Name: 高純度にアポトーシス小体の検出と分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 学ぶアポトーシス小体の高純度検出と分離法。フローサイトメトリーと差動遠心分離を用いて、アポトーシス誘導細胞から小体を検出・定量化・単離する手法を解説。細胞生物学研究に有用です。

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I.K.H.P. に国立保健医学研究評議会 (GNT1125033 ・ GNT1140187) とオーストラリアの研究評議会 (DP170103790) からの助成金によって支えられた仕事

1. アポトーシスの誘導
<ol><li>5 分間 300 x g でセルのサンプルを遠心し、任意の既存の細胞の残骸を削除する上澄みを廃棄します。 注: 付着性のセルを使用して、事前に細胞を播くし、アポトーシス誘導前にリン酸緩衝液 (PBS) × 1 で洗います。</li>
	<li>セルの数を決定し、細胞を収集します。 注: 測定後分離に応じてお勧めします少なくとも 1 x 10 の開始セル番号7セル。</li>
	<li>1 x 106セル/mL の最終的な集中の完全なメディア (50 μ G/ml ストレプトマイシンの混合物、50 IU/mL ペニシリン (巻/巻) 10% 牛胎児血清を含むそれぞれの媒体) に再懸濁します。</li>
	<li>分注 ~ 6 ウェル プレートのウェルあたり 10 の6セル × 2。</li>
	<li>アポトーシスを誘導して、板蓋を取り外して 150 mJ/cm2の紫外線照射器を使用して細胞を照射します。これは、約 30-60 秒を取る必要があります。 注: 照射前に '非導入' セル コントロール ~0.5 x 106セルが保存されることを確認します。 注: 抗 Fas または血清飢餓6など他の方法を介してアポトーシスを誘導もことができます。</li>
	<li>37 ° c、5% CO2セル行に応じて、2-8 時間孵化させなさい。</li>
	<li>ベンチ トップ光学顕微鏡を使用して、ブレブ、apoptopodia と ApoBD 層などのアポトーシスの形態の存在を確認する細胞を可視化します。 注: 40 倍の倍率は、十分です</li>
	<li>P1000 ピペットを使用して、ピペットし、アポトーシスのサンプルを収集します。</li>
	<li>1x PBS で洗浄して最大収量を確保するため残りのサンプルと組み合わせます。</li>
	<li>収集 ~1/10th '全体アポトーシス サンプル' (WAS) を制御します。</li>
	<li>「未処理」サンプルを収集します。</li>
	<li>6 分間 3,000 x g で WAS と非導入の両方のサンプルを遠心します。</li>
	<li>1 mL の 1x PBS に再懸濁します、氷の脇します。</li>
	<li>ApoBD 分離、ステップ 2 または残りのアポトーシス サンプル 3 のいずれかに進みます。</li>
</ol>2 FACS による ApoBD 分離
<ol><li>6 分間 3,000 x g で全体のサンプルを遠心します。</li>
	<li>ペレットを中断させることがなく上澄みの大半を削除します。</li>
	<li>A5-FITC の 75 μ L と 1 x 10 の7セルあたり 2 μ L に PRO 3 の 1 の x A5 結合バッファーの 1 つの mL を含む染色液で再懸濁します。</li>
	<li>10 分間室温で暗闇の中でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>1 x A5 結合バッファーの 1-2 の mL を追加し、余分な汚れを削除する 6 分間 3,000 x g でサンプルを遠心分離します。 注: 混合細胞または組織サンプルは、1 x A5 結合バッファーで細胞型-特異的マーカーの組み合わせを使用して、ステップを汚す抗体を実行し、6 3,000 × g で遠心分離前に氷上 20 分 (または製造元のプロトコルに従って) 孵化させなさい分。</li>
	<li>3 mL の FACS バッファーでサンプル ペレットを再懸濁します (1 × PBS、1 x A5 結合バッファー 10 %fsc、2 ミリメートルの EDTA) 1 x 10 の7セルあたり。</li>
	<li>丸底、ポリプロピレン (フローサイトメトリー) 管に 70 μ m セル ストレーナー フィルターし、暗闇の中、氷の上のサンプルを保ちます。</li>
	<li>FACS マシンをオンにし、100 μ m ノズルを使用して標準的なセットを実行、ドロップ遅延実行、安定したストリームを確保します。</li>
	<li>サンプルをロードし、集録速度を 〜 1000 イベント/秒に設定します。</li>
	<li>FSC、SSC、APC (に-プロ-3)、FITC (A5) 電圧を調整し、集団を明確に分離することができますように FACS プロット内のイベントの位置します。</li>
	<li>20,000 イベントを記録します。</li>
	<li>パート 4 のようにゲート戦略を設定します。</li>
	<li>並べ替えレイアウト目的の並べ替えの人口として最後の ApoBD ゲートを追加します。</li>
	<li>サンプルを集録を開始し、〜 250 μ L FACS バッファーを含む新しいチューブに 5,000-10,000 の ApoBDs を集めることによってテストの並べ替えを実行します。</li>
	<li>バック フラッシュ システムを実行し、並べ替えられた ApoBDs をロードします。</li>
	<li>取得し、テストの一種 ApoBDs を記録します。</li>
	<li>ApoBD 純度が FSC (y 軸) vs A5 を比較することにより 〜 99% をあることを確認 (x 軸イベント)。 注: が A5 染色再レーザー漂白のためのサンプルを分析する際にわずかに減らすことができます。</li>
	<li>高純度を達成すると、一度元のサンプルをロードし、ApoBDs の希望の番号を取得するまでの並べ替えを続行します。 注: 必要に応じて、デュアル並べ替え実行できます ApoCells と ApoBDs を同時に分離します。 注意: ソートは長い期間にわたって、お勧め 4 ° C でコレクションの管をインキュベート</li>
