ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化
November 6th, 2018
いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光 (WMIF)。
ノードと脊索プレートは、マウス胚発生時に不可欠なオーガナイザーです。今日、我々は、これらの構造を可視化し、研究するために、発達生物学者によって使用される2つの技術を説明する。第1のプロトコルでは、走査型電気顕微鏡、SEM、第2のマウント免疫蛍光全体の方法を示します。
ノードと脊索板は、胚の日E7.75で胚の表面に一時的に存在し、強調小さな繊毛が外部に投影され、SEMによる同定と視覚化が可能になる。どちらのプロトコルでも、比較的小さなマウス胚を処理する上で重要なステップを示し、それらを転送してルーティングする方法に焦点を当てます。まず、安楽死させた妊娠マウスの腹部を皮膚と腸間腸を通して開く。
はさみと細かい鉗子を使って、子宮を取り除きます。蒸留水で子宮を短時間洗い流し、PBSを含む小さなシャーレに入れます。その後、解剖顕微鏡と細かい鉗子を使用して子宮筋を取り除き、個々のデシドゥイを解放する。
解剖顕微鏡の下で、各デシドゥアを鉗子で保持し、別のペアを使用して、赤い部分と白い部分の間に縦方向の完全な厚さの切開を行います。デシドゥアの白い部分に沿って垂直に表面的なパーホレーションを行い、切開に隣接します。次に、デシドゥアを水平に2つの半分に引き離し、デシドゥアの白い部分から慎重に胚を取り除きます。
この後、胚を滅菌濾過PBSを含む新しいシャーレに移す。各胚から、外胎盤コーンから始まるReichertの膜を取り除きます。将来のジェノタイピングのために、黄身嚢の小片を取り除きます。
化学フードの下で、2.5%グルタルアルデヒドと無菌濾過PBSで構成されるEMグレードの固定を含むマイクロ遠心分離チューブに胚を移します。この後、胚を邪魔することなくチューブから固定を取り除きます。胚を無菌で3回洗浄し、室温で15分間PBSを濾過した。
胚をエタノール系列でそれぞれ5分間脱水し、50%70%および85%エタノールをPBSで希釈した。100%エタノールで3回洗浄する。胚を摂氏20度で100%エタノールに保存するか、次のステップに進みます。
その後、適切な容器にエンブロヨを移し、残った液体を取り除きます。HMDSとエタノールを胚に対して1対1の割合で30分間加えます。その後、液体を取り出し、30分間純粋なHMDSを加えます。
ピペットで胚から液体を取り出し、30分間乾燥させます。小さなブラシと両面テープを使用して、腹側を上にして乾燥した胚をSEMスタブに取り付けます。金粒子コーティング用のスパッタコーティングマシンにスタブを挿入します。
SEM粒子の中で最も繊細なステップの1つは、胚をスタブに正しい向きに取り付けることです。胚がテープに着陸すると、向きはもはや変更できません。この後、コーティングされたスタブをSEM顕微鏡に入れ、真空を適用し、繊毛で胚節および脊索板細胞を観察する。
E7.75で胚を取り除いた後、氷の上のシャーレでPBSトゥイーンに入れます。化学フードの下で、固定溶液を含むマイクロ遠心分離管に胚を移す。この後、胚に触れないように気をつけて、チューブから固定剤を取り出します。
次いで、0.2%トリトンX-100を含むPBSで、エナチングシェーカーで室温で5分間、胚を3回洗浄する。胚から最後の洗浄を取り除き、PBSトリトンを含むブロッキング溶液を10%熱不活化血清で追加します。摂氏4度のヌテレーターで少なくとも2時間胚をブロックする。
次に、ブロッキングを除去し、ブロッキング溶液中で希釈した一次抗体の約1ミリリットルを添加する。胚を摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートする。一次抗体を取り除き、後で使用するために保存します。
次に、PBSトリトンで胚を2回リンスします。そして、ヌテットターで30分間3回洗います。洗浄を、一次抗体宿主種に対する希釈された蛍光結合二次抗体と交換してください。
そして、摂氏4度のヌテーターで一晩インキュベートします。次いで、二次抗体を除去し、PBSトリトンで胚を2回リンスする。PBSトリトンで30分間3回洗浄する前に。
最後の洗浄を、希釈された蛍光結合ファロイジンと希釈されたDAPIと汚れを室温で1時間含むPBSトリトンに置き換えます。次に、PBSトリトンで胚を2回リンスする。そして、室温で30分間PBSトリトンでそれらを洗います。
この後、PBSトリトンをPBSに置き換え、胚を氷の上に置き換えます。次に、清潔で正に帯電したスライド、カバースリップ、およびグリセロール水溶液ベースの取り付け媒体を準備します。スライド上に2枚の透明テープを15ミリメートル離して置きます。
次いで、解剖顕微鏡の下で、改変されたP200ピペットを使用して、胚をスライドに移動させる。細かい鉗子を使用して、卵黄嚢の側面に2つの完全なカットを行い、胚を展開します。次に、腹側を上にして胚を配置します。
50マイクロリットルの取り付け培地を胚に加えます。次に、取り付け用メディアのダブをカバースリップに追加します。テープの2つの部分にまたがるそれを置き、曲がった針を使用して胚の上にゆっくりとそれを下げます。
吸収性ワイプを使用して、カバースリップを移動しないように、余分な取り付けメディアを取り除きます。次に、カバースリップの側面を密封するためにマニキュアの寛大な量を使用します。最後に、走査型共焦点顕微鏡を用いて胚を観察する。
3Dビジュアライゼーションのためにカバースリップを歪める可能性があるため、胚の上に取り付けた後にカバースリップを移動しないことが重要です。走査型電子顕微鏡を用いて、E7.75で1つの変異型マウス胚を取り除いた野生型およびストリップにおける節点の形成が観察された。野生型のピット状の節とは異なり、突然変異胚は平坦化された通常の節と節状のプレートを示した。
現在、免疫蛍光に対する全体が、細胞レベルでのストリップ1変異胚におけるノードおよび脊索板形成欠陥を研究するために使用された。データは、彼らが異常であり、突然変異胚でスタントされていることを示した。ノードと節皮質プレートは、胚の表面に一時的にしか存在しないため、SEMの成功にはタイミングが不可欠です。
例えば、2~4個のスマイト胚は、長い繊毛を有する成熟した節のSEM分析に適している。純度試薬は、これらの技術の成功のためにも不可欠であり、特に胚に固執する小さな不純物が通常巨大なアーティファクトをもたらすSEMによって超構造を調査する際に不可欠である。
我々は、これら2つの技術が、正常な発達中の節および結節板の構造およびこれらの構造の形成における欠陥を示す変異体に関する補完的な情報を与える、と考えている。
概要
節および脊索板は、マウス胚の発達における重要なシグナル伝達組織です。この記事では、これらの構造を可視化するための2つの技術について詳述しています：走査型電子顕微鏡法（SEM）および全実体免疫蛍光法（WMIF）。
研究の主要構成要素
科学分野
- 発生生物学
- 胚発生学
- 顕微鏡技術
背景
- 節および脊索板は胚発生中の一時的な構造です。
- それらは独特の形態と繊毛の存在によって識別できます。
- それらの発達を理解することは、脊椎動物の胚発生に関する洞察に不可欠です。
- SEMやWMIFなどの技術は、これらの構造を研究するために重要です。
研究目的
- 節および脊索板の可視化のための詳細なプロトコルを提供すること。
- マウス胚におけるそれらの形態形成の理解を深めること。
- 顕微鏡検査のための胚の取り扱いと処理の重要なステップを示すこと。
使用した方法
- 構造の可視化のための走査型電子顕微鏡法（SEM）。
- 細胞および分子分析のための全実体免疫蛍光法（WMIF）。
- 固定および脱水を含む胚の準備技術。
- 免疫蛍光染色のための特定の抗体の使用。
主な結果
- SEMにより、野生型と変異型胚の間で明確な形態学的差異が明らかになりました。
- 節および脊索板上の繊毛の同定ができました。
- WMIFにより、特定の細胞成分の可視化が可能になりました。
- 胚の処理のための重要な取り扱い技術が確立されました。
