腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲルを製造
2018年10月13日
ここで腎臓皮質細胞外マトリックス由来ハイドロゲル ネイティブ腎臓の細胞外マトリックス (ECM) 構造および生化学的組成を保持するを作製するためのプロトコルを提案する.作製プロセスとその応用を説明します。最後に、このゲルを使用して腎臓固有の細胞およびティッシュの再生とバイオ エンジニア リングをサポートする視点を説明します。
この方法は、細胞マトリックス相互作用が硫酸塩にどのような影響を与えるかなど、生体材料の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが正確にネイティブ腎臓皮質生化学的マイクロ環境を反映する最初の材料を生成することです.下パッドで組織培養フードを並べてください。
攪拌棒、150ミリメートルの滅菌組織培養皿、および腎臓全体を含む1リットルのビーカーをフードに入れます。ビーカーに500ミリリットルの1%SDS溶液を充填します。無菌組織培養皿に腎臓を入れます。
頭皮で腎カプセルの周りを軽く剃ることによって、すべての周皮脂肪を除去します。次いで、腎臓の上端を横切って浅い8〜10センチメートルの切開を行い、下皮組織を損傷することなく腎カプセルを開き破る。皮質組織から剥がして腎カプセルを取り除くために2つの止止めクランプを使用してください。
腎臓の側面に沿ってメスを使用して、コロナ平面に沿って腎臓を二分する。メスで髄質領域を切り開くことによって、両方の半分から皮質組織を分離する。その後、皮質組織を0.5センチメートルの立方体にサイコロし、大きな目に見える血管を取り除きます。
腎臓から細胞外マトリックスを分離するには、SDS溶液を含むビーカーにダイシング皮質組織を入れる。ビーカーをオートクレーブアルミニウムホイルで覆い、ティッシュ培養フードの外側の約400 RPMの攪拌板に置きます。24時間撹拌した後、ビーカーを組織培養フードに入れます。
ナイロンメッシュで作られた40ミクロンの無菌電池ストレーナーを追加します。そして、別の1000ミリリットルビーカーに200ミリリットルの漂白剤を充填し、組織培養フードに入れる。SDS溶液を細胞ストレーナーを通して、漂白剤を含むビーカーに処分する。
残りのSDS溶液をパイプアウトし、脱細胞化した組織と細胞ストレーナーだけがビーカーに残るまで。ビーカーに細胞ストレーナーを残し、新鮮なSDS溶液の500ミリリットルを追加します。ビーカーを同じアルミホイルで覆い、以前と同じ速度で攪拌板に置きます。
脱細胞化および洗浄後、この時点から腎臓ECMと呼ばれる脱細胞化組織を30ミリリットルの自立型円錐形チューブに移す。そして、すべての組織が水没するまで、細胞培養グレードの水でそれを満たす。まず、組織ホモジナイザーを使用して、視錐状のチューブ内の腎臓ECMを2分間均質化し、ECMの目に見えない部分を有する不透明な溶液が得られるまで使用する。
次いで、腎臓ECMを含む円錐形のチューブを液体窒素に沈め、チューブ周囲の沸騰が持続しなくなるまで沈下する。腎臓ECMをマイナス4度で一晩保管してください。凍結した脱細胞化組織を凍結乾燥するには、円錐形のチューブキャップを少し緩めてガス交換を可能にし、チューブを凍結乾燥機に入れる。
腎臓ECMを3日間、または細かい白い粉末に似るまで凍結乾燥します。ゲルを化学的に消化して可溶化するには、慎重に計量したブタ胃ペプシンを加え、0.01通常の塩酸を攪拌棒を含むシンチレーション下品に加えます。すべてのペプシンが溶解するまで、約500 RPMで攪拌します。
次いで、凍結乾燥した腎臓ECMをシンチレーション下品に移し、約500RPMの攪拌板に溶液を残して、ストック腎臓ECMヒドロゲルを作る。組織培養フードにおいて、細胞培養培地の必要量を、通常の水酸化ナトリウムおよびM199サプリメントに、無菌30ミリリットル自立型円錐形チューブにピペトする。中和試薬溶液をマイクロヘラと混ぜます。
滅菌1ミリリットルシリンジを使用して、適切な量のストック腎臓ECMヒドロゲルを中和試薬溶液に移します。マイクロスパチュラを用いて、均質な色になるまで溶液を穏やかに混合し、ヒドロゲル溶液が得られる。ゆっくりとやさしくかき混ぜて気泡を導入しないようにしてください。
腎臓ECMヒドロゲルに細胞を組み込むために、各ヒドロゲルに対して10マイクロリットルの培地で30万個の細胞を再懸濁する。最終的な腎臓ECMゲルに細胞懸濁液の10マイクロリットルをピレット。細胞が均等に分配されるまで、マイクロヘラで溶液をかき混ぜます。
腎臓ECMヒドロゲルで所望の細胞培養装置を充填するために1ミリリットルのシリンジを使用してください。細胞培養装置の腎臓ECMに細胞を移すかめっきする前に、ゲルを摂氏37度に1時間セットします。質量分析による脱細胞化皮質組織の分析は、バジル層に関連するタンパク質の存在を明らかにし、コラーゲンIVおよびコラーゲン-Iが最も高く表現されている。
コラーゲンIV、A1およびA2鎖は、全ての原膜において遍在し、保存された。コラーゲンIV、A3およびA5鎖は、糸球体の地下膜にのみ存在し、また検出された。ラミニンとコラーゲン-Iの一般的なアイソ形態も検出された。
ヒト腎臓内膜細血管内皮細胞、またはHKMICは、コラーゲン-I上で培養し、腎臓ECM、および1:1混合物ゲルを、表現型の違いを示した。コラーゲンI上で培養したHKMICは、均一なCD31発現を示し、赤色で見た。HKMICは腎臓ECMを含む2つのゲル上で培養する一方で、不均一な分布でCD31発現を減少させた。
行列タイプは、緑で示されたVWF式に影響を与えるようには見えませんでした。この手順を試みている間、脱細胞化された腎臓皮質組織を完全に均質化することを覚えておくことが重要です。さらに、ゲルを中和試薬と混合する場合は、気泡の導入を避ける。
マイクロ生理学的システムは制御された実験室の設定の器官機能の研究を可能にする。このようなシステムの作成には、細胞、マトリックス、および刺激の実装が必要です。ここで製造されたkECMヒドロゲルは、腎臓マイクロ環境を再現するようなシステムを研究することを可能にする。
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概要
この記事では、腎臓コルテックス細胞外マトリックス由来のハイドロゲルを作成するためのプロトコルを提示します。このハイドロゲルは腎臓ECMのネイティブな構造的および生化学的組成を保持します。プロセスとその応用について説明し、腎臓特異的な細胞および組織再生をサポートする潜在性についても見解を示します。
主要な研究要素
科学の分野
- バイオマテリアル
- 細胞外マトリックス工学
- 組織再生
背景
- 生医学応用におけるネイティブ組織環境の模倣の重要性。
- 腎臓の生化学的微小環境を正確に反映する材料の作成における課題。
- 腎臓組織工学における従来の方法とその限界。
- 細胞挙動と組織再生における細胞外マトリックスの役割。
研究目的
- ネイティブな腎臓コルテックスを正確に反映するハイドロゲルを作成すること。
- このハイドロゲルの腎臓特異的応用における意味を探ること。
- 分野の研究者のための詳細なプロトコルを提供すること。
使用した方法
- 特定のプロトコルを使用したハイドロゲルの製造。
- 腎臓組織の処理に1%SDS溶液の使用。
- 組織培養フード内での無菌技術の実装。
- ハイドロゲルの構造的および生化学的特性の評価。
主要な結果