	<li>並べ替えが完了したら、ApoCells、非導入と WAS アポトーシスを検証し、並べ替え後の純度を確認後並べ替え並べ替え後 ApoBDs の小さな部分を収集します。 注: テストの並べ替え、並べ替え後の純度が大きく違いはありませんが、これはストリームの設定と安定性に基づいています。</li>
</ol>3 差動遠心分離による ApoBD 分離
<ol><li>10 分間 300 x g で残りのアポトーシスのサンプルを遠心します。</li>
	<li>細胞ペレットを中断することを避けるために 〜 500 μ L を残して上清を収集し、新しい 15 mL の円錐管に追加します。</li>
	<li>残り 500 μ L を削除し、2 mL の 1x PBS (これは 'ApoCell 濃縮率' を表しますで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>3,000 gで 20 分間収集した上清を遠心します。</li>
	<li>ペレットを確認し、(小さな細胞の小胞エクソソーム機構の解明研究などを含む上清) 上清を慎重に取り外します。</li>
	<li>1 mL の 1x PBS (これは 'ApoBD 濃縮' 分数を表します) でペレットを再懸濁します</li>
	<li>各実行可能な ApoCell 濃縮 WAS 新しい丸底、ポリスチレン (フローサイトメトリー) チューブの ApoBD 濃縮試料 100 μ L を収集します。</li>
	<li>2 x A5 結合バッファー、1: 100、A5 FITC や縮尺に PRO 3 を含む汚れの 100 μ L を追加します。</li>
	<li>暗闇の中で 10 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>成功したアポトーシス誘導と ApoBD 濃縮率の純度検証上記ゲートの戦略を使用して、フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリー戦略をゲート
<ol><li>プロットに-プロ-3 (y 軸) に対して FSC (x 軸) すべての他の非グリセリン イベント (に-プロ-3低/中級) から壊死細胞 (に-プロ-3高) を分離します。</li>
	<li>グリセリン以外のすべてのイベントを選択し、A5 から SSC をプロットします。ゲート 1 (P1)、SSC中級/高A5低/中間細胞の人口と人口 2 (P2)、他のすべてのイベントを含む 2 つの集団。</li>
	<li>P2 に-プロ-3 A5 に対してプロットし、すべて細胞の残骸を除外する A5中級/高イベントを選択します。</li>
	<li>A5 のすべての肯定的なイベントを選択し、A5 に対して FSC をプロットします。ApoCells (FSC中級/高) から ApoBDs (FSC低) を分離します。 注: ApoBDs FACS に基づくアプローチによる ApoBD 分離のため、ゲートお勧めします最後のステップを ApoBDs に-プロ-3 A5 に比較してすべてのイベントを選択して。これにより、最終的な並べ替えゲートが FSC/SSC パラメーターではなく蛍光を使用すること。</li>
	<li>生細胞分析の P1 を選択し、ゲートの 2 つの方法のいずれかを実行します。一般生菌分析 A5 に対して FSC をプロットし、従って残りの細胞の残骸の取り外し、FSC中級/高のすべてのセルを選択します。また、詳細な分析を実行可能なセルから分離できる A5-に-プロ-3 に対して FSC をプロットすることによって初期の ApoCells。FSC中級/高実行可能なセルを選択する-プロ-3低にプロ 3中間FSC中級/高A5-初期の ApoCells。</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+the+Dying%3A+Mechanisms+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li>
<li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%3A+An+International+Journal+on+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li>
<li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li>
<li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439(2015).</li>
<li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+link+between+an+antibiotic%2C+pannexin+channels+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li>
<li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li>
<li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+over+troubled+water%3A+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li>
<li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li>
<li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81(2009).</li>
<li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li>
<li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li>
<li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
<li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