結論
- 説明された技術は胚の構造を研究するのに効果的です。
- 節と脊索板の理解は発生生物学に貢献します。
- 将来の研究では、これらの方法を基に胚発生のさらなる探索を行うことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Visualizing transient embryonic organizers like the node and notochordal plate supports early target validation in developmental pathways. These structures serve as disease-relevant systems for assessing morphogenetic signaling and ciliopathy mechanisms. The described SEM and WMIF techniques enable mechanistic de-risking by providing quantitative, reproducible readouts of cellular organization and cilia-dependent signaling in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to left-right axis determination and somitogenesis pathways.
- Operational Value: Provides biological de-risking through direct visualization of organizer formation and cilia localization in wild-type and mutant embryos.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization using cilia-dependent phenotypes as quantitative endpoints.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability through standardized embryo handling, fixation, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system continuity from gastrulation mutants to phenotypic screening of ciliopathy-related compounds.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural defects to functional signaling outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of nodal signaling pathways and supports screening readiness through quantitative morphology and fluorescence readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of organizer-dependent morphogenesis in embryonic models.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized visualization of cilia length, density, and orientation as screening-relevant parameters.
- Analytics: Enables quantitative comparison of structural phenotypes through SEM morphometrics and WMIF signal intensity measurements.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human ciliopathies and somitogenesis defects in gastrulation-stage embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating genetic and pharmacological perturbations in developmental signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of transient signaling centers and their cilia-dependent functions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility across laboratories via optimized embryo preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early developmental target engagement.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on organizer integrity and ciliogenesis in preclinical disease models.
Implementation Considerations
- Required expertise in developmental biology and microsurgery for embryo isolation and staging.
- Instrumentation needs include SEM, sputter coater, confocal microscope, and nutating shakers for uniform reagent exchange.
- Cross-team standardization requires consistent embryo staging (E7.5–E7.75), fixation timing, and antibody validation for WMIF.
- Adaptation considerations across model species due to differences in gastrulation timing, organizer morphology, and cilia ultrastructure.
- Practical limitations include embryo fragility, transient nature of the node and notochordal plate, and sensitivity to fixation artifacts impairing cilia visualization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Scanning Electron Microscopy of the Mouse Embryonic Node
4:17
Whole Mount Immunofluorescence of the Mouse Node and Notochordal Plate
8:06
Results: Strip1 Mutant Embryos Display Irregular Nodes and Abnormal F-Actin Organization in the Axial Mesoderm
8:46
Conclusion