- ハイドロゲルはネイティブなECM組成を正確に保持することに成功しました。
- 腎臓細胞および組織再生をサポートする潜在性を示しました。
- 腎臓環境における細胞-マトリックス相互作用についての洞察を提供しました。
- 研究応用においてこのハイドロゲルを使用する利点を強調しました。
結論
- 開発されたハイドロゲルは腎臓研究のためのバイオマテリアルにおける重要な進歩を表しています。
- 腎臓再生とバイオエンジニアリングの研究に新しい道を開きます。
- 将来の応用は腎臓疾患の治療戦略を強化する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate replication of native extracellular matrix microenvironments is critical for de-risking kidney-targeted therapeutic hypotheses in preclinical discovery. This hydrogel enables physiological modeling of cell-matrix interactions, supporting target validation and mechanistic insight in renal pathophysiology. Its tunable composition allows simulation of diseased states, improving predictive confidence in lead identification pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by preserving native kidney cortex ECM protein ratios and ligand composition.
- Operational Value: Enables functional target validation through physiological substrate presentation to kidney-derived cells.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by modeling disease-relevant microenvironments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with preserved biochemical cues for downstream compound evaluation.
- Operational Value: Standardizes hydrogel preparation via reproducible decellularization and solubilization workflows.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and scalability for renal-targeted assay platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance through manipulation of hydrogel composition to model pathological kidney environments.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation using kidney cortex-derived cells.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in ECM-dependent pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a disease-relevant system for hypothesis testing and biological de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via native-like ECM presentation to renal cells.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible gelation to physiological mechanical stiffnesses.
- Analytics: Facilitates quantitative dependent variable measurements such as CD31 expression distribution and VWF stability.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling diseased kidney microenvironments for target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for renal biomaterials screening across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in kidney ECM interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of hydrogel fabrication and cell encapsulation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in renal programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on physiological response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterials preparation, decellularization, and sterile tissue culture techniques.
- Dependent on access to homogenization, lyophilization, and pepsin-based solubilization instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel preparation and neutralization protocols.
- Adaptation considerations include scaling for different renal cell types and disease modeling conditions.
- Practical limitations include the need for complete homogenization to avoid heterogeneous gelation and air bubble formation during mixing.