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1950 年代の初期、説明文からアポトーシスのフィールドは著しく、進んでいる、著名な研究領域になります。広範な努力および広範な関心にもかかわらず特定の ApoBDs の形成におけるアポトーシスの特定の側面がよく研究されていない適切な方法論の不足のため。特にアポトーシスの進行と同時に従来のフローサイトメトリー A5/PI 解析、ApoBD 分離の不純物を使用して ApoBD 形成を追跡の制限が含まれます。これらの方法論の欠点に対処する方法を最近開発しました。
我々 の新しい流れ cytometry ベース解析的アプローチでは、ApoBDs を検出する従来の分析方法を使用して多くの場合無視され、20を定量化することができます。さらに、この変更したがってアポトーシス進行20の良い描写をレンダリング、流れ cytometry 法、染色に-プロ-3、明らかに追加の A5 を使って-初期アポトーシスの段階です。従来、ApoBD 検出が重く頼った共焦点顕微鏡と組織などのイメージ ...

アポトーシス、プログラム細胞死のよく研究フォームは、生理的恒常性を維持し、人体1内で潜在的有害な細胞を除去する必要があります。アポトーシスの誘導後、アポトーシス細胞 (ApoCells) は一連の形態学的変化を受けるし、ApoBDs と呼ばれる小さな膜小胞に分解できます。全体的にみて、このプロセスはアポトーシス細胞分解として知られている、形態2,3に基づいて 3 段階に分けることができます。ステップ 1 (膜ブレブ) は、鉱物4,5として知られている細胞の表面に風船のような構造の形成によって特徴付けられます。ステップ 2 (アポトーシス突起形成) には、apoptopodia、apoptopodia ビーズと微小管結合スパイク6,7,8などの長い膜突起部の形成が含まれています。最後に、ステップ 3 (ApoBD 編成) にはアポトーシス突起および/または ApoBDs6,9を生成する ApoCells の断片化が含まれています。前の調査結果は、アポトーシス細胞のクリアランスを支援し、細胞間のコミュニケーションを仲介することで ApoBDs の役割を示唆しています。たとえば、ApoBDs に、ApoCell の断片化が小さい '' 作品を一口食2,10,11を囲むことによって簡単に削除することができますを生成可能性があります提案します。さらに、ApoBDs は、DNA、RNA および蛋白質は、細胞間コミュニケーション12,13,14を容易にする周囲の細胞に取り引きされる可能性がありますなどの生体分子のシリーズを抱く可能性があります。これらのプロセスを調べる機能的、アポトーシス誘導および ApoBD の形成の検証 (i)、ApoBDs の分離 (ii) と (iii) ApoBD 純度の確認を含む 3 つの重要なパラメーターを確認する重要です。
以前は、アポトーシスと ApoBDs15,16,17,18の勉強をフローサイトメトリーと電子顕微鏡を含むメソッドの数が使用されています。しかし、ApoBD の検出と定量、しばしば困難または見落とさ。例えば、最も日常的に使用される流れのフローサイトメトリーによるアポトーシス アッセイ アネキシン V を採用 (A5、外部結合タンパク質 'を食べる-私' 信号ホスファチジルセリン (PtdSer)) 核酸染色 propidium ヨウ化 (PI)19。