まず、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターを通してスーパーナタントをフィルターします。この後、遠心フィルターユニットを滅菌DPBSで10分間平衡化する。その後、遠心単位を摂氏4度で10分間15,000倍Gで遠心分離します。15 ミリリットルの BAL 液でフィルターを充填します。そして、摂氏4度で30分間3,000 Gで遠心分離します。この後、14ミリリットルの無菌DPBSでリテン酸を軽くピペット処理して繰り返し洗浄します。フィルター単位を摂氏4度で3,000Gで遠心し、DPBSを取り除き、再狭窄を濃縮する。濃縮BAL流体由来EVを収集するには、フィルターユニットの底部にピペッタを挿入し、側面から横へのスイープ動作を使用してサンプルを引き出します。その後、BAL流体由来EVをアリクォートし、マイナス80°Cで保存します。あるいは、先に、先に取得した上清を超遠心チューブに移す。そして、摂氏4度で30分間10,000 Gで遠心分離します。その後、上清と遠心分離機を収集します。上清を捨て、200マイクロリットルのDPBSでEVペレットを再懸濁します。この後、EV懸濁液を50%イオジキサノール作動溶液の300マイクロリットルと混合する。そして15ミリリットルの超遠心チューブに移す。次に、テキストプロトコルに従ってバッファ溶液を追加して浮力密度勾配を作成し、遠心分離機を100,000 Gで3時間50分間追加します。15%と25%のイオデキサノール分画を収集し、15ミリリットルまでの体積をもたらすためにDPBSでそれらを希釈します。100,000 Gの新しい超遠心チューブと遠心分離機に4°Cで60分間移動します。上清を捨て、50マイクロリットルの無菌DPBSでEVペレットを再中断します。ナノ粒子追跡解析を開始するには、EVサンプルを1ミリリットルのDPBSで希釈します。そして、インスリン注射器にサンプルをロードします。この後、シリンジをシリンジポンプに取り付け、粒子数とサイズを測定します。カメラレベルを 14 に設定し、検出しきい値を 1 に設定します。次に、プレートリーダーを使用して、色分け検出を介してEVサンプル中のタンパク質の量を定量化します。各サンプルから同量のEVタンパク質をブロッティングローディングバッファーと DTT で溶解します。その後、70°Cで10分間加熱します。サンプルをビストリプラスアクリルアミドゲルにロードし、35分間電気泳動を実行します。次に、乾燥移動法を用いてニトロセルロース膜にタンパク質を移す。この後、穏やかな揺れで60分間5%の脱脂ミルクで膜をブロックします。一晩穏やかな揺れで4°CでEV表面タンパク質マーカーに抗体で膜をインキュベートします。膜をHRPリンク抗体で室温で60分間インキュベートして開発します。膜をTBSTバッファーで10分間洗浄します。最後に、イメージングに進む前に、化学発光HRP抗体検出試薬で膜を開発します。フローサイトメトリーを開始するために、49マイクロリットルのPEB染色バッファーでBAL流体由来EVを希釈した。次に、サンプルのそれぞれに3つの抗体を加え、暗闇の中で60分間揺れ動かしてサンプルを摂氏4度でインキュベートします。最後に、40マイクロリットルの膜濾過されたPEB染色バッファーでサンプルを希釈し、フローサイトメトリー分析を行います。このプロトコルでは、EVは、UFCおよびUC-DGC法を用いてマウスBAL流体から分離した。BAL流体は、UFC法によって単離された正常マウス由来のEVを導出し、UC-DGC-EVよりも小さいサイズおよびより均一なサイズ分布を示した。また、UFC技術は、UC-DGC技術と比較して、総粒子数が有意に高い。UFC-EVのミリグラムで測定された総タンパク質回収率もUC-DGC-EVのそれよりも高く、UFC技術がより時間と労力の効率的であることを示しています。最後に、BAL流体由来EVもフローサイトメトリーを介してさらに特徴付けられていた。UFC-EVとUC-DGC-EVは、いずれもCD63、CD9、CD81を表現した。この手順を試みている間、DPBSで限外濾過ユニット膜を水分補給することを忘れないでください。膜が水和したら、単位は使用されるまで常に濡れておく必要があります。フィルターユニットから細胞外小胞リテン酸を取り出すことは困難です。フィルターユニットからEVの大部分を回復するために、ピペットチップが左右にスイープされていることを確認してください。その開発後、この技術は、細胞外小胞の分離の分野の研究者が、小動物の正常または病理学的状態の両方で気管支肺胞溶岩由来の細胞外小胞の生物学的機能を探求する道を開いた。

isolation-extracellular-vesicles-from-murine-bronchoalveolar-lavage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Separation and Enrichment of Extracellular Vesicles in the Presence of Virions

これは、肝臓から組織外細胞小胞(EV)を分離するためのプロトコルです。このプロトコルは、コラゲナーゼ灌流を含む2段階のプロセスを記述し、その後、肝臓組織EVを分離するための差動超遠心分離を行う。...

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

このプロトコルは、EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉を組み込むことにより、高効率で歩留まりのあるビリオンから離れた細胞外小胞(EV)を分離し、合理化されたワークフローと開始の削減を可能にします。すべてのEV研究で使用するための再現可能な準備をもたらす容積の条件。...

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。...

ヒト間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離するための簡単なベンチトップろ過法

本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により...

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。...

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

この記事では、ヒト血漿由来の細胞外小胞(EV)の単離、特性評価、定量の方法論について説明し、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用した EV...

心血管バイオマーカー探索のための血漿由来細胞外小胞の単離、特性評価、およびプロテオミクス解析

このプロトコルは、高純度のヒト母乳からの細胞外小胞の効果的な単離を促進し、可能にするように設計されています。...

ヒト母乳由来の細胞外小胞の迅速な単離

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サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶ 限外ろ過遠心分離法を用いてマウスの気管支肺胞洗浄液から細胞外小胞を分離する手法。従来の超遠心法と比較して高純度・高回収率を実現し、小容量サンプルに適した効率的なプロトコルです。

限外ろ過遠心分離法を用いたマウスの気管支肺胞洗浄液細胞小胞の分離

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