しかし、この普遍的な染色の組み合わせを使用して、解析では、のみ 3 種類のサンプルで (実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞) 細胞のサブセットがあること想定しています。さらに、cytometry 流れの試金の apoptosis のため多くの研究者によって「ゴールド スタンダード」として考慮される、しかし、以降のデータ解析はしばしば FSC/SSC中間高イベントの選択最初のゲーティング ステップを通じて ApoBDs を除外します。したがって、A5 とする PRO 3 を使用して新規流れ cytometry 試金を最近開発した、7、20チャンネルは別の核酸染色カスパーゼ 3/7 活性化パネキシン 1 (PANX1) によって選択的に取ることができます。カスパーゼ 3 による PANX1 活性化はアポトーシスの早い段階での PtdSer 露出を前に、ようにプロ 3 は特異的アポトーシスとネクローシス細胞を汚れ。このアプローチ戦略をゲートの小説と組み合わせてさらに、データ分析中に取得しているすべてのイベントが含まれています、6 セル/パーティクルのサブセットの識別結果としてを含む: (i) 実行可能なセル (FSC/SSC中級/高、A5低にプロ 3低)、(ii) A5-初期の ApoCells (FSC/SSC中級/高A5低、中間にプロ 3)、(iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC中級/高、A5高にプロ 3 の中間)、(iv) 壊死細胞または後期 ApoCells (FSC/SSC中級/高A5高にプロ 3高)、(v) ApoBDs (FSC/SSC低、A5中間に-プロ-3低中間/)、および (vi) 破片 (FSC/SSC低A5低、低にプロ 3)20。我々 のアプローチでは、すべてのセル/パーティクルのサブセットと、もっと重要なは、細胞および破片20からの ApoBDs の分離分析の重要性を強調しています。したがって、このアプローチは、アポトーシスおよび ApoBD の形成の誘導を同時に検証する効率的な方法を示します。
伝統的に、ApoBDs は、さまざまな細胞や密度に基づく他の細胞小胞から ApoBDs を分離できるという差動遠心分離アプローチを通じて分離されています。しかし、このようなの遠心分離法はしばしば低 ApoBD 純度、定量ステップ サンプル純度および/または細胞型特異 ApoBDs17,21,22を分離することができないことを確認するための不足によって制限されます。そこで、最近 2 つのアプローチ、FACS に基づいた新しい差動遠心分離に基づくアプローチをアポトーシスとサンプルの純度のための23の誘導を検証する私たち以前に確立された流れフローサイトメトリー法と結合することができますを開発しました。FACS 手法による ApoBD 分離を最大 99% 純度 ApoBDs を豊かにすることができます、さまざまな混合細胞集団、組織サンプルと体液23から ApoBDs を分離する細胞型特異抗体と組み合わせて利用できます。さらに、我々 の改訂された差動遠心分離アプローチを示しますに ApoBDs を分離するための効率的な方法 > 90% 純度23。
本稿で我々 はアポトーシス誘導を検証し検出し、定量化の ApoBD 形成私たちの実験の詳細について説明します。FACS ベースおよび差動遠心分離ベースのメソッドを使用して ApoBD 分離ワークフローはまた詳述し、比較しました。代表的なデータ記述の方法論では、将来の ApoBD 研究の効果的な最先端のツールをデモンストレーションします。

<table><tbody><tr><td>細胞、例えば培養ヒトTHP-1単球(クローン番号:TIB-202)</td><td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン混合物</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD</td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3<td></td></tr>ヨ<tr><td>ウ化物</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3は、皮膚、目、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。直接の接触は避けてください。</td></tr><tr><td>10x アネキシン V 結合バッファー</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター (37 °C;C、5%CO2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA IIIフローサイトメーター、FITCおよびAPC検出用の2つのレーザーで構成</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II FITCおよびAPC検出用の2つのレーザーで構成</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1ソフトウェア</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 8.8.6ソフトウェア</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;UVストラタリンカー1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

アポトーシス小体 (ApoBDs) 機構の解明、エクソソーム細胞小胞族最大の型の一つである ApoBDs の主要メンバーであります。ApoBDs が細胞除去として人身売買生体分子を介して細胞間のコミュニケーションを助けることができることが提案されています。使用の識別と ApoBDs の分離従来多くの場合、正確な定量化と低いサンプル純度の欠如によって制限されます。ここでは、アポトーシスの誘導の確認、ApoBD 形成を検証および ApoBDs を高純度に分離するワークフローについて述べる。またアウトライン、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと ApoBDs を分離に基づく差動遠心分離アプローチを比較します。使用して孤立した ApoBDs の純度を確認、さらに、以前の流れ cytometry による染色と分析法を確立します。まとめると、記述されているアプローチを使用して THP 1 単球のアポトーシスとアポトーシス細胞の分解は誘発され、検証と THP 1 球から生成された ApoBD は 97-99% の純度に分離されました。

ここで説明する手順を使用して、THP 1 単球のアポトーシスが誘導されたと ApoBDs が検出および FACS ベースまたは差動遠心分離アプローチ (図 1) のどちらか経由で分離されました。まず、紫外線照射によるアポトーシス誘導し、細胞アポトーシスの形態、ブレブ、アポトーシス膜突出部形成 ApoBDs6の生成などを展示したとき 2-3 時間後採取しました。プロ 3 と A5 ベースのフロー フローサイトメトリー法は、生菌、壊死細胞、初期 ApoCells、ApoCells、ApoBDs および残骸 (図 2) を分離することによって ApoBD の形成と単球のアポトーシスの誘導を確認する使用されました。フローサイトメトリー解析一緒に取られて、紫外線治療が ~ 20% の結果を示される ApoCells (図 3)。
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検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry または差動遠心分離を使用してワークフローを開発しました。

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

このプロトコルの全体的な目標は、アポトーシス体を高純度で検出し、単離することです。アポトーシス小体は、血腫の誘発を助けるために生成される細胞外小胞の一種です。これらは、通常、直径1〜5マイクロメートルの範囲の細胞外物理ファミリーの最大のタイプです。アポトーシス体が、アポトーシス細胞のクリアランスや細胞内コミュニケーションなどの細胞プロセスを支援できることが明らかになりつつあります。したがって、アポトーシス体を検出、定量、および単離するための正確な方法論の開発は、その機能とメカニズムのパーソナライズにとって重要です。この一連の分析では、アポトーシスサンプルからアポトーシス体を検出、定量、単離する方法をご紹介します。パートA、アポトーシスの誘導。THB1単球などの細胞株でアポトーシスを誘導するには、まず細胞を採取することから始めます。細胞をカウントし、約1,000万個の細胞を採取するか、必要に応じて収集します。アポトーシス体の解析には1,000万個を推奨します。6ウェルプレートのウェルあたり200万個の細胞をアロコート化します。UV Stratalinker 1800を使用して、6ウェルプレートとUVセルから蓋を取り外します。150ミリジュール/センチメートルの二乗で細胞に照射します。この照射には約30〜60秒かかります。照射終了後、細胞株にもよりますが、2時間から8時間細胞をインキュベートします。この時点で、細胞はアポトーシス傷やアポトーシス体形成などのアポトーシス形態を示すはずです。P1000ピペットでアポトーシス細胞を採取します。アポトーシスサンプル全体のコントロールのために、アポトーシスサンプルの約1/10を採取します。また、未処理または生存可能なサンプルも収集します。アポトーシスサンプル全体と未処理サンプルの両方を3, 000gで6分間遠心分離します。PBSで再度吊り下げ、氷の上に置いておきます。アポトーシス体分離については、ステップ B または C.B、FACS を使用したアポトーシス体分離に進みます。残りのアポトーシスサンプルを3, 000gで6分間遠心分離します。残りのアポトーシスサンプルから上清を取り除きます。残りのアポトーシスサンプルをnexum 550およびtopo three染色を含む染色溶液に再度懸濁し、室温で暗所で10分間染色します。遠心分離後、FACSバッファーに再懸濁し、70ミクロンのセルストレーナーでろ過して、細胞が効率的に分離されるようにします。FACSマシンの標準セットアップを実行します。アポトーシスサンプル全体を取得し、電圧設定を変更して、すべてのイベントがFACSボット内にあり、集団を簡単に分離できるようにします。後のフローサイトメトリーゲーティングストラテジーのセクションで説明するように、ゲーティングストラテジーを設定

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

細胞死の評価のための正確な方法が記載されている。プロトコルは、細胞株および動物モデルの広い範囲からの一次細胞は40％、偽陽性のイベントを表示する従来のアネキシンV...

細胞死の正確な評価のために修飾されたアネキシンV /ヨウ化プロピジウムのアポトーシスアッセイ

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

このビデオでは、サンプル中のアポトーシス細胞の存在を検出するためにTUNELアッセイを行っています。この研究では、特殊なDNAポリメラーゼ(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ)を使用して、断片化されたDNAの3'末端に標識されたdUTPの付加を触媒し、蛍光顕微鏡で観察および同定できます。...

Terminal Transferase-Mediated dUTP Nick End-Labeling—TUNEL Assay: アポトーシス細胞におけるDNA断片化を検出するためのIn Situ法

このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用してアポトーシス細胞のクリアランスを研究するエフェロサイトーシスアッセイを実演します。エフェロサイトーシスは、アポトーシス細胞が食細胞に飲み込まれ、エフェロソームと呼ばれる小胞内で分解される多段階のプロセスです。このプロトコルは、個々のアポトーシス細胞の内在化部分と非内在化部分を視覚化し、エフェロサイトーシスを定量化する方法を提供します。...

Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。...

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

ここでは、隣接する死細胞または死にかけている細胞との物理的相互作用によって生存細胞に誘発される細胞内シグナル伝達イベントを決定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、死細胞の食作用取り込みまたは可溶性メディエーターの放出とは対照的に、死細胞の受容体媒介認識によって誘発されるシグナル伝達イベントに焦点を当てています。...

隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

ここでは、蛍光活性化細胞ソーティングによってアポトーシス乳癌細胞を分離し、さらにフローサイトメトリーによるアポトーシス反転後乳癌幹細胞のような細胞非幹乳ガン細胞の転移を検出するためのプロトコルを提案する.

アポトーシス反転後新しく形成された乳癌幹細胞様細胞の流れフローサイトメトリー法による検出

ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis...

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

アポトーシスは、初期および後期のアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー分析によって特徴付けることができます。子宮頸がん細胞株SiHaを、卓上フローサイトメーターを用いてアクチノマイシンDで処理した後のアポトーシスバイオマーカーについて分析した。...

アクチノマイシンD処理SiHa子宮頸癌細胞におけるアポトーシスバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

学ぶアポトーシス小体の高純度検出と分離法。フローサイトメトリーと差動遠心分離を用いて、アポトーシス誘導細胞から小体を検出・定量化・単離する手法を解説。細胞生物学研究に有用です。

高純度にアポトーシス小体の検出と分離

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